王艷麗 梁秀清 陳倩倩 李芳芳 李潔 陳克云 田其燕 李霞 劉艷明

摘 要：選取通過式固相萃取技術(shù)，結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS），建立動物源性食品中11 種N-亞硝胺類化合物的分析方法。樣品加水浸泡后采用乙腈提取，經(jīng)Prime HLB通過式固相萃取柱（200 mg/6 mL）快速凈化，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式監(jiān)測，以空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：11 種N-亞硝胺類化合物在0.5～500.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 4～0.999 8，檢出限為0.2～0.3 μg/kg，定量限為0.5～1.0 μg/kg；在1、4、10 μg/kg 3 個加標(biāo)水平下，11 種N-亞硝胺類化合物平均加標(biāo)回收率為80.1%～97.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%～8.8%；該方法提取及凈化時間僅需15 min/樣品，與GB 5009.26—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中N-亞硝胺類化合物的測定》方法相比，提取與凈化時間大幅縮短，檢測效率提升10 倍，可實(shí)現(xiàn)動物源性食品中N-亞硝胺類化合物的快速測定。

關(guān)鍵詞：動物源性食品；通過式固相萃?。豢焖賰艋?；氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；N-亞硝胺類化合物

Determination of Eleven N-Nitrosamines in Animal Derived Foods by Gas Chromatography-Tandem

Mass Spectrometry after Pass-through Solid Phase Extraction

WANG Yanli， LIANG Xiuqing， CHEN Qianqian， LI Fangfang， LI Jie， CHEN Keyun， TIAN Qiyan， LI Xia， LIU Yanming*

（Shandong Research Center of Engineering and Technology for Safety Inspection of Food and Drug， Key Laboratory of Supervising Technology for Meat and Meat Products for State Market Regulation， Shandong Institute for Food and Drug Control， Jinan 250101， China）

Abstract： A method was developed for the determination of 11 N-nitrosamines in animal derived foods by pass-through solid phase extraction coupled to gas chromatography-tandem mass spectrometry （GC-MS/MS）. The rehydrated samples were extracted with acetonitrile and rapidly purified by using a Prime HLB solid phase extraction column （200 mg/6 mL）. The target compounds were detected in the multiple reaction monitoring （MRM） mode， and quantified by the matrix matched external standard method. The calibration curves for the 11 N-nitrosamines were linear in the concentration range of 0.5–500.0 ng/mL，

with correlation coefficients of 0.999 4–0.999 8. The limits of detection （LODs） and the limits of quantitation （LOQs） were 0.2–0.3 and 0.5–1.0 μg/kg， respectively. The average recoveries at spiked levels of 1， 4 and 10 μg/kg ranged from 80.1% to 97.4%， and the relative standard deviations （RSDs） were between 2.3% and 8.8%. The extraction and purification time required by this method was only 15 min/sample and greatly shortened compared with GB 5009.26-2016， and the detection efficiency was increased by 10 times. This method allows rapid detection of N-nitrosamines residues in animal derived foods.

Keywords： animal derived foods; pass-through solid phase extraction; rapid purification; gas chromatography-tandem mass spectrometry; N-nitrosamines

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230110-003

中圖分類號：TS251.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2023）03-0033-07

引文格式：

王艷麗， 梁秀清， 陳倩倩， 等. 通過式固相萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源性食品中11 種N-亞硝胺類化合物[J]. 肉類研究， 2023， 37（3）： 33-39. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230110-003.? ? http：//www.rlyj.net.cn

WANG Yanli， LIANG Xiuqing， CHEN Qianqian， et al. Determination of eleven n-nitrosamines in animal derived foods by gas chromatography-tandem mass spectrometry after pass-through solid phase extraction[J]. Meat Research， 2023， 37（3）： 33-39. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230110-003.? ? http：//www.rlyj.net.cn

N-亞硝胺是一類含有N—N＝O官能團(tuán)化合物的總稱，廣泛存在于腌制、風(fēng)干、烘烤等蛋白質(zhì)含量豐富的肉類加工食品中。常見的揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物有

N-二甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamin，NDMA）、N-二乙基亞硝胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-亞硝基甲基乙基胺（N-nitrosomethylethylamine，NMEA）、N-亞硝基乙基異丙基胺（N-nitrosoisopropylethyl amine，EIPNA）、N-亞硝基二異丙胺（N-nitrosodiisopropylamine，NDIPA）、N-二丙基亞硝胺（N-nitrosodipropylamine，NDPA）、N-亞硝基二異丁胺（N-nitrosodiisobutylamine，NDIBA）、N-二丁胺亞硝胺（N-nitrosodibutylamine，NDBA）、

