王夢雅,劉曼,馬澤剛

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,山東 青島 266071)

帕金森病(PD)是一種以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性退化為特征的神經(jīng)退行性疾病[1]。神經(jīng)炎癥是PD的主要病理因素之一,小膠質(zhì)細(xì)胞是參與調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥的重要細(xì)胞[2]。研究表明,小膠質(zhì)細(xì)胞分為經(jīng)典激活型(M1型)和選擇性激活型(M2型)[3]。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞持續(xù)產(chǎn)生促炎遞質(zhì),如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)等[4];M2型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌抗炎因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子,如精氨酸酶-1(Arg-1)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)等[5]。因此,有效調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的表型狀態(tài),可能成為未來治療PD的新策略。

近些年研究表明,大麻素Ⅱ型受體(CB2受體)主要分布在小膠質(zhì)細(xì)胞上,激活CB2受體可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,進(jìn)而調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥[6-7]。有研究報(bào)道,激活CB2受體可調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2極化,進(jìn)而減輕出血性腦病的腦損傷[8]。然而,激活CB2受體對1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)處理的小膠質(zhì)細(xì)胞表型影響目前尚不清楚。本研究應(yīng)用MPP+處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞建立體外PD模型,觀察CB2受體激動劑JWH133對MPP+誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞不同表型標(biāo)志物iNOS和Arg-1表達(dá)的影響,以及CB2受體拮抗劑AM630的阻斷效應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

BV2小膠質(zhì)細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;DMEM高糖培養(yǎng)液和胎牛血清購自以色列Biological Industries(BI)公司;青霉素/鏈霉素溶液購自索萊寶公司;MPP+、CB2受體激動劑JWH133和CB2受體抑制劑AM630購自美國Sigma-Aldrich公司;兔抗iNOS和β-actin抗體購自美國Proteintech公司;兔抗Arg-1抗體購自美國Cell Signaling公司;HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購自中國愛必信公司;ECL發(fā)光液購于中國雅酶公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

BV2小膠質(zhì)細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),該培養(yǎng)液中含有體積分?jǐn)?shù)0.10的胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)0.01的青霉素/鏈霉素。細(xì)胞置于溫度為37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)2～3 d后進(jìn)行傳代,將狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于六孔板中,進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。將BV2細(xì)胞分為對照組(A組)、MPP+組(B組)、JWH133+MPP+組(C組)、AM630+MPP+組(D組)以及JWH133+AM630+MPP+組(E組)。A組不做任何處理;B組使用200 μmol/L的MPP+處理小膠質(zhì)細(xì)胞24 h;C組先加入1 μmol/L的JWH133預(yù)處理小膠質(zhì)細(xì)胞40 min,再加入200 μmol/L的MPP+共處理細(xì)胞24 h;D組先加入1 μmol/L的AM630預(yù)處理小膠質(zhì)細(xì)胞40 min,再加入200 μmol/L MPP+共處理細(xì)胞24 h;E組同時(shí)使用1 μmol/L的JWH133和1 μmol/L的AM630預(yù)處理細(xì)胞40 min,再加入200 μmol/L MPP+共處理細(xì)胞24 h。

1.3 免疫印跡法檢測iNOS和Arg-1蛋白的表達(dá)

各組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過藥物處理后,用PBS洗滌3次,每孔加入100 μL RIPA裂解緩沖液冰上裂解30 min。用刮板將細(xì)胞刮下,經(jīng)離心(12 000 r/min,30 min,4 ℃)提取細(xì)胞蛋白。使用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。將含有20 μg蛋白質(zhì)的樣品通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離,隨后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將膜放進(jìn)50 g/L 脫脂牛奶中,室溫封閉2 h,分別加入iNOS(1∶2 000)、Arg-1(1∶1 000)和β-actin(1∶5 000)一抗4 ℃孵育過夜。用TBST洗3次,每次10 min,加入山羊抗兔IgG(1∶10 000)二抗室溫孵育1 h。應(yīng)用ECL發(fā)光液顯影,然后使用Image J軟件分析iNOS和Arg-1蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 JWH133對MPP+處理的小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比較,MPP+組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)水平顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)意義(F=9.825,q=6.346,P<0.01);與MPP+組比較,JWH133+MPP+組iNOS蛋白表達(dá)顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=5.714,P<0.01);而JWH133的作用可以被AM630逆轉(zhuǎn),JWH133+AM630+MPP+組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS蛋白的表達(dá)水平較JWH133+MPP+組有所上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=4.154,P<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞iNOS和Arg-1蛋白表達(dá)比較

2.2 JWH133對MPP+處理的小膠質(zhì)細(xì)胞Arg-1蛋白表達(dá)的影響

與MPP+組相比較,JWH133+MPP+組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞Arg-1蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.800,q=5.520,P<0.01);而JWH133+AM630+MPP+組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞Arg-1蛋白的表達(dá)水平較JWH133+MPP+組有所下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=4.155,P<0.05)。見表1。

