盛王濤 楊麗菲 謝小俐 胡瑞 李菁

摘 要：目的：檢測分析牦牛乳特定低聚糖組分、含量及構(gòu)成比，并與人乳比較，探討其作為代乳品的優(yōu)勢與不足。方法：對中國西藏若爾蓋地區(qū)分散采集的20頭牦牛產(chǎn)崽1 w時的牦牛乳樣本，及從20名分娩足月嬰兒的婦女中獲得的分娩后2 w（對照1組）和6 w（對照2組）的人乳樣本，采用液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）方法進行乳汁低聚糖特定組分的定量分析。結(jié)果：牦牛乳組14種低聚糖總含量為（269.9±24.1）μg/mL，人乳組14種低聚糖總含量為（4 641.3±1 071.5）μg/mL，其中2 w時含量為 （5 156.1±916.4）μg/mL、6 w時含量為 （4 126.5±979.2）μg/mL，牦牛乳組與2個人乳組兩兩比較的組間差異顯著性均存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。牦牛乳組與2個人乳組各低聚糖組分含量分別比較顯示，乳-N-二巖藻六糖II型（LNDPF II）不存在組間差異（P＞0.05），其余差異顯著性均存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2個人乳組各低聚糖組分含量比較顯示，2′-巖藻糖基化乳糖（2FL）、乳-N-四糖（LNT）、乳-N-二巖藻六糖II型（LNDPF II）、3′-唾液酸乳糖（3′-SL）、6′-唾液酸乳糖（6′-SL）組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其他無顯著性差異（P＞0.05）。牦牛乳組與2個人乳組各低聚糖構(gòu)成比兩兩比較顯示，均不存在組間差異（P＞0.05）。牦牛乳組中性/酸性低聚糖構(gòu)成比與2個人乳組分別比較的組間差異顯著性均存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2個人乳組之間中性/酸性低聚糖構(gòu)成比不存在組間差異（P＞0.05）。結(jié)論：人乳特有低聚糖的組成和豐富程度是其他動物乳不可替代的，牦牛乳低聚糖含量大于牛乳低聚糖含量，其個別中性及酸性低聚糖組分接近甚至超過人乳中同種組分，可能是一種有前途的人乳替代來源。

關(guān)鍵詞：牦牛乳;低聚糖;人乳低聚糖;組分

人乳是嬰幼兒營養(yǎng)的黃金標準，人乳低聚糖是其主要成分之一，構(gòu)成人乳中碳水化合物的較大部分（20%，5～20 g/L）[1-2]。人乳低聚糖的多樣性豐富，觀察到247個品種，162種人乳低聚糖具有結(jié)構(gòu)特征[3]，其組成和豐度因母親的遺傳和哺乳期而異，也受妊娠年齡、母親健康狀況、嬰兒性別、飲食習慣、乳母Lewis血型[4]的影響。這些低聚糖起到益生元、免疫調(diào)節(jié)劑和病原體抑制劑的作用，并被發(fā)現(xiàn)能改善腸道和大腦功能。牛奶傳統(tǒng)上是嬰兒配方奶粉的基礎(chǔ)，對牛乳低聚糖的研究少于對人乳低聚糖的研究，與人乳低聚糖相比，牛乳低聚糖的濃度要低得多（0.03～0.06 g/L）[5]。嬰兒配方奶粉通常含有益生元，但缺乏人乳低聚糖的特殊功能。牦牛發(fā)源于中國，是一種能適應高原地區(qū)環(huán)境的優(yōu)勢畜種?，F(xiàn)階段，我國豐富的牦牛乳資源尚未被充分開發(fā)利用，國內(nèi)主要的牦牛乳衍生品類型有奶粉、液態(tài)奶、酸奶、奶茶和干酪素等，生產(chǎn)和加工企業(yè)主要分布在西藏、青海、甘肅、四川等4個牦牛分布多的省份[6]。牦牛乳成分與普通牛乳成分不同，由于畜種及地區(qū)等因素限制了對牦牛乳的成分的研究，很少有研究報告牦牛乳低聚糖。本研究檢測分析牦牛乳特定低聚糖的組分、含量及構(gòu)成比，并與人乳比較，探討其作為代乳品的優(yōu)勢與不足。

