楊妹妹?李瑋?李姜暉?魯曙光?黃鵬

摘要：目的 采用計算機輔助設計試驗，考察影響注射用頭孢西丁鈉有關物質色譜分析方法的主要因素并使目標因子達到最優(yōu)，對注射用頭孢西丁鈉雜質譜分析方法進行優(yōu)化。方法 制備系統(tǒng)適用性混合溶液，確定目標因子。通過Plackett-Burman（PB）設計篩選顯著因素；通過中心組合設計（CCD）設計進行優(yōu)化并確定最佳色譜條件；采用質譜法分析有關物質結構。結果? ? 色譜柱參數(shù)、流動相參數(shù)和梯度程序等因素均對雜質分離分析有較大影響；在建立的最優(yōu)色譜條件下，11個潛在雜質均能得到有效分離并被檢測。雜質譜分析顯示，不同企業(yè)產(chǎn)品雜質譜存在差異。結論 使用計算機輔助設計優(yōu)化色譜分析方法，可實現(xiàn)對潛在雜質的有效分析，為完善注射用頭孢西丁鈉質量標準和質量控制提供了指導。

關鍵詞：頭孢西丁鈉；試驗設計；雜質譜；有關物質；HPLC

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Abstract Objective The computer-aided design experiment was used to investigate the main factors affecting the chromatographic analysis of related substances in cefoxitin sodium for injection and to optimize the objective attributes， and the impurity profile analysis method was optimized. Methods The system suitability solution was prepared， and the objective attributes was determined. The Plackett-Burman （PB） design was used to screen for significant factors， and the Central Composite Design （CCD） design was adopted to determine optimal chromatographic conditions. Mass spectrometry was used to identify the structure of the related substances. Results The column parameters， mobile phases， and the gradient program had great influences on the separation and analysis of impurities. With the optimal chromatographic conditions established， 11 potential impurities were effectively separated and detected. Impurity profiles analysis showed that there were differences in the impurity profiles of samples produced by different enterprises. Conclusion The use of computer-aided design in optimizing chromatographic method can facilitate the effective analysis of potential impurities. The article provided the guidance for cefoxitin sodium for injection standard improvement and quality control of the preparation.

Key words Cefoxitin sodium; Design of experiments; Impurity profiles; Related substances; HPLC

頭孢西丁鈉（cefoxitin sodium）屬于頭霉素類抗生素，母核由四元的β-內(nèi)酰胺環(huán)與六元的氫化噻嗪環(huán)駢合而成。主要用于敏感細菌所致的呼吸道、泌尿道、骨關節(jié)、皮膚軟組織及腹內(nèi)感染等[1-2]。該品種由于制備工藝特殊且自身結構穩(wěn)定性較差，在生產(chǎn)和儲存過程中有關物質容易增加，甚至導致不良反應[3]，因此對其雜質譜的分析和控制顯得尤為重要。

在建立雜質譜分析方法過程中，如何明確藥品中的雜質組成、進而開發(fā)適宜的分析方法是首先需要解決的問題[4]。早期對頭孢西丁鈉有關物質的報道均主要關注于其總量的測定[5-7]，注射用頭孢西丁鈉雖然已被《中國藥典》（ChP）、美國藥典（USP）、歐洲藥典（EP）等收載，但僅EP列出了7個有關物質的結構。近年來，隨著研究的深入，對該品種中潛在雜質的結構確認[8-10]和分離分析的報道[11，12]逐漸增加。然而，目前仍缺少系統(tǒng)性建立頭孢西丁鈉雜質譜色譜分析方法的范例，對影響各雜質分離的主要因素分析也未見報道。本文結合已有的文獻，利用混合系統(tǒng)適用性溶液，以難分離雜質對作為色譜分析的目標因子，通過疏水消除模型篩選適用于分離難分離雜質對的最優(yōu)色譜柱，再利用計算機輔助實驗設計方法，尋找頭孢西丁鈉有關物質分析的最優(yōu)色譜方法，并考察不同企業(yè)樣品雜質譜的差異。在此基礎上，全面總結注射用頭孢西丁鈉有關物質分析的關鍵影響因素，為完善注射用頭孢西丁鈉的質量控制提供指導。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

島津LC-20A液相色譜儀；AB Sciex triple quad 5500 質譜儀； SevenExcellence型pH計；電子天平XP205。試驗用到的色譜柱信息見表1。

