劉巖 呂宗凱 劉連芬 錢關(guān)澤

摘要 以薔薇科中的皺皮木瓜為研究對(duì)象，以其葉片為試驗(yàn)材料，分別進(jìn)行料液比、提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度單因素試驗(yàn)探究總黃酮提取最適范圍，通過響應(yīng)面法（RSM）和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合二次回流優(yōu)化超聲輔助提取總黃酮工藝。結(jié)果表明，不同因素對(duì)木瓜葉片總黃酮提取率的影響順序?yàn)樘崛r(shí)間＞乙醇濃度＞料液比；最佳工藝條件為提取時(shí)間52 min、乙醇濃度74%、料液比1∶41（g∶mL）時(shí)，總黃酮為156.65 mg/g，提取率達(dá)到15.67%。

關(guān)鍵詞 皺皮木瓜；總黃酮；響應(yīng)面法；提取工藝優(yōu)化

中圖分類號(hào) R284.2? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2023）10-0144-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.10.032

Abstract Taking Chaenomeles speciosa in the Rosaceae as the research object and its leaves as the experimental material，the single factor experiments were conducted to explore the optimal range of total flavonoids extraction， including solidliquid ratio， extraction time， extraction temperature and ethanol concentration. Response surface methodology （RSM） and BoxBehnken experimental design were combined with secondary reflux to optimize the ultrasonic assisted extraction process of total flavonoids.The results showed that the order of influence of different factors on the extraction rate of total flavonoids from papaya leaves was extraction time>ethanol concentration>solidliquid ratio;the optimal process conditions were extraction time 52 minutes， ethanol concentration 74% and solidliquid ratio 1∶41（g∶mL），the total flavonoids were 156.65 mg/g， and the extraction rate reached 15.67%.

Key words Chaenomeles speciosa;Total flavonoids;Response surface methodology （RSM）;Optimization of extraction process

皺皮木瓜（Chaenomeles speciosa（sweet）Nakai）又稱楙、貼梗木瓜、貼梗海棠、鐵腳梨等，是薔薇科木瓜屬植物，在安徽、浙江、陜西、甘肅、廣東、云貴川及緬甸等均有分布，為常見的栽培及藥用植物，花色有乳白色、粉紅色、大紅色且有重瓣及半重瓣品種，早春先花后葉［1］。皺皮木瓜含有大量的有機(jī)酸、三萜類、黃酮類化合物、熊果酸、多糖及超氧化物歧化酶（SOD）等成分，被稱為“百益之果”，是一種藥食同源的植物［2］。中醫(yī)認(rèn)為木瓜味酸性溫，入肝、脾經(jīng)，有健脾開胃、去濕舒筋之功效，藥理學(xué)上認(rèn)為這些物質(zhì)具有抗癌、抑制腫瘤、抗炎殺菌、抗氧化等功效［3］。

目前對(duì)于皺皮木瓜的研究多集中在栽培技術(shù)［4］和藥用價(jià)值［5］方面，對(duì)其活性物質(zhì)的研究包括對(duì)皂苷、熊果酸、齊墩果酸及有機(jī)酸等物質(zhì)的提純技術(shù)及功能效果方面［6-7］；僅少量學(xué)者報(bào)道了皺皮木瓜中黃酮類物質(zhì)的提純方法及總黃酮含量，指出了由于皺皮木瓜分布區(qū)的差異，其含有的總黃酮含量也不盡相同［8-9］，對(duì)木瓜中黃酮類物質(zhì)的提取工藝優(yōu)化的研究還鮮見報(bào)道。黃酮類化合物的傳統(tǒng)提取方法主要包括水提法、溶劑萃取法、樹脂吸附法等，近年來國(guó)內(nèi)外新開發(fā)的提取方法有超聲輔助提取法［10］、超臨界流體萃取法［11］、微波萃取法［12］、酶提取法［13］等，其中超聲輔助提取法具有用時(shí)短、成本低、提取率高、無試劑殘留污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)［14］，它亦可結(jié)合其他提取方式共同使用，是一種廣泛應(yīng)用的有極大發(fā)展前景的物質(zhì)提取方式。為發(fā)掘皺皮木瓜葉片的潛在利用價(jià)值，減少枯枝敗葉對(duì)環(huán)境造成的污染和壓力，該試驗(yàn)采用Box-Behnken響應(yīng)面法研究料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)總黃酮提取效果的影響，優(yōu)化超聲冷凝回流法提取皺皮木瓜葉片中總黃酮的工藝參數(shù)，以期為皺皮木瓜葉片的深度開發(fā)利用及其中活性物質(zhì)的研究提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試材。皺皮木瓜春季4月新鮮幼嫩葉片，采自山東省聊城大學(xué)植物園，挑選大小、幼嫩程度相似、無病蟲害、完整新鮮的葉片。