1 材料與方法

1.1 奶樣和標本收集

1.1.1 牦牛乳 在中國西藏若爾蓋地區(qū)分散采集的20頭牦牛產(chǎn)崽1 w時的牦牛乳樣本。樣本在環(huán)境溫度下10 min內(nèi)收集，干冰運輸?shù)綄嶒炇遥⒃?80 ℃下儲存。

1.1.2 人乳 從20名分娩足月嬰兒的婦女中獲得的分娩后2 w（對照1組）和6 w（對照2組）的人乳樣本。采集樣本后用干冰運送到實驗室，并在-80 ℃下儲存。

1.2 倫理審核

研究機構(gòu)倫理審查委員會批準了該研究的所有方面（批件號：SCMCIRB-K2018096-1），并獲得了所有母親的知情同意。

1.3 方法

1.3.1 樣本前處理 取乳樣100 μL，4 000 g、4 ℃離心10 min后，去除上層脂肪，將50 μL下層清液裝新離心管中，然后加入100 μL乙醇。接著12 000 g、4 ℃離心60 min，離心后，乳樣分為兩部分，低聚糖位于上清液中，底部沉淀為酪蛋白，獲取上清液棄去沉淀。向50 μL上清液中加入950 μL純水。接著取25 μL 稀釋后的上清液，加入25 μL NaBH4水溶液（0.5 mol/L），在室溫下孵育30 min。接著加入25 μL乙酸溶液（0.5 mol/L）終止反應。最后取10 μL用于LC-MS檢測。

1.3.2 基于UPLC-QTOF-MS的低聚糖靶向代謝組學 （1）色譜方法：色譜柱為Hypercarb石墨碳色譜柱（100 mm×2.1 mm i.d.，3 μm;Thermo Fisher）流動相A為水、流動相B為純乙腈、流速為0.2 mL/min、進樣量為10 μL、柱溫為25 ℃。（2）質(zhì)譜條件：離子源類型為ESI，電噴霧離子源。（3）電離模式：負離子模式（ESI-）。（4）數(shù)據(jù)采集模式：TOFMS采集一級質(zhì)譜信息，即分子離子峰的精確質(zhì)荷比，IDAMS/MS模式采集二級質(zhì)譜信息，即碎片離子的精確質(zhì)荷比。一級質(zhì)譜信息主要用于低聚糖化合物的定量分析、二級質(zhì)譜信息主要用于低聚糖化合物的定性分析。

1.3.3 低聚糖標準品 14種低聚糖標準品包括2′-巖藻糖基化乳糖（2FL）、3′-巖藻糖基化乳糖（3FL）、乳-N-四糖（LNT）、乳-N-新四糖（LNnT）、乳-N-巖藻五糖I型（LNFP I）、乳-N-巖藻五糖II型（LNFP II）、乳-N-巖藻五糖III型（LNFP III）、乳-N-巖藻五糖V型（LNFP V）、乳-N-二巖藻六糖I型（LNDPF I）、乳-N-二巖藻六糖II型（LNDPF II）、唾液酸乳-N-四糖a（LSTa）、唾液酸乳-N-四糖c（LSTc）、3′-唾液酸乳糖（3′-SL）、6′-唾液酸乳糖（6′-SL），均購自法國ElcitylOligoTech公司。其中，中性低聚糖10種（8種巖藻糖基化和2種未糖基化低聚糖）、酸性低聚糖4種（唾液酸化低聚糖）。

1.4 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行統(tǒng)計學處理。正態(tài)分布的計量資料采用x±s描述，兩組之間計量資料比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用卡方檢驗，當P<0.05，認為組間差異的顯著性具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般資料

本組共牦牛乳20份（20頭牦牛產(chǎn)崽1 w時的牦牛乳樣本）、人乳40份（從20名分娩足月嬰兒的婦女中獲得的40份人乳樣本，其中，20份為產(chǎn)后2 w采集、20份為產(chǎn)后6 w采集）。

