劉 璟，劉子琪，丁 黎，付步芳

(1．中國食品藥品檢定研究院，北京 102629；2．中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 211198)

動物源醫(yī)療器械產(chǎn)品指全部或部分采用動物組織制成的，或取材于動物組織、動物組織衍生物或由動物體自然獲取物質(zhì)制成的醫(yī)療器械產(chǎn)品。與非動物來源的材料相比，具有更好的生物相容性和生物活性等特點[1]，使得應(yīng)用領(lǐng)域越來越廣泛，原材料的種類也越來越多。根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局2017年發(fā)布的醫(yī)療器械產(chǎn)品分類目錄，動物源醫(yī)療器械產(chǎn)品主要有5 類，包括無源植入器械，如人工骨、心臟瓣膜、外科修復(fù)補(bǔ)片等；無源手術(shù)器械如膠原蛋白縫合線、羊腸縫合線；護(hù)理和防護(hù)器械，如膠原蛋白海綿、殼聚糖防黏連膜等；眼科器械，如脫細(xì)胞角膜植片、眼用透明質(zhì)酸鈉等；口腔科器械如生物膜、口腔修復(fù)膜等。

應(yīng)用動物源醫(yī)療器械受益的同時也面臨著兩大風(fēng)險：動物源材料特殊的免疫毒性風(fēng)險和供體本身所攜帶的病毒等危險性因子及其外源因子污染引起的安全風(fēng)險問題[1]。為有效降低動物組織帶來的免疫原性，動物源產(chǎn)品一般需要進(jìn)行脫細(xì)胞、去除雜蛋白等工序。異種產(chǎn)品相對非生物源產(chǎn)品更重視病原體帶來的傳播風(fēng)險，需要進(jìn)行嚴(yán)格的病毒滅活、滅菌處理。包括以上工序在內(nèi)的多種加工過程中產(chǎn)生的加工工藝殘留、滅菌殘留劑等物質(zhì)存在一定毒副作用，同時在醫(yī)療器械的應(yīng)用中，這些物質(zhì)均可能直接或通過相關(guān)介質(zhì)進(jìn)入人體[2-3]。上述醫(yī)療器械或材料在臨床使用過程中釋放出的物質(zhì)統(tǒng)稱為可瀝濾物。動物源產(chǎn)品可瀝濾物的研究為相關(guān)產(chǎn)品的生物學(xué)評價和毒理學(xué)風(fēng)險評估提供所必需的信息，并為產(chǎn)品開發(fā)及優(yōu)化提供支持。因此，對醫(yī)療器械的可瀝濾物研究既是企業(yè)在設(shè)計開發(fā)產(chǎn)品階段的研究熱點，也是當(dāng)下醫(yī)療器械監(jiān)管和相關(guān)產(chǎn)品技術(shù)審評關(guān)注的重點[4-5]。

1 動物源醫(yī)療器械可瀝濾物的監(jiān)管現(xiàn)狀

經(jīng)國家藥監(jiān)局醫(yī)療器械標(biāo)準(zhǔn)管理中心網(wǎng)站查詢，動物源醫(yī)療器械產(chǎn)品現(xiàn)行有效的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)有9 項，見表1(序號1～9)，與可瀝濾物相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)有3 項，見表1(序號10～12)，迄今為止尚無關(guān)于動物源醫(yī)療器械可瀝濾物具體檢測方法的國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。國家藥監(jiān)局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心先后發(fā)布《醫(yī)療器械已知可瀝濾物測定方法驗證及確認(rèn)注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》及《醫(yī)療器械未知可瀝濾物評價方法建立及表征技術(shù)審查指導(dǎo)原則》(征求意見稿)后，對醫(yī)療器械的可瀝濾物檢測和評價要求正式作為必需的注冊申報資料，大多數(shù)包括動物源在內(nèi)的醫(yī)療器械均需要進(jìn)行可瀝濾物的控制。但目前可瀝濾物的檢測分析和評價方法較少，因此有必要探索建立一套科學(xué)規(guī)范的醫(yī)療器械可瀝濾物的標(biāo)準(zhǔn)化檢測分析方法。

