苑曉燕，殷 健，范瑞祺，張婉君，彭雙清，趙 君，

(1．中國人民解放軍疾病預防控制中心，北京 100071；2．康龍化成/北京生物技術有限公司，北京 101100)

有害結局路徑(adverse outcome pathway，AOP)框架作為新開發(fā)的毒理學評價工具，是對現(xiàn)有知識的概括和匯總，它將生物不同結構水平間的關聯(lián)信息與實驗測試、計算預測甚至是因果推理的結果充分整合，為發(fā)展和優(yōu)化化學物分類方法、提出優(yōu)先的體內(nèi)/體外靶向測試提供了一個顯而易見的基于作用機制的工作框架，對化學物有害效應和健康風險評估具有指導意義。本文整理、匯總了近年來AOP在毒性評價與風險評估領域中的應用案例與研究進展，希望為廣大學者提供利用AOP解決毒理學問題的新思路。

1 AOP的定義及其對于毒性評價與風險評估的意義

AOP 是根據(jù)已有知識來描述一個直接的分子起始事件(molecular initiating event，MIE)與在生物不同結構水平(如亞細胞、細胞、組織、器官、個體、群體)所出現(xiàn)的與風險評估或管理決策相關的有害結局(adverse outcome，AO)之間的因果聯(lián)系，串聯(lián)起其中因果關系的事件又被稱為關鍵事件(key event，KE)[1]。AOP作為一種方法學手段，為收集、整理和評估化學物質(zhì)的化學、生物學和毒理學效應的有關信息提供了一個有效的方法學框架。在這個框架中，現(xiàn)有的知識被匯總和關聯(lián)起來，有助于確定風險評估中關鍵的不確定性和研究的優(yōu)先順序，并為在毒理學和風險評估中更多地使用預測方法提供了基礎。

盡管AOP的概念及框架較為復雜，但經(jīng)評審通過的AOP能極大促進毒理學研究和簡化化學品風險評估流程。AOP主要通過證據(jù)權證(weight of evidence，WOE)的方法總結現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)而建立，因此對于經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)認可和發(fā)布的AOP來說，這些AOP中每個關鍵事件均可識別或可檢測，同時它們之間具有可靠的因果關系。當對目標化合物進行毒理學研究或風險評估時，研究人員僅需對涉及該化合物的AOP中有限的關鍵事件展開試驗即可推斷出最終的有害結局，因此可以極大減少實驗數(shù)量[2]。另一方面，可以根據(jù)已建立的AOP 從分子或細胞水平的毒性事件推斷出器官、個體或種群水平的毒性事件，而分子或細胞水平的毒性事件可通過計算機模擬(in silico)和體外試驗進行預測或檢測，這種檢測手段費用低、周期短且符合3R原則[3]。因此，AOP推廣和應用的終極目標是實現(xiàn)風險評估的預測。

對于毒性評價與風險評估而言，AOP的意義在于：①有助于科研人員和管理人員開展合作；②從多種來源系統(tǒng)地整合已有的機制信息和數(shù)據(jù)，有助于在不同生物組織水平理解有害效應的毒理學進程；③有助于開展假設驅(qū)動的毒性測試、識別風險評估中的不確定性和確定今后研究的優(yōu)先順序；④為化學物基于結構-活性關系分類提供支持，減少測試需求；⑤有效的將體外測試的數(shù)據(jù)用于決策制定。可以說，作為一個知識、信息鏈，AOP有效地構筑起了非動物測試替代方法與管理、預測毒理學之間的橋梁。

2 AOP在毒性評價中的應用進展

2.1 AOP可用于毒性測試方法的開發(fā)與改進

通過識別和描述關鍵事件，AOP 可以為測試指南計劃(test guidelines programme)提供研發(fā)信息。當關鍵事件被確定后，就可以在細胞水平或更高生物組織水平上開發(fā)檢測直接化學效應/反應的體外或離體實驗方法，以及檢測MIE相關靶點的篩選分析方法。2016年OECD審議通過了皮膚致敏的AOP框架來闡釋皮膚過敏反應過程[4]。在該AOP 中，皮膚致敏過程包括致敏階段和隨后的免疫反應激發(fā)2 個階段。第1 階段包括了一系列KE，其中MIE(或KE-1)是具有親電作用的外源化合物與表皮蛋白質(zhì)親核位點的共價結合，形成半抗原。隨后觸發(fā)了細胞水平的KE，即角質(zhì)細胞炎癥反應(KE-2)，其下游或同時發(fā)生的另一個細胞水平的KE 是樹突狀細胞的激活(KE-3)。接著，活化的樹突狀細胞遷移至局部淋巴結，將半抗原復合物呈遞至T淋巴細胞，最終導致記憶T 細胞的增殖和分化這一KE(KE-4)的發(fā)生。當皮膚再次接觸化學物時進入激發(fā)階段，導致過敏性接觸性皮炎發(fā)生。在此基礎上，開發(fā)了針對KE-1 的直接多肽結合試驗(DPRA，OECD 442C)、針對KE-2 的KeratinoSensTM試驗和LuSensTM試驗(OECD 442D)以及針對KE-3 的h-CLAT 試驗、U-SENTM試驗、IL-8 Luc試驗(OECD 442E)已被OECD測試指南采納為標準方法[4]。

