宋婷婷,劉寧,宋姍愛,李瀟簫,劉自民,史明鵬
(青島大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 青島 266003 1 腫瘤內(nèi)科; 2 手術(shù)室)
胃癌是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因,世界上約52%的胃癌病人位于中國[1-2]。胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的多步驟過程,涉及表觀遺傳和遺傳變異的多條信號通路,包括拷貝數(shù)變化(CNVs)、單核苷酸變異和染色體易位[3]。CNVs是由基因組發(fā)生重排導(dǎo)致的,一般指長度為1 kb以上的基因組大片段的拷貝數(shù)增加或減少,主要表現(xiàn)為亞顯微水平的缺失和重復(fù)。對于晚期胃癌,化療可以延長生存期,但生存率低[3-4]。人表皮生長因子受體2(HER-2)的發(fā)現(xiàn)為胃癌提供了新的治療策略。Ⅲ期臨床研究表明,曲妥珠單抗聯(lián)合化療治療HER-2陽性胃癌,與單獨化療相比,病人總生存期(OS)顯著延長[5]。目前鑒定HER-2陽性方法主要為免疫組織化學(xué)染色(fIHC)和熒光原位雜交(FISH),但這兩種方法也有不足[6]。AN等[7]研究發(fā)現(xiàn),HER-2蛋白水平高于臨界值的病人在曲妥珠單抗治療中的表現(xiàn)優(yōu)于低值病人。目前關(guān)于胃癌HER-2基因CNVs的研究較少。本研究旨在通過檢測HER-2基因CNVs,分析CNVs與臨床病理特征相關(guān)性,探討HER-2基因CNVs與OS的關(guān)系,為胃癌預(yù)后提供新預(yù)測指標(biāo)。
納入2013年1月—2017年12月在青島大學(xué)附屬醫(yī)院接受手術(shù),術(shù)后組織標(biāo)本IHC HER-2 3+的病例資料完整的胃癌病人87例。其中男性72例(82.8%),女性15例(17.2%);年齡35~87歲,平均(64.5±9.9)歲。
對所有納入研究的病人進行隨訪,隨訪截止至2020年4月25日。病人OS定義為從手術(shù)日期開始至病人死亡或末次隨訪的時間。
1.3.1文庫制備和測序 將石蠟包埋的腫瘤組織切片(厚5 μm),共制備10張,采用標(biāo)準(zhǔn)提取方法(Qiagen,Valencia,CA)分離DNA,并使用基于PicoGreen的dsDNA(Life Technologies,Carlsbad,CA)檢測定量。將待測DNA用Covaris ME220超聲刀剪切成較短序列的DNA樣品,利用Illumina TruSeq LT試劑(Illumina Inc,San Diego,CA)制備索引測序文庫。使用Illumina Nextseq500/550 測序儀以快速模式進行大規(guī)模平行測序。
1.3.2數(shù)據(jù)處理 NGS檢測會產(chǎn)生大量的原始序列數(shù)據(jù),將這些序列數(shù)據(jù)進行初級處理,過濾后得到clean data,對clean data進行序列比對精準(zhǔn)捕捉基因點突變、缺失、插入、CNVs、結(jié)構(gòu)變異等變異信息。
使用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用χ2檢驗分析HER-2基因CNVs與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系;采用Kaplan-Meier生存曲線、Cox比例風(fēng)險回歸模型分析HER-2基因CNVs對OS的影響,采用log-rank檢驗法進行顯著性檢驗。
以HER-2基因CNVs中位數(shù)15.63作為臨界值[8],將CNVs≤15.63病人歸為低表達組,CNVs>15.63的病人歸為高表達組。對兩組病人的臨床病理特征進行比較結(jié)果顯示,HER-2基因CNVs與年齡(χ2=5.064,P=0.024)和Lauren分型(χ2=4.744,P=0.029)有關(guān),與其余臨床病理學(xué)參數(shù)無統(tǒng)計學(xué)意義上的相關(guān)性(P>0.05)。見表1。
表1 HER-2陽性胃癌病人HER-2基因CNVs與臨床病理特征的關(guān)系(例(χ/%))
對87例胃癌病人進行隨訪,其中28例病人死亡。繪制Kaplan-Meier生存曲線分析各臨床病理特征與OS的關(guān)系,HER-2基因CNVs與OS相關(guān)(χ2=5.070,P=0.024);進一步進行分層分析顯示,在腫瘤TNM分期為Ⅲ~Ⅳ期病人中,HER-2基因CNVs與OS相關(guān)(P=0.004)。見圖1~3。此外,Lauren分型、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤程度(T分期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期均與胃癌病人OS相關(guān)(χ2=5.058~12.004,P<0.05)。見表2。將以上因素納入Cox回歸模型進行多因素分析,結(jié)果顯示,HER-2基因CNVs為影響病人術(shù)后OS的獨立預(yù)后因素(HR=3.366,95%CI=1.412~8.021,P=0.006),與CNVs低表達者相比,CNVs高表達者死亡風(fēng)險更高。見表3。
圖1 87例胃癌病人HER-2基因CNVs生存分析函數(shù)圖
圖2 Ⅰ~Ⅱ期胃癌病人HER-2基因CNVs生存分析函數(shù)圖
圖3 Ⅲ~Ⅳ期胃癌病人HER-2基因CNVs生存分析函數(shù)圖
表2 各臨床病理特征與HER-2陽性胃癌病人術(shù)后OS的關(guān)系(例(χ/%))
表3 HER-2陽性胃癌病人獨立預(yù)后因素的多因素回歸分析
HER-2基因定位于人類染色體17q21,其蛋白是原癌基因C-erbB-2的表達產(chǎn)物,為酪氨酸激酶受體,屬于人表皮生長因子受體(EGFR)家族?;駽NVs與多種人類惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)。在腫瘤發(fā)生過程中,腫瘤增殖基因頻繁擴增,凋亡基因則擴增減少[9]。LABOTS等[10]對1 831例原發(fā)性胃癌樣本的研究結(jié)果表明,一些已經(jīng)明確或潛在的抗癌藥物基因靶點顯示出高水平的CNVs,包括HER-2、TUBB3、TOP2A。有研究結(jié)果顯示,HER-2蛋白表達陽性與Lauren分型中腸型胃癌相關(guān),同時也與腫瘤部位、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期顯著相關(guān)[3,11]。還有研究結(jié)果表明,HER-2基因擴增與較差的腫瘤臨床病理特征相關(guān),包括腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期[3,12]。本文研究結(jié)果顯示,HER-2基因CNVs與年齡和Lauren分型相關(guān)。
本研究生存分析結(jié)果顯示,HER-2基因CNVs與HER-2陽性胃癌病人術(shù)后OS有關(guān),且多因素Cox回歸分析提示HER-2基因CNVs是影響OS的獨立預(yù)后因素,CNVs高者死亡風(fēng)險更大。這與有關(guān)研究結(jié)果一致[7,13-14]。然而一項針對1 006例胃癌病人的研究結(jié)果顯示,在可手術(shù)的胃癌病人中,HER-2蛋白表達情況與預(yù)后無關(guān)[15]。研究結(jié)果不一致的原因可能與HER-2基因檢測方法、入組人群、研究樣本量等因素有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示,Lauren分型、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤程度(T分期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期均與胃癌病人OS相關(guān),但這些因素都不是獨立預(yù)后因素。
綜上所述,本研究表明HER-2基因CNVs可能成為一種新的預(yù)測胃癌預(yù)后的指標(biāo),然而確切的結(jié)論仍需要更大樣本量的前瞻性研究加以證實。