2 動物源醫(yī)療器械可瀝濾物的種類

動物源產(chǎn)品來源豐富，取材范圍廣泛、制備過程復(fù)雜、使用到有機(jī)溶劑等小分子物質(zhì)種類較多，因此，形成可瀝濾物的安全性風(fēng)險更高。確定動物源醫(yī)療器械可瀝濾物種類是建立可瀝濾物檢測分析方法的基礎(chǔ)，常見的可瀝濾物來源主要有以下幾個方面。

2.1 脫細(xì)胞

為降低動物源材料在生產(chǎn)加工過程中可能出現(xiàn)殘留的組織蛋白、抗原等物質(zhì)帶來的免疫原性風(fēng)險，一般會采取脫細(xì)胞、去除雜蛋白等方法[6]。其中，天然組織材料經(jīng)過脫細(xì)胞處理后，能夠顯著降低移植后排斥反應(yīng)的發(fā)生，同時保留原有的組織結(jié)構(gòu)和特性，材料表面微環(huán)境依然有利于細(xì)胞的生存。目前常用物理、化學(xué)和生物酶法等進(jìn)行脫細(xì)胞處理。在組織工程心臟瓣膜去除細(xì)胞的方法主要有：胰蛋白酶法、去垢劑-酶消化法、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)法和去氧膽酸鈉法等[7-10]。常用試劑如SDS可通過溶解細(xì)胞質(zhì)和核膜，破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間相互作用導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但SDS作為表面活性劑，當(dāng)其到達(dá)一定濃度會產(chǎn)生細(xì)胞毒性和溶血作用，因此需對其殘留量進(jìn)行嚴(yán)格限制[11-12]。周建偉等[13]研究了SDS的殘留量與細(xì)胞毒性的相關(guān)性，并得到對L-929 細(xì)胞和MC3T3-E1細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性的臨界濃度分別為4×10-3mg/mL 和6×10-3mg/mL。

2.2 交聯(lián)改性

為提高動物心臟瓣膜的穩(wěn)定性，顯著降低免疫原性，提高使用壽命，早在1968年Carpentier 就使用戊二醛(glutaric dialdehyde，GA)交聯(lián)處理異種生物組織瓣，1970年開始，GA交聯(lián)的牛心包材料制備的生物瓣膜已得到了推廣[14]。目前探索的天然交聯(lián)劑有去甲二氫愈創(chuàng)木酸、單寧酸等，化學(xué)試劑有碳化二亞胺等。因為GA 具有水溶性、價格便宜等優(yōu)點，其為最先使用并且最常用的交聯(lián)劑[15]。汪希銘等[16]將殼聚糖基納米纖維膜經(jīng)GA 交聯(lián)處理后，穩(wěn)定性得到明顯改善，并且一定程度上提升了纖維膜強(qiáng)度和韌性。此外目前對脫細(xì)胞真皮基質(zhì)等產(chǎn)品也常用GA 進(jìn)行交聯(lián)改性。然而，GA 具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，GA交聯(lián)制備的生物瓣因GA緩慢而微量的釋出仍可引起細(xì)胞毒性，此外，生物瓣在體內(nèi)的鈣化也與GA 交聯(lián)有關(guān)[17]。因此在實際應(yīng)用中，醛類交聯(lián)產(chǎn)品可以根據(jù)所需的性能來選擇最優(yōu)的交聯(lián)劑用量，并需要對醛殘留量進(jìn)行嚴(yán)格控制和檢測。