2017年新修訂的REACH 法規(guī)指出，需要對上述每個KE(KE-1、KE-2 和KE-3)分別進行檢測才能完成對皮膚致敏終點效應的評價。但同時又指出如果已有1～2個關鍵事件的數(shù)據(jù)足以進行風險危害評估，則不需要再進行其他關鍵事件的試驗[5]。隨著AOP 的不斷應用，越來越多的科研機構和學術團體正在探索AOP在該領域的應用。

2.2 AOP可用于有害物質(zhì)的危害識別和生物標志物預測

風險評估由危害識別、危害特征描述、暴露評估和風險特征描述4個核心步驟組成。危害識別是風險評估的第一步，用以確定化學品是否會導致有害效應。該過程對毒性效應、毒性機制和毒性物質(zhì)進行描述，并考慮化合物代謝及相互作用[6]。危險識別的關鍵組成部分包括分析作用模式(mode of action，MOA)和評估證據(jù)權重(weight of evidence，WOE)[7]。AOP 框架從化學品與受體、酶或其他生物分子的相互作用(分子起始事件)到有害結局等層面系統(tǒng)地構建了關鍵事件級聯(lián)信息，提供了直觀的危害識別，有助于化學品風險評估[7-8]。

除此之外，AOP還可以通過數(shù)據(jù)庫比對等方法發(fā)掘生物標志物，從而提供支持化學安全評估所需的機制細節(jié)，目前已有一些研究采用AOP 對不同化學物質(zhì)的共有生物標志物進行預測，例如Lee等[9]發(fā)現(xiàn)苯并芘、硒和納米氧化銀在水環(huán)境中具有共有的生物標志物和作用位點，Reinwald 等[10]發(fā)現(xiàn)3,3′,5-三碘甲狀腺氨酸(T-3)和甲狀腺過氧化物酶抑制劑6-丙基-2-硫脲嘧啶(6-PTU)可作為化學物對斑馬魚的內(nèi)分泌干擾的潛在生物標志物。Inoue等[11]使用代謝組學的標志物預測空氣污染對出生結局的影響。這些例子表明AOP可為生物標志物的篩選提供強有力的輔助和支持。

2.3 AOP有助于跨物種毒性評價和劑量外推

毒理學風險評估，一般根據(jù)高劑量給藥的動物研究結果，結合人類暴露評估，通過不確定性系數(shù)或線性外推來評價特定化學品暴露的安全性[12]?？缥锓N外推是化學品風險評估的基礎，也是風險評估中長期存在的不確定性。對于人類健康風險評估，通常是從研究充分的嚙齒動物模型中外推到人類。對于生態(tài)風險評估，是從不同分類的少數(shù)模式動物中獲得的毒性數(shù)據(jù)外推到整個環(huán)境中的生物。物種外推有兩種方法，最基本的方法是使用安全系數(shù)法來解釋物種敏感性的潛在差異。另一種方法是使用物種敏感性分布(species sensitivity distributions，SSDs)對潛在生態(tài)風險進行概率預測。其中，敏感性分布方法更為嚴謹，但要求較高的科學置信度和可靠的劑量-效應關系[13]，對于這種越來越嚴格的要求，近年來又誕生了能夠同時滿足定性和定量要求的定量AOP(quantitative adverse outcome pathway，qAOP)模型。qAOP 的提出有助于SSDs 方法的完善，并可幫助確定物種間外推不確定性系數(shù)的大小[14]。此外，進行跨物種外推時，除了應關注已測試的物種外，還應關注其他敏感物種，而AOP框架可用于確定需要關注的敏感物種[15]。以上進展表明，AOP框架可從作用機制和量效關系兩個方面幫助實現(xiàn)跨物種評價和劑量外推。