1.1.2 試劑。

亞硝酸鈉、氫氧化鈉、九水硝酸鋁、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%），購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；無水乙醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所有試劑均為分析純（AR）。

1.1.3 儀器與設(shè)備。

DGX-9053B-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司；

仙桃xt-200型高速多功能粉碎機(jī)，浙江省永康市紅太陽機(jī)電有限公司；

FA1004電子分析天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；

SB-4200 DTD數(shù)控加熱超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；

SHK-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

UV紫外可見分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)材料的處理。

將采摘的新鮮皺皮木瓜葉片洗凈晾干，放于70 ℃烘干箱中恒溫烘干至恒重，后用粉碎機(jī)粉碎、過篩得粉末，儲(chǔ)存于干燥袋中于4 ℃冰箱密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線建立。

根據(jù)卞京軍等［15］的方法稍作改良建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品，精確稱取1 g樣品，60%乙醇500 mL溶解，并用60%乙醇定容至1 000 mL，得濃度為1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。取6支試管，分別加入 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液，之后加入60%乙醇至體積為1 mL，先加入10%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，振蕩搖勻并靜置5 min，之后加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL，振蕩并搖勻，靜置5 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，振蕩并搖勻，靜置10 min，以第一管為空白對(duì)照，測(cè)定510 nm處的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)（y）、蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）建立蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 總黃酮提取及含量測(cè)定。

準(zhǔn)確稱量木瓜粉末1 g于圓底燒瓶中，分別在不同料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度條件下，遵循單一變量原則進(jìn)行超聲冷凝回流提取?？紤]到高溫溶劑易揮發(fā)導(dǎo)致提取不充分等問題，該研究根據(jù)宋璇等［16］的方法稍作改良，在第一次提取結(jié)束后，另加入同等體積乙醇進(jìn)行二次回流提取，合并提取液，定容于100 mL容量瓶，后轉(zhuǎn)移至125 mL棕色廣口瓶保存。

采用硝酸鋁比色法對(duì)總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。取200 μL樣品至試管中，對(duì)照中加入同體積蒸餾水，各加入800 μL對(duì)應(yīng)體積的乙醇，加10% NaNO2溶液1 mL，振蕩搖勻后反應(yīng)5 min；加10% Al（NO3）3溶液1 mL，振蕩搖勻反應(yīng)5 min；加入4% NaOH溶液5 mL，振蕩搖勻反應(yīng)10 min，測(cè)510 nm處的OD值。參照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算皺皮木瓜中總黃酮含量，求得總黃酮的提取率，計(jì)算公式如下：

E=C×V×nm×100%（1）

式中，E為總黃酮提取率（%）；C為含有的總黃酮質(zhì)量濃度（g/mL）；V為加入的提取液體積（mL）；n為稀釋倍數(shù)；m為木瓜粉末的質(zhì)量（g）。

1.2.4 單因素試驗(yàn)。

1.2.4.1 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響。

精確稱取皺皮木瓜葉片粉末1 g，以料液比1∶50（g∶mL）、乙醇濃度60％、提取時(shí)間40 min條件下，提取溫度分別為室溫（30）、40、50、60、70 ℃進(jìn)行回流提取，計(jì)算總黃酮提取率，重復(fù)3次。

1.2.4.2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響。

精確稱取皺皮木瓜葉片粉末1 g，以料液比1∶50、乙醇濃度60％、提取溫度50 ℃條件下，提取時(shí)間分別為20、30、40、50、60 min進(jìn)行回流提取，計(jì)算總黃酮提取率，重復(fù)3次。

1.2.4.3 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響。

精確稱取皺皮木瓜葉片粉末1 g，以乙醇濃度60％、提取時(shí)間40 min、提取溫度50 ℃條件下，料液比分別為1∶30、1∶40、 1∶50、1∶60、1∶70進(jìn)行回流提取，計(jì)算總黃酮提取率，重復(fù)3次。