2.3 病毒滅活及滅菌

動物病原感染人早已引起社會各界的關(guān)注，禽流感、狂犬病等給人類帶來不同程度的危害。動物源產(chǎn)品來源于動物的骨、皮膚、肌腱等組織，因此需要格外重視病毒滅活和滅菌工序，除需要滿足《YY/T 0771 動物源醫(yī)療器械》等標(biāo)準(zhǔn)要求外，還要重視保護(hù)生產(chǎn)操作人員和環(huán)境以免造成污染[18]。常見工藝中，如環(huán)氧乙烷滅活法在骨材料中的應(yīng)用，但現(xiàn)在應(yīng)用較少；過氧乙酸-乙醇滅活法在皮膚、骨等材料中均有較好的應(yīng)用；此外，過氧化氫滅活法也被廣泛應(yīng)用于骨、膠原材料中。研究發(fā)現(xiàn)[19-20]對牛腱片樣品經(jīng)3%過氧化氫溶液處理后，水皰性口炎病毒、甲型H1N1病毒的滅活對數(shù)值均大于4，馬來源的皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨顆粒及心包膜材料經(jīng)3%過氧化氫溶液處理后的所有生物材料均表現(xiàn)出完全消除病毒感染性，單純皰疹病毒、甲型H1N1病毒和柯薩奇病毒滅活對數(shù)值均大于4，即表明過氧化氫滅活病毒后的產(chǎn)品質(zhì)量安全可靠。但病毒滅活的同時會對生物材料性能造成不同程度的損害，白玉龍等[19]研究表明過氧乙酸、過氧化氫、環(huán)氧乙烷等殘留也會對人體產(chǎn)生危害，甚至?xí)鹬掳⒅禄?/p>

動物源產(chǎn)品及其原材料在貯存、生產(chǎn)及使用等過程中產(chǎn)生的各種化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)產(chǎn)物等也需要被考慮，如2-氯乙醇為環(huán)氧乙烷滅菌過程中衍生的有機(jī)物質(zhì)。經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌的產(chǎn)品可能仍殘留一定量2-氯乙醇[20]。對于絕大多數(shù)國內(nèi)醫(yī)療器械產(chǎn)品的注冊檢驗，2-氯乙醇仍是非強(qiáng)制性檢測項目，但已有廣泛的研究表明2-氯乙醇的檢測需要被重視[21]。

3 動物源醫(yī)療器械浸提液的制備方法

可瀝濾物的分析方法一般包括浸提液制備和可瀝濾物的檢測方法兩部分。大部分動物源器械特別是長期植入類器械，很難獲得臨床實際使用時的研究數(shù)據(jù)，所以很多情況下可選擇浸提方式制備浸提液，從而完成對可瀝濾物的研究。由于動物源醫(yī)療器械種類繁多，因此用于可瀝濾物檢測的浸提液制備方法也各有不同。浸提液制備的研究主要包括：浸提介質(zhì)的選擇，樣品浸提部位的選擇，浸提方式的選擇，浸提條件的選擇。

3.1 浸提方式與浸提樣品的選擇

常用的浸提方式包括加速浸提、模擬浸提、極限浸提和加嚴(yán)浸提，極限浸提可建立從醫(yī)療器械或材料中浸提的最大可浸提物的量，即醫(yī)療器械或材料在臨床使用壽命期間可能釋放的可瀝濾物量的最大量。動物源醫(yī)療器械屬于持久接觸或長期接觸類器械，很難模擬實際使用條件，所以一般選擇極限浸提。此外，可根據(jù)實際情況選擇除浸提外的其他方式，如李麗花等[22]研究中由于正己烷不溶于水，而采用無機(jī)酸溶液進(jìn)行樣品前處理后再用靜態(tài)頂空氣相色譜法檢測了其中的有機(jī)溶劑殘留量，對于揮發(fā)性物質(zhì)的研究可參考采用此法。