2.4 AOP有助于毒性測試的篩選和優(yōu)先級設置

優(yōu)先級設置是應對大量化學品毒性測試中亟待解決的毒理學問題。優(yōu)先排序和毒性測試篩選旨在識別給定暴露濃度下可能導致有害結果的化學品，以便對其進行更深入的測試。優(yōu)先排序和毒性測試篩選通常使用體外測試來評估化學品造成內(nèi)分泌干擾、神經(jīng)毒性或皮膚致敏等效應的潛力[8]。在優(yōu)先級排序中，首先篩選出具有可測量生物活性的物質(zhì)，然后將篩選中被判定為陽性的物質(zhì)從低效到高效進行排序，并根據(jù)其暴露邊界比(margin of exposure，MOE)進行加權，最有效或最小MOE 的化學品具有最高優(yōu)先級，然后進行更深入的評估或測試[16]。AOP有助于化學品測試優(yōu)先級的設置，在AOP框架下對化學品進行篩選，可確定它們是否有可能觸發(fā)特定的、可測量的生物反應，這些生物學反應可能與一個或多個MIEs、KEs或AOs有關。被確定具有不可接受的風險、導致AO 的化學品會根據(jù)其效力進行排序，其中效力最強的物質(zhì)會獲得最高優(yōu)先級，被進行更深入的測試或評估[17]。此外，AOPs有助于根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)的完整性確定關鍵數(shù)據(jù)缺口，隨后設計基于作用機制的分層測試策略。美國EPA 內(nèi)分泌干擾物篩查計劃(endocrine disruptor screening program，EDSP)，在一定程度上體現(xiàn)了基于作用機制的測試原則在優(yōu)先級設置中的應用。

2.5 AOP可用于化學物質(zhì)的劑量-反應評價

除了通過MIE 和KE 幫助毒性評價確定敏感位點外，AOP框架還可通過與化學數(shù)據(jù)相結合，應用于特定化學品的劑量-反應評估[18]。在AOP框架下，研究人員可對MIE，KE或AO等不同層級的毒性終點分別進行劑量-反應評價，從而預測混合物的毒性劑量-反應關系[19]，目前已有部分基于AOP 框架對混合物劑量-反應關系的研究[20]。此外，qAOP的出現(xiàn)也促進了AOP從單純定性評價轉(zhuǎn)向定性和定量同時評價。Doering等[21]采用qAOP 模型預測芳香受體激動劑對鳥類和魚類早期生命階段死亡率的定量影響，而Villeneuve等[22]使用體外芳香化酶抑制數(shù)據(jù)預測了成年雌性魚的短期體內(nèi)劑量-反應關系，盡管目前qAOP的應用還缺乏統(tǒng)一的標準，但是其在劑量-反應關系的預測等方面具有巨大潛力[23]。

3 AOP在風險評估中的應用進展

3.1 AOP可用于風險評估策略的整合與優(yōu)化

目前，待評價的化學品數(shù)量龐大，風險評估面臨艱巨挑戰(zhàn)，這要求用于監(jiān)管的毒性測試手段要更加經(jīng)濟、高效。為實現(xiàn)這一目標，需要更合理地調(diào)配測試資源，聚焦于最受關注的化學物、最可能的作用位點及最敏感的物種。整合測試策略(integrated test strategy，ITS)或整合測試與評估策略(integrated approaches to testing and assessment，IATA)為上述測試理念提供了實際解決方案。同時，AOP框架的發(fā)展可提供MIE、KE和受到監(jiān)管關注的AO 的因果關系信息，又可促進上述策略的發(fā)展，并為監(jiān)管決策制定提供生物學背景。

對于任何給定的毒性終點來說，AOP可以作為建立針對該終點的IATA或ITS的基礎。AOP有助于確定所需的進一步信息(或?qū)嶒?，提高起始事件與有害結局關聯(lián)的確定性[24]。此外，一個構建完善的AOP 也可以用于種屬間的比較。目前ITS在皮膚致敏測試中得到了較為廣泛的應用。皮膚致敏ITS 著重于皮膚致敏AOP 中的關鍵事件，基于非測試方法(計算機算法或構效模型)和測試方法(標準化方法或非標準化方法)，通過不同的組合方式以提高皮膚致敏預測的準確度、靈敏度和特異度。例如，研究人員將非動物試驗的化學物辛醇水分配系數(shù)、表皮生物利用度、直接肽反應試驗、KeratinoSensTM試驗、U-SENTM試驗和動物局部淋巴結試驗(LLNA)、豚鼠最大化試驗(GPMT)或Buehler試驗(BT)數(shù)據(jù)以及計算機模擬的數(shù)據(jù)組合起來，以涵蓋皮膚致敏AOP中各階段生物效應的數(shù)據(jù)，從而建立皮膚致敏性評價的整合測試策略[25]。

隨著評估策略的發(fā)展，基于ITS 的皮膚致敏測試也呈現(xiàn)出了多種組合方式，包括測試組合、權重分析、分層策略以及其他ITS 方法等[26]。此外，基于貝葉斯網(wǎng)絡等新手段的皮膚致敏組合測試策略應用軟件也在開發(fā)當中[27]。目前除皮膚致敏性測試外，其他毒性測試也逐漸開始采用ITS 策略[28]。隨著ITS 與IATA 的不斷完善，AOP 也會在其中發(fā)揮越來越重要的作用，為風險評估策略的整合與優(yōu)化提供更多的幫助。