3 討 論

PD是全球第二常見的神經(jīng)退行性疾病,其典型的臨床癥狀有靜止性震顫、姿勢不穩(wěn)、運(yùn)動遲緩和肌僵直等[9]。PD發(fā)病過程中,伴隨著過度的氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥等病理改變,導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失[10]。目前,左旋多巴替代治療是臨床治療PD的重要手段,但是卻不能抑制PD的進(jìn)展[11]。因此,探究導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元死亡的確切機(jī)制,有針對性地尋找治療靶點(diǎn),是目前改善PD療效的關(guān)鍵。神經(jīng)炎癥是促使PD進(jìn)展的重要病理因素[12]。TIWARI等[13]發(fā)現(xiàn),過度的神經(jīng)炎癥會破壞神經(jīng)元。并且有研究表明,在PD病人的大腦黑質(zhì)中,小膠質(zhì)細(xì)胞被異常激活[14],從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)。因此,小膠質(zhì)細(xì)胞的激活可能是影響PD進(jìn)展的重要因素之一。小膠質(zhì)細(xì)胞具有高度可塑性的特征,活化的小膠質(zhì)細(xì)胞會出現(xiàn)兩種表型,包括促炎的M1型和抗炎的M2型。在神經(jīng)退行性疾病中會伴隨著慢性炎癥,導(dǎo)致不同表型小膠質(zhì)細(xì)胞的比例失衡[15]。有研究報(bào)道,米諾環(huán)素能促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化,抑制M1極化,有助于神經(jīng)元存活和神經(jīng)功能恢復(fù)[16]。現(xiàn)有觀點(diǎn)認(rèn)為,促進(jìn)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2型可改善周圍神經(jīng)元的炎癥,進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

近年來,越來越多的研究證實(shí),大麻素具有神經(jīng)保護(hù)和調(diào)節(jié)運(yùn)動的功能。有體外實(shí)驗(yàn)研究表明,Δ9四氫大麻二醇(Δ9-THC)能抵抗1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用,可能是治療PD的有前途的藥物[17-18]。而大麻素的生理效應(yīng)主要是由大麻素Ⅰ型受體(CB1受體)和CB2受體介導(dǎo)的[19]。其中CB2受體主要在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),研究表明,存在慢性炎癥的大腦組織中,CB2受體聚集于激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中[20-21]。CB2受體敲除的小鼠大腦中,神經(jīng)炎癥水平明顯升高[22]?，F(xiàn)有觀點(diǎn)認(rèn)為,CB2受體的神經(jīng)保護(hù)作用是由于其對小膠質(zhì)細(xì)胞表型的影響,激活CB2受體促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞由具有神經(jīng)損傷作用的M1型轉(zhuǎn)化為具有神經(jīng)保護(hù)作用的M2型[23-24]。本研究應(yīng)用MPP+制備體外PD模型,探究激活CB2受體對BV2小膠質(zhì)細(xì)胞表型的影響。結(jié)果顯示,MPP+處理的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)顯著增加,表明BV2小膠質(zhì)細(xì)胞主要為M1型;CB2受體激動劑JWH133預(yù)處理可抑制MPP+誘導(dǎo)的iNOS蛋白表達(dá)上調(diào),表明激活CB2受體對M1型小膠質(zhì)細(xì)胞具有抑制作用。進(jìn)一步使用CB2受體抑制劑AM630進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示JWH133的作用被阻斷。此外,MPP+處理的小膠質(zhì)細(xì)胞Arg-1蛋白表達(dá)與對照組比較無明顯變化。推測產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因是:①M(fèi)PP+是具有神經(jīng)毒性的藥物,可刺激小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量的炎癥因子,對于抗炎因子Arg-1的釋放無直接作用[25-26];②小膠質(zhì)細(xì)胞為了應(yīng)對MPP+的毒性刺激產(chǎn)生了自我抗炎的保護(hù)作用,從而使Arg-1的水平保持不變;③MPP+對M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的影響更顯著,本實(shí)驗(yàn)中MPP+的用量可能對M2型小膠質(zhì)細(xì)胞未產(chǎn)生明顯的影響。本文研究結(jié)果與之前的有關(guān)研究結(jié)果一致[27]。本文結(jié)果還顯示,JWH133預(yù)處理顯著上調(diào)Arg-1蛋白表達(dá)水平,表明激活CB2受體促進(jìn)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化,而該作用可以被AM630逆轉(zhuǎn)。

綜上所述,JWH133激活CB2受體可以抑制MPP+處理的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化,同時(shí)促進(jìn)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化。本文結(jié)果為以激活CB2受體調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化作為靶點(diǎn)的PD治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),但是CB2受體對小膠質(zhì)細(xì)胞表型的調(diào)節(jié)作用仍未明確。有研究表明,JWH133通過核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/血紅素加氧酶1(HO-1)通路改善促炎M1巨噬細(xì)胞極化,從而顯示出抗肥胖炎癥作用[28]。另外有研究表明,JWH133可通過環(huán)磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)途徑促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化,參與生發(fā)基質(zhì)出血誘導(dǎo)后CB2受體介導(dǎo)的抗炎作用[8]。因此,JWH133對MPP+誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞表型調(diào)節(jié)作用可能也與cAMP/PKA或者Nrf2/HO-1通路相關(guān),但具體的機(jī)制通路仍需要進(jìn)一步研究。