浸提樣品與浸提方式的選擇是相輔相成的[23]。浸提樣品優(yōu)先選擇最終產(chǎn)品，或根據(jù)代表性部分的浸提結(jié)果推算出整個樣品的結(jié)果。若終產(chǎn)品無法滿足浸提要求，可采用相同原材料在相同工藝條件下加工成的半成品來完成浸提；若含有多種材料，選取的樣品中每一組分占樣品的比例需要與此組分占被測產(chǎn)品的比例相同。

3.2 浸提介質(zhì)的選擇

對于某些臨床使用中僅接觸單一液體體系的產(chǎn)品，可采用該臨床接觸液體作為浸提介質(zhì)，對于無法模擬的介質(zhì)，或者當(dāng)已知可瀝濾物易與介質(zhì)發(fā)生反應(yīng)從而造成干擾時，可選擇替代溶劑。其中，在水能溶解的情況下，以水做溶劑可以更好地模擬材料植入人體情況。替代溶劑應(yīng)根據(jù)可瀝濾物特征進(jìn)行選擇，且不應(yīng)與待測物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，同時應(yīng)考慮器械在臨床接觸介質(zhì)的性質(zhì)等，除此之外，材料本身的性能也應(yīng)被考慮。如因生物補(bǔ)片與SDS結(jié)合的化學(xué)鍵比較牢固，使得難以檢出全部的SDS殘留，若用氫氧化鈉或硫酸降解生物補(bǔ)片則會使SDS發(fā)生不可逆的化學(xué)變化，所以亞甲基藍(lán)法不能直接用于檢測SDS殘留。而碳酸鈉可以競爭性地與生物補(bǔ)片中的蛋白質(zhì)結(jié)合，從而能夠使SDS游離出來，同時甲醇產(chǎn)生的界面聚集能夠加速游離[12]，因此可采用甲醇-碳酸鈉混合液作為浸提介質(zhì)。

3.3 浸提條件的選擇

浸提體積的選擇在保證浸提液能夠完全浸沒樣品的基礎(chǔ)上盡量減少，同時也需防止被浸提物質(zhì)因濃度過大而飽和。此外可根據(jù)樣品面積或質(zhì)量比例加入浸提液進(jìn)行浸提，如脫細(xì)胞異種皮膚、可吸收醫(yī)用膜等規(guī)則片狀結(jié)構(gòu)產(chǎn)品，通常在考慮樣品厚薄的基礎(chǔ)上，按樣品表面積等比例加入溶劑，同時需要根據(jù)樣品臨床應(yīng)用部位確定按照單面或雙面表面積計算。

對于浸提溫度和時間，應(yīng)盡可能模擬臨床實際情況，如提高溫度應(yīng)避免使材料和目標(biāo)可瀝濾物發(fā)生化學(xué)變化；另外浸提比例、是否振蕩、攪拌，循環(huán)、超聲等都是需要結(jié)合具體產(chǎn)品要考慮的問題。選用的浸提條件均需要嚴(yán)于或等于產(chǎn)品在預(yù)期使用中帶給患者的最大風(fēng)險下的條件。如王麗等[24]測定豬心臟瓣膜假體中GA殘留量時，實驗顯示48 h和72 h后仍能檢測出GA殘留，即證明在此產(chǎn)品中GA會持續(xù)被浸提，因此需要結(jié)合產(chǎn)品臨床實際使用情況選擇合適條件。

4 動物源醫(yī)療器械可瀝濾物的檢測方法

根據(jù)動物源醫(yī)療器械產(chǎn)品中擬研究物質(zhì)的理化性質(zhì)、浸提溶劑等因素，合理篩選建立合適的測定方法進(jìn)行定性定量研究，同時還應(yīng)考慮方法的檢驗精度是否滿足安全性評價的要求。醫(yī)療器械的可瀝濾物根據(jù)研究目標(biāo)不同，可分為根據(jù)相關(guān)信息識別的已知可瀝濾物和根據(jù)未知可瀝濾物研究體系鑒別的未知可瀝濾物。已知可瀝濾物通常為調(diào)研工廠產(chǎn)品制備工藝獲得的加工過程中所涉及的物質(zhì)，而未知可瀝濾物可能是包裝遷移物質(zhì)、加工助劑中雜質(zhì)或降解產(chǎn)物等。