1.2.4.4 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響。

精確稱取皺皮木瓜葉片粉末1 g，以料液比1∶50 、提取時(shí)間40 min、提取溫度50 ℃條件下，乙醇濃度分別為50％、60％、70％、80％、90％進(jìn)行回流提取，計(jì)算總黃酮提取率，重復(fù)3次。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，且由于試驗(yàn)材料采集時(shí)間原因，選取3因素3水平的響應(yīng)面分析法對(duì)超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間3個(gè)因素為自變量，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，將獲得

數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件Design-Expert，以其中的Box-Behnken設(shè)計(jì)原理得到17組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析多因素交互作用，優(yōu)化提取條件，建立回歸模型，最后確定最佳提取參數(shù)及驗(yàn)證試驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 建立蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度為縱坐標(biāo)（y）、蘆丁質(zhì)量濃度 （mg/mL）為橫坐標(biāo)（x）建立蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=1.445x-0.017 6（R2=0.999 9），表明蘆丁在0～1.5 mg/mL表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響。

由圖2可知，在提取溫度、提取時(shí)間、料液比一定的條件下，乙醇濃度在50%～70%總黃酮提取率呈上升趨勢(shì)，在乙醇濃度70%時(shí)提取率達(dá)到最大值（15.16%）；乙醇濃度大于70%，總黃酮提取率呈顯著下降趨勢(shì)，到90%時(shí)總黃酮提取率為13.73%，同比最大值下降了9.43%，說明皺皮木瓜總黃酮在70%乙醇中溶解度最大，由此選取70%為皺皮木瓜葉片總黃酮提取的乙醇濃度。

2.2.2 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響。

由圖3可知，在提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度一定的條件下，總黃酮提取率隨著料液比減少呈先上升后下降的趨勢(shì)，料液比1∶30時(shí)總黃酮提取率為13.02%，1∶40時(shí)總黃酮提取率為14.29%，提取率增長(zhǎng)了9.75%，達(dá)到最大值；之后總黃酮提取率呈下降趨勢(shì)。因此選擇1∶40為皺皮木瓜葉片總黃酮提取的料液比。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響。

由圖4可知，在提取溫度、乙醇濃度、料液比一定的條件下，提取時(shí)間在20～50 min，總黃酮提取率先平緩后急劇增加，提取時(shí)間50 min時(shí)總黃酮提取率達(dá)到最高值，為15.55%；隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，總黃酮提取率急劇下降，60 min時(shí)，總黃酮提取率為14.09%。結(jié)果表明隨著提取時(shí)間的增加，總黃酮提取率提高，當(dāng)時(shí)間超過一定限值后總黃酮提取率下降，在工業(yè)生產(chǎn)中延長(zhǎng)提取時(shí)間會(huì)增加生產(chǎn)成本和消耗，為節(jié)約時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本，選擇50 min為皺皮木瓜葉片總黃酮提取時(shí)間。

2.2.4 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響。

由圖5可知，在乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比一定的條件下，提取溫度低于40 ℃，隨著提取溫度的增加總黃酮提取率逐漸增加；提取溫度40 ℃時(shí)總黃酮提取率達(dá)到峰值，為16.01%；高于40 ℃后總黃酮提取率呈急速下降趨勢(shì)。結(jié)果表明隨著提取溫度的增加，總黃酮提取率提高，而當(dāng)溫度超過一定限值后總黃酮提取率下降，可能是由于溫度過高導(dǎo)致部分黃酮類化合物結(jié)構(gòu)遭到破壞或是達(dá)到溶劑沸點(diǎn)后溶劑揮發(fā)損失，最終導(dǎo)致總黃酮提取率降低，因此選取40 ℃為皺皮木瓜葉片總黃酮提取溫度。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)影響皺皮木瓜葉片總黃酮提取率的不同因素（料液比、提取時(shí)間、乙醇濃度）進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，表1為不同因素及水平組合條件下皺皮木瓜葉片總黃酮提取率，結(jié)果表明，提取時(shí)間50 min、乙醇濃度70%、料液比1∶40時(shí)，皺皮木瓜葉片總黃酮提取率最高，為15.77%。

以Design Expert 8.05軟件對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，建立料液比（A）、提取時(shí)間（B）、乙醇濃度（C）3個(gè)因素與皺皮木瓜葉片總黃酮提取率 （Y） 的二次回歸方程：Y=15.74+0.036A+0.059B+0.045C-0.010AB+0.018AC-0.012BC-0.220A2-0.130B2-0.060C2（R2=0.999 4）。