注射用頭孢西丁鈉樣品；頭孢西丁雜質對照品：EP雜質B、EP雜質D、EP雜質E、EP雜質F對照品，均由廣州佳途科技股份有限公司提供；3-羥甲基頭孢西丁（EP雜質A）、7-甲氧基頭孢噻吩，均由重慶天地藥業(yè)有限責任公司提供。

乙腈（色譜純）為賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；甲酸銨、磷酸二氫鉀、無水磷酸氫二鈉、磷酸、甲酸和30%過氧化氫，均來自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜方法的篩選與優(yōu)化

以ChP（2020年版）、USP（2021年版）和EP（10.0版）收載的頭孢西丁鈉有關物質分析方法[13-15]作為初始方法。試驗過程為：①比較各色譜方法，篩選色譜條件；②確定目標因子，考察難分離物質對的分離度情況；③考察柱參數(shù)對目標因子的影響，確定影響最大的柱參數(shù)，篩選出合適的色譜柱；④采用Plackett-Burman（PB）設計篩選顯著影響色譜分離的主要因素，剔除不顯著的因素，以減少后期優(yōu)化實驗的次數(shù)；⑤通過單因素實驗確定主要影響因素的優(yōu)化范圍；⑥采用中心組合設計（central composite design，CCD）設計進行響應面優(yōu)化，通過最大化總體期望函數(shù)確定最佳色譜條件；⑦樣品測定。

1.2.2 強制降解溶液的制備

稱取樣品0.125 g置于5 mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋至刻度，作為母液；取1 mL母液置于5 mL容量瓶中，在80℃水浴處理1 h，待冷卻后，用磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，即強制降解溶液1；取1 mL母液置于5 mL容量瓶中，加1 mL 3%H2O2，2 h后加入磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，即強制降解溶液2。

1.2.3 系統(tǒng)適用性溶液的制備

諸頭孢西丁雜質對照品用磷酸緩沖液溶解，分別制成濃度為1 mg/mL的雜質溶液；分別取EP雜質B和3-羥甲基頭孢西丁雜質溶液各50 μL、EP雜質D、EP雜質E、EP雜質F和7-甲氧基頭孢噻吩雜質溶液各100 μL，與強制降解溶液1和2各300 μL混合，得到混合系統(tǒng)適用性溶液。

1.2.4 質譜分析條件

電噴霧離子源（ESI）；正負離子掃描方式，掃描范圍m/z 330～800；氣簾氣壓（CUR） 20 psi；碰撞氣壓（CAD）7 psi；電噴霧電壓（IS） 5500 V；霧化氣壓（GS1）16 pai。

2 結果

2.1 色譜條件初篩與目標因子確定

對不同頭孢西丁鈉有關物質分析方法的篩選結果顯示，USP方法中，主成分保留時間過長，峰形差，且主峰之后無明顯雜質峰；ChP方法中檢測到的雜質數(shù)目有所增加；使用EP方法檢測到的雜質數(shù)目最多，且各色譜峰的理論板數(shù)較高（圖1A）。其中，色譜峰1、2、3、4、5、6、7均為強制破壞后增加的雜質峰，峰6為EP雜質A，峰8為EP雜質D、峰9為EP雜質E、峰10為EP雜質F、峰11為EP雜質B、峰12為7-甲氧基頭孢噻吩。故在此基礎上進行色譜條件的優(yōu)化，該階段的目標因子初步選擇為：難分離物質對峰3和4的分離度（R3/4）；難分離物質對峰8和9的分離度（R8/9）；峰4的理論塔板數(shù)R4N和峰8的理論塔板數(shù)R8N。

2.2 柱參數(shù)對目標因子的影響

由于采用EP規(guī)定的色譜柱試驗結果并不理想，故首先考察色譜柱參數(shù)對目標因子的影響。選取11根不同色譜柱進行分析，試驗結果見表2。

用Snyder等基于疏水消除模型提出的色譜柱參數(shù)表征不同色譜柱的差異[16]，將目標因子與柱參數(shù)進行多元線性回歸，其中C（2.7）由C（2.8）和C（7.0）通過插值法計算得到[17]。方程分別為：