4.1 已知可瀝濾物檢測方法

在動物源產(chǎn)品中已知可瀝濾物檢測方法的選擇上，優(yōu)先選用藥典、標(biāo)準(zhǔn)等公布的已有檢測方法，并根據(jù)浸提液特點確定是否需要調(diào)整和優(yōu)化。對新方法進(jìn)行驗證可參考《醫(yī)療器械已知可瀝濾物測定方法驗證及確認(rèn)注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 0962整形手術(shù)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠給出了交聯(lián)劑1,4 丁二醇二縮水甘油基醚(1,4-butanediol diglycidyl ether，BDDE)殘留量測定的方法，付海洋等[25]則改進(jìn)和優(yōu)化了BDDE含量的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。在氣相色譜法中，首先對樣品的酶解處理以使BDDE 更好地從凝膠內(nèi)部釋放，并選用乙酸乙酯對BDDE 進(jìn)行萃取。此外，使用酶標(biāo)儀檢測法，將透明質(zhì)酸酶添加到標(biāo)準(zhǔn)溶液中能夠去除透明質(zhì)酸酶對測定結(jié)果的影響。

對于無標(biāo)準(zhǔn)檢測方法的可瀝濾物，需要根據(jù)待測物質(zhì)的理化性質(zhì)、浸提選用溶劑等選擇合適的檢測分析方法并進(jìn)行方法學(xué)驗證及確認(rèn)工作。此外，需要考慮分析方法的系統(tǒng)適應(yīng)性，如適用于色譜法檢測，通常需根據(jù)待測物沸點、極性等性質(zhì)建立色譜方法，優(yōu)化色譜柱類型、分流比、流速等以優(yōu)化目標(biāo)物質(zhì)理論塔板數(shù)、拖尾因子和分離度等系統(tǒng)適應(yīng)性指標(biāo)。常用的分析技術(shù)包括氣相色譜、液相色譜、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、電感耦合等離子體光譜分析技術(shù)(inductively coupled plasma spectrometer，ICP-Spectroscopy)等。其中氣相和液相色譜及質(zhì)譜主要用于分析有機(jī)可瀝濾物，電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(inductively coupled plasma optical emission spectrometer，ICPOES)和電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)等主要用于分析元素可瀝濾物。對于同一待測物質(zhì)也可采用不同檢測方法進(jìn)行驗證比較。如葛翠蘭等[26]建立了高效液相色譜測定交聯(lián)劑二乙烯基砜(divinyl sulfone，DVS)殘留測定的測定方法，但前期樣品處理較繁瑣，朱彬等[27]則采用氣相色譜法測定DVS殘留量，對比可得該方法樣品制備簡單，取樣量少。

4.2 未知可瀝濾物的檢測方法

隨著現(xiàn)代分析技術(shù)及評價理念的優(yōu)化，以未知可瀝濾物評價體系為基礎(chǔ)的可瀝濾物研究表征體系已成為醫(yī)療器械化學(xué)表征的重要組成部分。未知可瀝濾物的檢測與已知可瀝濾物測定的最大不同在于首先要對可瀝濾物進(jìn)行定性，因此需要一套確實可信而且有證據(jù)的多種分析技術(shù)的聯(lián)合體系，例如色譜法與多種檢測儀器結(jié)合、核磁共振和其他光譜技術(shù)等。采用未知可瀝濾物掃描模式以盡可能地識別所有潛在的可瀝濾物且能夠為浸提物鑒別提供足夠的信息，同時可進(jìn)行半定量或定量分析。此外，不同分析技術(shù)獲得的結(jié)果還可以用于相互印證。將未知可瀝濾物轉(zhuǎn)化為已知可瀝濾物檢測后，即可采用上述已知可瀝濾物檢測方法開展可瀝濾物定量檢測。如盧大偉等[28]根據(jù)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對透明質(zhì)酸鈉凝膠中未知?dú)埩粑镞M(jìn)行檢測分析，并對比毒理學(xué)數(shù)據(jù)和國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)討論其危害，首次發(fā)現(xiàn)醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠產(chǎn)品中甲醇、二甲苯和乙苯的殘留，并建立了合適的方法對3種殘留物進(jìn)行定性及定量。