N-亞硝基哌啶（N-nitrosopiperidine，NPIP）、N-亞硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）、N-亞硝基嗎啉等（N-nitrosomorpholine，NMOR）等，其中NDMA和NDEA毒性最強(qiáng)，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將其列為2A類致癌物。許多國家均對食品中N-亞硝胺類化合物的限量作出了要求[1]：美國農(nóng)業(yè)部規(guī)定腌肉制品中揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物總量不得超過10 μg/kg，俄羅斯國家規(guī)定中要求生食品和煙熏食品中N-亞硝胺類化合物總量分別不得超過2、4 μg/kg；我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2762—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》[2]中規(guī)定肉類及肉制品和水產(chǎn)品中NDMA分別不得超過3.0、4.0 μg/kg。

目前針對N-亞硝胺類化合物的檢測方法主要有熱能分析儀法[3-4]、氣相色譜-質(zhì)譜法[5-7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-11]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-17]等。其中熱能分析儀雖然對N-亞硝胺類化合物具有較強(qiáng)的特異性，但因儀器價格昂貴、專屬性強(qiáng)，普適性和推廣性較差；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對于非揮發(fā)性、相對分子質(zhì)量較高的N-亞硝胺類化合物具有較強(qiáng)的分析能力；氣相色譜-質(zhì)譜法對NDMA易產(chǎn)生假陽性結(jié)果；氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其靈敏度和特異性高，近幾年已被廣泛應(yīng)用于揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的檢測。

動物源性食品含有大量的脂肪、蛋白等雜質(zhì)，基質(zhì)干擾嚴(yán)重，常用的前處理方法主要包括水蒸氣蒸餾萃取法[18]、液-液微萃取法[19]、固相萃取法（solid phase extraction，SPE）[20-23]、QuEChERS[24-28]等。水蒸氣蒸餾法雖然能夠去除大部分非揮發(fā)性雜質(zhì)，但操作繁瑣、耗時長，消耗有機(jī)溶劑多，嚴(yán)重影響檢測效率。液-液微萃取法因其微量操作，對實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)要求較高，操作不當(dāng)易造成損失。傳統(tǒng)固相萃取需要活化、淋洗、洗脫等多個步驟，QuEChERS需要提取、凈化、多步轉(zhuǎn)移，

二者操作耗時。Prime HLB固相萃取柱是一種通過式固相萃取柱，不需要活化、清洗或洗脫步驟，樣品提取液直接上柱，對蛋白、脂肪、磷脂等具有較強(qiáng)的吸附能力，可實(shí)現(xiàn)一步凈化，操作較QuEChERS和傳統(tǒng)固相萃取法更簡單、高效，從而大大縮短了凈化時間，對于批量檢測可大幅提高前處理的總體效率。目前該方法已被廣泛應(yīng)用于動植物源性食品中農(nóng)獸藥殘留的檢測[29-31]，但用于分析N-亞硝胺類化合物的研究鮮有報道。

本研究考察肉制品和水產(chǎn)品中N-亞硝胺類化合物的提取條件，研究采用Prime HLB固相萃取柱與QuEChERS 2 種凈化方式的凈化效果，建立以乙腈直接提取、Prime HLB固相萃取柱凈化、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測動物源性食品中11 種N-亞硝胺類化合物的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火腿、扒雞、牛肉干、魷魚絲、烤魚片樣品均購自當(dāng)?shù)爻小?/p>

NDMA、NMEA、NDEA、EIPNA、NDIPA、NDPA、NDIBA、NDBA、NPIP、NPYR和NMOR 11 種標(biāo)準(zhǔn)品（純度均大于95%） 北京曼哈格生物科技有限公司；甲醇、乙腈、二氯甲烷（均為色譜純） 德國Merck公司；無水硫酸鎂（分析純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化鈉（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 8890-7000D氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、HP-INNOWAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司；3-18K離心機(jī) 德國Sigma公司；UMV-2渦旋混合器 山東青云實(shí)驗(yàn)耗材有限公司；IQ 7000 Milli-Q超純水機(jī) 美國Millipore公司；SQP-電子天平?美國塞多利斯科學(xué)儀器有限公司；Oasis Prime HLB固相萃取柱（200 mg/6 mL） 美國沃特世公司；0.22 μm有機(jī)微孔濾膜 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；QuEChERS凈化管（150 mg N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、1.6 g無水硫酸鎂、0.4 g氯化鈉） 島津（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10 mg（精確至0.01 mg）各N-亞硝胺類化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，分別配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。移取各標(biāo)準(zhǔn)儲備液用乙腈稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度，得到N-亞硝胺類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 提取