R3/4=54H-109S-12A-15B+15C2.7（1）

R8/9=39H-49S-9A+20B+7C2.7（2）

R4N=341951H-757200S-87834A-252006B+ 31380C2.7（3）

R8N=864088H-1643173S-291179A-337865B-9569C2.7（4）

利用ANOVA對諸線性回歸方程進行分析，P值均小于0.05，即因變量－自變量擬合方程（模型）有意義；采用t檢驗考察色譜柱參數(shù)的影響，所得的P值中，柱參數(shù)H的顯著性均小于0.05，表明疏水性對目標因子的影響最大，提示EP規(guī)定的苯基柱可能并非最佳色譜柱類型。選擇對諸難分離色譜峰分離最優(yōu)且柱參數(shù)H值較大的ZORBAX Eclipse XDB-C18和ZORBAX SB-C18色譜柱進行后續(xù)試驗，考察其他因素對目標因子的影響。

2.3 篩選主要影響因素

流動相的pH、濃度、有機相比例、梯度時間、色譜柱類型、柱溫、流速等均可能對目標因子產(chǎn)生影響。由于影響因素較多，首先采用Plackett-Burman（PB）設計剔除影響不顯著因素。確定優(yōu)化目標因子為：難分離色譜峰2和峰3的分離度（R2/3）、主峰和峰8的分離度（R主峰/8）、峰8和9的分離度（R8/9）、峰9和10的分離度（R9/10）、峰10和11的分離度（R10/11）和峰12的保留時間（tR12）。影響因素考察范圍為，A：梯度開始時有機相的比例5%～12%；B：梯度結束時有機相的比例 20%～35%；C：流動相pH 2～4；D：柱溫 30℃～40℃；E：流速0.8～1.0 mL/min；F：甲酸銨濃度0.5～2.0 g/L；G：梯度開始的時間2～10 min；H：梯度結束的時間30～60 min；J：色譜柱類型ZORBAX Eclipse XDB-C18、ZORBAX SB C18。

共進行12組試驗考查各因素對目標因子的影響，回歸分析結果顯示，流動相pH對各目標因子均有顯著影響；梯度開始時的乙腈的比例，對除R10/11外的各目標因子均有影響；柱溫越低，R10/11越大；梯度結束時間對tR12有一定影響。故對流動相pH、梯度開始時乙腈的比例、梯度結束時間和柱溫進行后續(xù)優(yōu)化。

2.4 CCD優(yōu)化

根據(jù)篩選出的主要影響因素，采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱，利用單因素實驗確定各影響因素的優(yōu)化范圍。結果表明，流動相pH=3.0時R2/3較低；pH=3.9時，色譜峰8和峰9的位置顛倒，最終設定pH優(yōu)化范圍為3～4。梯度開始時乙腈的比例為3%時，峰1呈融合峰；為9%時，分離度尚可；為12%時，峰1和2未分開，故設定初始乙腈比例的優(yōu)化范圍為2%～12%。梯度結束時間增加有利于分離，兼顧分析時間，設定為50～60 min。預實驗表明，低柱溫有利于各雜質的分離，為易于控制，設定柱溫范圍30℃～40℃。

根據(jù)單因素實驗確定的優(yōu)化范圍，采用CCD繼續(xù)優(yōu)化。按隨機順序進行試驗，得到對應的響應值（表3）。

試驗得到的回歸方程分別為：

R2/3=2.6-1.24A+0.99B+0.32C-0.26D+0.28A×B-0.28A×D-0.27B×C+0.48B×D-0.52C×D-0.2A2-0.3B2-0.5C2（5）

R主峰/8=4.26-0.26A+0.33B+0.14C-0.61A2+ 0.36B2+0.19C2；（6）

R8/9=1.2-2B+0.72C （7）

R9/10=3.11+9.292E-003A+0.21B+0.014C+ 0.072D-0.018A×B+0.053A×C-0.071B×C+0.021B× D-0.29A2-0.089B2-0.018D2（8）

R10/11=3.81+0.21A-0.014B-1.25C-0.073D+ 0.054A×B+0.057A×C-0.12B×D+0.054A2-0.51B2+ 0.022D2（9）

tR12=40.37-7.93A-4.05B-1.21C+1.77D-1.01A×B－0.95A×D-2.08A2+B2（10）

諸模型均顯著，因素各交互作用的3D圖見圖2。采用滿意度函數(shù)法（表4）確定最優(yōu)化色譜系統(tǒng)，最優(yōu)色譜圖如圖1C所示。根據(jù)模型預測，該條件下R2/3、R主峰/8、R8/9、R9/10、R10/11和tR12的預測值分別為2.46、3.87、2.76、2.59、3.58和52.29 min，實際測定值為1.741、3.733、3.612、2.645、3.86、54.767 min，提示模型預測準確。與ChP（圖1B）和EP（圖1A）方法相比，優(yōu)化的色譜方法更優(yōu)，各雜質峰均達到理想的分離水平。