5 可瀝濾物允許限量的確定方法

可瀝濾物允許限量的確定是通過文獻(xiàn)評審或毒理學(xué)試驗等確定可瀝濾物在預(yù)期用途下的人體可耐受的量，并通過患者體質(zhì)量、應(yīng)用因子等數(shù)據(jù)獲得允許限量數(shù)據(jù)。目前，國家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T16886.17-2005 醫(yī)療器械生物學(xué)評價第17 部分：可瀝濾物允許限量的建立》規(guī)定了醫(yī)療器械可瀝濾物允許限量的確定方法，其目的是獲得標(biāo)準(zhǔn)的運(yùn)用及未建立標(biāo)準(zhǔn)的限量的適當(dāng)評估。該標(biāo)準(zhǔn)由國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 10993-17：2002[29]等同轉(zhuǎn)化。此外，可結(jié)合美國環(huán)境保護(hù)署(U.S. Environmental Protection Agency，EPA)公開的毒理學(xué)數(shù)據(jù)建立可瀝濾物的允許限量。對于無明確毒理學(xué)數(shù)據(jù)的可瀝濾物，采用毒理學(xué)關(guān)注閾值(threshold of toxicological concern，TTC)的評價方法確定可瀝濾物的允許限量?？蔀r濾物允許限量的確定，動物源產(chǎn)品中毒害物質(zhì)產(chǎn)生的確定才能夠被量化，從而才能完成動物源產(chǎn)品的安全性評價[30]。此外，也需要不斷更新和改進(jìn)評估方法，以適應(yīng)新的科學(xué)和技術(shù)發(fā)展，提高醫(yī)療器械和藥品的安全性。

6 總結(jié)與展望

隨著新型醫(yī)療器械產(chǎn)品不斷涌現(xiàn)和現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，動物源醫(yī)療器械產(chǎn)品應(yīng)不斷完善，從產(chǎn)品生產(chǎn)全過程進(jìn)行質(zhì)量控制，最大程度抑制相關(guān)產(chǎn)品在生產(chǎn)等過程中可能產(chǎn)生的風(fēng)險，提升產(chǎn)品的質(zhì)量，才能夠更好地保證相關(guān)產(chǎn)品的安全性和有效性。

雖然不同種屬及不同用途的動物源產(chǎn)品在質(zhì)量控制上有差異，但本文對動物源醫(yī)療器械可瀝濾物的分類匯總、動物源產(chǎn)品浸提液制備、可瀝濾物檢測方法及可瀝濾物允許限量的確定的梳理是評價其安全有效的關(guān)鍵內(nèi)容。動物源醫(yī)療器械可瀝濾物檢測技術(shù)研究的難點及關(guān)鍵點在于將未知可瀝濾物轉(zhuǎn)化為已知可瀝濾物檢測的過程。動物源可瀝濾物檢測分析技術(shù)需進(jìn)一步探索，還應(yīng)在該類產(chǎn)品的質(zhì)量控制中引入更先進(jìn)的分析手段，探索相關(guān)的新技術(shù)、新工具、新方法、形成新標(biāo)準(zhǔn)，研制相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，搭建醫(yī)療器械的可瀝濾物檢測平臺，才能夠改觀我國動物源醫(yī)療器械可瀝濾物檢測分析方法匱乏的局面，從而為監(jiān)管部門提供方法技術(shù)科學(xué)支撐，為相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量控制提供標(biāo)準(zhǔn)方法。