2.2 牦牛乳中14種低聚糖成分測定及其與人乳的比較

2.2.1 低聚糖總量 牦牛乳組14種低聚糖總含量為（269.9±24.1）μg/mL，人乳2組14種低聚糖總含量為（4 641.3±1 071.5）μg/mL［其中對照1組為（5 156.1±916.4）μg/mL、對照2組為（4 126.5±979.2）μg/mL］，牦牛乳組與2個人乳組兩兩比較的組間差異顯著性均存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2.2 各低聚糖含量比較 牦牛乳組與2個人乳組14種低聚糖含量分別比較顯示，乳-N-二巖藻六糖II型（LNDPF II）不存在組間差異（P＞0.05），其余差異顯著性均存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2個人乳組14種低聚糖含量比較顯示，2-巖藻糖基化乳糖（2FL）、乳-N-四糖（LNT）、乳-N-二巖藻六糖II型（LNDPF II）、3′-唾液酸乳糖（3′-SL）、6′-唾液酸乳糖（6′-SL）組間差異顯著性存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其他不存在組間差異（P＞0.05）（表1）。

2.2.3 各低聚糖構(gòu)成比及中性/酸性低聚糖構(gòu)成比比較牦牛乳組與2個人乳組14種低聚糖構(gòu)成比兩兩比較顯示，均不存在組間差異（表2）。牦牛乳組中性/酸性低聚糖構(gòu)成比（42.3%/57.7%）與對照1組（80.8%/19.2%）比較的組間差異顯著性均存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。牦牛乳組中性/低聚糖構(gòu)成比（42.3%/57.7%）與對照2組（82.5%/17.5%）比較的組間差異顯著性均存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2個人乳組中性/酸性低聚糖構(gòu)成比不存在組間差異（P＞0.05）。

3 討論

低聚糖是一類含3～9個單糖單元的碳水化合物，人乳低聚糖含量豐富，是乳汁中第三大固體成分，已知種類高達200余種[7]，具有益生元、免疫調(diào)節(jié)劑和病原體抑制劑的作用，能改善乳兒腸道功能。牛乳低聚糖結(jié)構(gòu)與人乳相似，已鑒定出67個組分，且含量遠低于人乳中的低聚糖，研究報道僅為0.03～0.06 g/L [5]，以6′-SL含量最高，其余低聚糖含量均測不出或微量[8]。牛乳低聚糖構(gòu)成比與人乳也有所不同，如唾液酸在牛初乳中含量高達70%，而在人初乳中僅為20%[9]。由此可見，牛乳中主要是酸性低聚糖，并隨著泌乳期延長由32%（初乳）降低到6%（產(chǎn)乳30 d）[10]，而牦牛乳低聚糖的研究數(shù)據(jù)未見發(fā)表。本研究率先開展對牦牛乳中常見人乳低聚糖的檢測分析，已測的14種低聚糖定量結(jié)果顯示，牦牛乳低聚糖總含量低于人乳，但高于牛乳，約為后者的5～10倍，其中6′-SL含量與牛乳相當。此外，本研究結(jié)果說明，牦牛乳與人乳各低聚糖構(gòu)成比無明顯差異，提示牦牛乳低聚糖組成的相對安全性。其中，牦牛乳中性低聚糖占比低于人乳，酸性低聚糖占比高于人乳，與以往文獻報道相符[9]。

人乳低聚糖充當益生元，刺激有益菌的生長。純?nèi)巳槲桂B(yǎng)的嬰兒腸道微生物群含高達90%的雙歧桿菌，而配方奶喂養(yǎng)的嬰兒腸道微生物群與成人相似[11]。低聚半乳糖（GOS）和低聚果糖（FOS）作為益生元經(jīng)常被添加到嬰幼兒配方奶粉中。2FL與腸粘膜上皮細胞的H-2表位的結(jié)合，防止空腸彎曲菌粘附到宿主上[12]。2FL通過降低CD14信使核糖核酸（mRNA）的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)CD14的表達，從而抑制I型菌毛大腸桿菌感染引起的炎癥[13]。3FL和LNFP II被證明能特異性阻斷綠膿桿菌[14]。唾液酸乳糖（SL）能抑制大腸桿菌、銅綠假單胞菌、煙曲霉分生孢子、幽門螺桿菌[15]。6′-SL被認為可以調(diào)節(jié)嬰兒的免疫反應[16]。大鼠NEC模型的研究表明，人乳低聚糖可預防由NEC引起的發(fā)病率和死亡率，最強和最一致的保護作用發(fā)生在DSLNT[17]。Good等[18]證明，喂食2FL的NEC小鼠幼仔生長更好、疾病更輕，這種作用歸因于一氧化氮合酶的上調(diào)和腸灌注的恢復。本研究中人乳不同泌乳期2FL、LNFP II、6′-SL含量均大于牦牛乳，說明人乳相較于牦牛乳可能具有更多生物活性功能。