方差分析（表2）顯示，模型顯著而失擬項(xiàng)不顯著，說明試驗(yàn)誤差小，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；決定系數(shù)（R2）大于0.9，說明模型具有較高的擬合度，可用于皺皮木瓜葉片總黃酮提取的條件優(yōu)化。

回歸模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，模型中料液比（A）不顯著（P>0.05），提取時(shí)間（B）、乙醇濃度（C）均顯著（P<0.05），表明料液比對(duì)皺皮木瓜葉片總黃酮提取率的影響不顯著，提取時(shí)間、乙醇濃度對(duì)提取率的影響顯著；A2、B2表現(xiàn)為極顯著（P<0.01），C2表現(xiàn)為顯著（P<0.05），說明乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間對(duì)皺皮木瓜葉片總黃酮提取率的影響是較為復(fù)雜的二次關(guān)系，影響順序?yàn)樘崛r(shí)間＞乙醇濃度＞料液比。

2.4 響應(yīng)面多因素交互作用分析

由圖6～8可知，在料液比、提取時(shí)間、乙醇濃度兩兩因素一定的條件下，總黃酮提取率都隨著第3個(gè)因素的增大而先上升后下降。料液比和提取時(shí)間的等高線形狀偏圓形，說明兩者交互作用較緩和；乙醇濃度與料液比的等高線呈橢圓形，表明兩者交互作用顯著；乙醇濃度和提取時(shí)間的等高線呈橢圓形，表明兩者交互作用顯著。

從響應(yīng)面的3D圖可知，料液比和提取時(shí)間、料液比和乙醇濃度、乙醇濃度和提取時(shí)間的曲線均較陡，說明兩者的交互作用對(duì)總黃酮提取率的影響較大。

2.5 總黃酮最佳提取參數(shù)的確定及驗(yàn)證性試驗(yàn)

經(jīng)過分析回歸方程，選擇Maximize模式對(duì)總黃酮提取工藝進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，得到最優(yōu)提取總黃酮的條件為提取時(shí)間52 min、乙醇濃度73.64%、料液比1∶40.94，此時(shí)，皺皮木瓜葉片總黃酮提取率的理論值為15.75%。

為驗(yàn)證回歸方程，以提取時(shí)間52 min、乙醇濃度74%、料液比1∶41進(jìn)行皺皮木瓜葉片總黃酮提取率驗(yàn)證試驗(yàn)，進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，回流提?。泊危Y(jié)果發(fā)現(xiàn)總黃酮提取率實(shí)際均值為15.67%，RSD小于5%，與理論值基本一致，說明Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)得到的各因素水平條件組合比較可靠，可以用于實(shí)際操作以及優(yōu)化提取參數(shù)。

3 結(jié)論與討論

前人研究報(bào)道，一般皺皮木瓜果實(shí)總黃酮含量在6～40 mg/g［17］，皺皮木瓜皮渣總黃酮得率為0.2%～0.5%［15］。唐浩國(guó)［18］研究表明，超聲波具有空化作用，該作用可加速植物有效成分溶解出來，進(jìn)而提高活性成分的提取率。該研究利用超聲冷凝回流提取法提取皺皮木瓜葉片中總黃酮，結(jié)合二次回流提取并利用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明在提取時(shí)間52 min、乙醇濃度74%、料液比1∶41條件下總黃酮得率最高，總黃酮提取率達(dá)到15.67%，總黃酮含量為156.65 mg/g，比文獻(xiàn)報(bào)道的總黃酮得率顯著提高［19-22］。究其原因，或是由于采樣時(shí)間處于春季，葉片較嫩，總黃酮含量更高，且一次提取后又加入溶劑進(jìn)行了二次回流，補(bǔ)充了溶劑，保證總黃酮的大部分能夠提取出來。由此可見，Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化及二次回流的應(yīng)用使得總黃酮提取率更高。該研究結(jié)果最大程度提高了皺皮木瓜葉片總黃酮得率，證明了以響應(yīng)面法優(yōu)化提取皺皮木瓜葉片總黃酮工藝的可行性，充分挖掘出木瓜的潛在利用價(jià)值，在控制成本、提高效率、保護(hù)環(huán)境、減少污染方面有著巨大的優(yōu)勢(shì)，從而實(shí)現(xiàn)了皺皮木瓜原料更為高效利用，為擴(kuò)大皺皮木瓜工業(yè)生產(chǎn)及產(chǎn)品的開發(fā)利用提供了可靠依據(jù)。

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