2.5 實際樣品測定

選擇5個不同生產(chǎn)廠家的市售注射用頭孢西丁鈉（編號為A、B、C、D、E）進行測定（圖3）：僅廠家A的產(chǎn)品中檢出峰5；5個廠家的產(chǎn)品中均未檢出峰7（氧化降解產(chǎn)物）和峰12；廠家C的產(chǎn)品中未檢出峰10；廠家B的產(chǎn)品中未檢出峰11；其余雜質峰在各廠家產(chǎn)品中均有檢出。廠家C產(chǎn)品中峰8的含量最大（0.28%）；廠家D產(chǎn)品中峰6的含量最大（0.26%），且其雜質總量最高（0.99%）。

2.6 質譜分析

對強制降解溶液和樣品中發(fā)現(xiàn)的色譜峰進行質譜分析，利用質荷比信息，并結合頭孢西丁鈉的生產(chǎn)工藝和已有文獻，對樣品中部分雜質的可能結構進行了推定。注射用頭孢西丁鈉中可能含有11個潛在雜質（表5），其中峰1、峰4和峰5的結構尚未見其他文獻報道。

3 討論

注射用頭孢西丁有關物質分析中，無論采用何種藥典標準方法，均有多對雜質的分離度未達到要求，本文經(jīng)色譜柱篩選和CCD設計優(yōu)化后，在60min內(nèi)可使得各雜質峰的分離度達到最大值。與傳統(tǒng)的試錯法相比，采用計算機輔助設計優(yōu)化，通過逐步縮小優(yōu)化的區(qū)間，不僅可以最大程度減少實驗次數(shù)，還可以考察不同因素的交互作用，提高預測準確度。

實驗中發(fā)現(xiàn)，影響頭孢西丁有關物質分析的主要影響因素為色譜柱參數(shù)H，色譜柱的疏水性越大，越易實現(xiàn)目標因子分離的要求。如在1號色譜柱（H值為0.623）中，目標因子R3/4和R8/9分別為1.513和0.219，而在6號色譜柱（H值為1.007）中，對應的分離度可以達到6.337和7.994；其次為流動相的pH、乙腈的比例、柱溫和梯度時間。各因素對諸目標因子的影響不同，且存在交互作用，在部分區(qū)域甚至存在沖突。采用整體滿意度函數(shù)，在確定的主要影響因素區(qū)間范圍內(nèi)，可以篩選到最優(yōu)的色譜條件，使各目標因子同時滿足要求。

制備混合系統(tǒng)適用性溶液時，分別考察了酸、堿、氧化、高溫溶液和高溫粉末五種強制降解條件。酸濃度增加至2 mol/L處理2 h時雜質峰無明顯變化；高溫粉末80℃放置13 d，僅峰6和峰8略微增加；0.2 mol/L堿溶液降解30 min時，峰2和峰11增加明顯，其余雜質無明顯變化，時間稍延長，主成分幾乎全部降解；高溫溶液80℃放置1 h，峰2、峰4、峰5和峰6均增加明顯；3%氧化降解2 h，峰1、峰2和峰3均增加明顯；基于上述試驗結果，最終確定混合系統(tǒng)適用性溶液由溶液通過氧化和高溫降解產(chǎn)生。

注射用頭孢西丁鈉在生產(chǎn)、運輸和儲藏過程中均會產(chǎn)生多種雜質。圖1中，除峰6為工藝雜質外，其余均為降解雜質，峰7為氧化降解產(chǎn)生，其結構有待進一步確認。峰1、峰2和峰3均在氧化破壞后增加，峰2、峰4、峰5和峰6均在高溫后有所增加。

4 結論

與常規(guī)方法不同，本文不再根據(jù)藥典標準中規(guī)定的色譜柱類型（如EP中的苯基柱）去試錯篩選色譜柱，而是從柱參數(shù)出發(fā)，考察其與目標因子的函數(shù)關系，確定某個參數(shù)或某幾個參數(shù)的關鍵作用。并將計算機輔助設計與實際樣品分離分析相結合，確定影響色譜分離的顯著因素，考察各個因素的交互作用，成功地選擇出頭孢西丁鈉有關物質分析的最優(yōu)色譜條件，也為其他藥物HPLC分析的優(yōu)化提供了范例。本文對于完善注射用頭孢西丁鈉質量標準，考察不同企業(yè)的雜質譜差異，具有參考意義。

參 考 文 獻

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