文獻報道，產(chǎn)后10 d人乳LNFP II+LNDFP II含量最高，隨后逐漸下降[19]；乳酸桿菌優(yōu)勢定植與乳汁LNDFH II含量呈負相關(guān)，初乳中乳酸桿菌水平較成熟乳低可能與此有關(guān)[20]。本研究結(jié)果說明，隨著人乳泌乳期延長，至分娩后6 w時LNDPF II含量逐漸下降，而牦牛乳LNDPF II含量與分娩2 w及6 w人乳接近，推測牦牛乳對乳酸桿菌的影響與人乳相似。乳酸桿菌在抑制病原菌，維持微生態(tài)平衡等方面起關(guān)鍵作用。

4 結(jié)論

近年來，關(guān)于人乳低聚糖的研究較多，而對于牦牛乳低聚糖未見研究報道。牦牛乳作為高原地區(qū)的優(yōu)勢畜種，尚未被充分開發(fā)利用。本研究中共測定14種低聚糖，相較人乳低聚糖已觀察到的247個品種，162種低聚糖結(jié)構(gòu)特征[3]，本研究所測低聚糖的豐富程度遠遠不夠，另外低聚糖的功能與其含量及構(gòu)成比的相關(guān)性尚未明確，且低聚糖的影響因素復雜，其組成和豐度因母親的遺傳和哺乳期而異，也受妊娠年齡、母親健康狀況、嬰兒性別等因素影響，有待進一步研究闡明。雖然牦牛乳低聚糖組分構(gòu)成的豐富程度不及人乳，但相較牛乳，牦牛乳仍有其獨特的優(yōu)勢，其中個別中性及酸性低聚糖組分接近甚至超過人乳，可能是一種有前途的人乳替代來源。

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Abstract：ObjectiveTo detect the composition，content and composition ratio of specific oligosaccharides in yak milk and compare it with human milk，in order to explore its advantages and disadvantages as a milk substitute.MethodThe milk samples of 20 yaks were collected at one week of birth from Zoige area，Tibet，and the human milk samples were collected from 20 women who gave birth to full-term infants at 2 weeks （control group 1） and 6 weeks （control group 2）. The components of milk oligosaccharides were analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry （LC-MS）.ResultThe total content of 14 kinds of oligosaccharides in yak milk group was （269.9±24.1）μg/mL.The total content of 14 kinds of oligosaccharides in human milk group was（4 641.3±1 071.5）μg/mL.The content of oligosaccharide was （5 156.1±916.4）μg/mL at 2 weeks，and the content was （4 126.5±979.2）μg/mL at 6 weeks.There were significant differences between yak milk group and two human milk groups（P< 0.05）. There was no significant difference in the content of LNDPF II between yak milk group and two human milk groups（P> 0.05）.There were significant differences in 2FL，LNT，LNDPF II，3′-SL and 6′-SL between two human milk groups （P< 0.05），while there were no significant differences in others（P> 0.05）.There was no significant difference in the composition ratio of each oligosaccharides between yak milk group and two human milk groups （P> 0.05）. There were significant differences in the composition ratio of neutral/acid oligosaccharides between yak milk group and two human milk groups（P<0.05）. There was no significant difference in the composition ratio of neutral/acid oligosaccharides between two human milk groups（P>0.05）.Conclusion The composition and abundance of specific oligosaccharides in human milk can not be replaced by other animal milk.The content of oligosaccharides in yak milk is higher than that in cow milk，and some neutral and acidic oligosaccharides in yak milk are close to or even more than those in human milk，which may be a promising alternative source of human milk.

Keywords：yak milk；oligosaccharide； human milk oligosaccharides;composition