3.2 AOP可用于風險評估中的敏感性預測

傳統(tǒng)的化學物毒性測試往往基于特定動物模型，使得毒性測試結果可能存在種屬特異性，因此物種間的敏感性預測至關重要。近年來，AOP概念已被用于不同物種對某一化學物(如殺蟲劑)毒性敏感性的預測，如Lalone等[29]比較了電壓門控類鈉通道(VGSC)α亞基的相似性和不同生態(tài)物種的敏感性，Pottenger等[30]利用AOP 預測了3 種潛在致癌物在大鼠和人體內(nèi)致癌性的關聯(lián)，Khan等[31]嘗試使用雙殼類動物模型中的生物標志物預測環(huán)境與人類健康風險。以上實例說明當特定物種毒性測試缺失或無法進行毒性測試時，AOP可用來進行敏感性預測。

AOP在敏感性預測中的應用說明AOP可以提供一種基于毒性通路的毒理學框架來支持危險評估和監(jiān)管決策。而這種對監(jiān)管決策的支持很大程度上依賴于AOP 構建過程中的科學置信度，這種科學置信度有助于特定用途的應用。然而，不論AOP是否完整且高度可信，它們對決策監(jiān)管依然具有一定的參考價值，且仍可用于特定的用途。

3.3 AOP有助于定量結構活性關系分析和交叉參照

現(xiàn)實中往往存在著現(xiàn)有化學品信息不足以支撐決策建立的情況，針對這種情況，諸如定量結構活性關系分析(quantitative structure-activity relationship，QSAR)等的計算機方法應運而生[32]，這些計算方法可在產(chǎn)生新數(shù)據(jù)之前，優(yōu)先通過交叉參照方法(read-across)對與結構相關化學品的數(shù)據(jù)合并[33]。交叉參照指的是通過一個(或多個)化合物的信息預測另一個(或多個)具有相似特性的化合物的對應信息，從而起到替代測試的作用[34]。SEURAT-1 項目(Safety Evaluation Ultimately Replacing Animal Testing)舉辦的研討會討論了AOP在交叉參照方面的應用，其目的是通過使用替代方法的結果以提高交叉參照方法的可信度[35]。具體而言，交叉參照方法的判定應該基于對毒性和毒代動力學機制的理解，并通過體外數(shù)據(jù)得到加強，而AOP的構建有助于加強這種理解，并加強交叉參照化學品數(shù)據(jù)的可信性。此外，根據(jù)對一系列案例研究的評估，歐洲化學理事會也得到類似的觀點，即高置信度的AOP可對證據(jù)和數(shù)據(jù)的支持起到重要作用[36]。在實際應用方面，用于皮膚致敏的AOP 目前已被OECD組織認證并被納入QSAR工具箱[37]，在此基礎上，該AOP還被用于輔證綜合測試策略，并廣泛用于QSAR 和交叉參照效果的評估，這也充分體現(xiàn)了AOP的開發(fā)有助于此類非測試方法的應用與發(fā)展。

4 總結與展望

自2007年誕生以來，AOP這一新興的毒理學框架在國內(nèi)外蓬勃發(fā)展，不少研究人員開展了將AOP 應用于毒性預測的嘗試，并將AOP的研究與發(fā)展不斷深入，還進一步嘗試將AOP與劑量外推，評估策略整合優(yōu)化等領域。

然而目前AOP的發(fā)展還處于初期階段，將AOP應用于毒性評價和風險評估仍有許多困難，例如量化劑量-反應關系、建立合適的毒代動力學模型、從體外系統(tǒng)生物學效應數(shù)據(jù)外推預測體內(nèi)AO、從定性AOP 過渡到定量AOP、建立透明化評價體系等。對此，歐美國家已進行將AOP 和決策制定相結合的嘗試：例如歐盟EU-TOXRISK項目就致力于建立基于AOP，整合多學科的新型毒理學安全評價方法，重點開展重復給藥的系統(tǒng)毒性和生殖發(fā)育毒性研究[38]。美國EPA 的21 世紀毒理學測試(Toxicology Testing in the 21stCentury，Tox21)則應用AOP框架進行EDSP，旨在通過計算機模型和基于體外細胞培養(yǎng)的高通量篩選模型等最新技術分層收集內(nèi)分泌干擾物的信息，優(yōu)化法規(guī)決策，提高測試的效率和通量，并降低安全評價成本[39]。相比之下，我國在這方面仍處于學習和起步階段，需要更多的發(fā)展與推廣。相信在AOP框架下，隨著人體生命科學毒性機制及其網(wǎng)絡的闡明，以及全球性多學科技術的融合，勢必給毒性評價和風險評估新體系的建立帶來新的契機。