準(zhǔn)確稱取粉碎好的樣品10 g（精確至0.01 g）于50 mL具塞離心管中，加入10 mL水渦旋2 min，樣品分散后，加入10 mL乙腈，渦旋2 min，加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉，渦旋1 min，8 000 r/min離心5 min，取上清液待凈化。

1.3.2.2 凈化

Prime HLB固相萃取柱凈化：取待凈化液2 mL于Prime HLB固相萃取柱中，收集凈化濾液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，待進(jìn)樣分析。

QuEChERS凈化：將3 mL待凈化液加入到QuEChERS凈化管中渦旋1 min，8 000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，待進(jìn)樣分析。

1.3.3 模擬陽性樣品的制備

將用丙酮稀釋的一定質(zhì)量濃度的N-亞硝胺類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到一定量已粉碎的火腿（水分含量67%）、牛肉干（水分含量10%）和魷魚絲（水分含量17%）3 種空白樣品中，充分混勻，浸泡48 h，然后自然陰干48 h，使溶劑全部揮發(fā)，得到添加量約10 μg/kg的模擬陽性樣品。

1.3.4 儀器條件

1.3.4.1 色譜條件

HP-Innowax毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度為50 ℃，保持1 min；以10 ℃/min的速率升至120 ℃，保持1 min；再以

15 ℃/min的速率升至220 ℃，保持3 min；再以20 ℃/min的速率升至260 ℃，保持12 min。后運(yùn)行溫度270 ℃；后運(yùn)行時間5 min；進(jìn)樣量1 μL；不分流進(jìn)樣；柱流量1.0 mL/min；載氣為氦氣；碰撞氣為氮?dú)?；進(jìn)樣口溫度250 ℃；溶劑延遲5 min。

1.3.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電子轟擊離子源；離子電壓70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；傳輸線溫度260 ℃；采集模式為多反應(yīng)監(jiān)測模式。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

樣品中N-亞硝胺類化合物的含量按式（1）計算。

（1）

式中：X為樣品中N-亞硝胺類化合物含量/（μg/kg）；

ρ為樣品溶液中N-亞硝胺類化合物質(zhì)量濃度/（ng/mL）；V為樣品溶液體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.5 基質(zhì)效應(yīng)評價

取空白基質(zhì)樣品，按1.3.2節(jié)前處理步驟制備空白基質(zhì)溶液，分別用空白基質(zhì)溶液和定容溶劑稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液，得到同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值定量評價基質(zhì)效應(yīng)，按式（2）計算。

（2）

基質(zhì)效應(yīng)絕對值越大表明基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng)，若基質(zhì)效應(yīng)＞0，表明基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，若基質(zhì)效應(yīng)＜0，表明基質(zhì)抑制效應(yīng)，－20%～20%表示基質(zhì)效應(yīng)影響不明顯。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過與儀器配套的MassHunter色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)采集與處理，Origin 8.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方式的優(yōu)化

2.1.1 提取方式的選擇

肉制品、水產(chǎn)品中的水分含量差異較大，有的樣品水分含量較低，若直接用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，不利于目標(biāo)物的游離。本研究采用Prime HLB固相萃取柱凈化方式，對自制的陽性樣品進(jìn)行加水體積（0、5、10、20 mL）和浸泡時間（0、10、20、30、60 min）的參數(shù)考察，其他提取條件按照1.3.2.1節(jié)所述進(jìn)行。

由圖1可知：對于水分含量較高的火腿樣品，加水體積對樣品的提取效率影響較小；而對于水分含量較低的牛肉干、魷魚絲樣品，加水后提取效率得到明顯提高，當(dāng)加水量為5 mL時，樣品不能完全浸潤，而隨著加水量的進(jìn)一步增加，檢測結(jié)果變化很小，因此選擇最終加水量為10 mL。加水浸泡時間對陽性樣品的提取率和陰性樣品加標(biāo)回收率的影響差異很小，因此選擇不浸泡。

2.1.2 提取溶劑的選擇

11 種N-亞硝胺類化合物的極性較強(qiáng)，多易溶于水、醇、醚等試劑，本研究比較二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、甲醇4 種提取溶劑的提取效率。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甲醇作為提取溶劑時，鹽析后甲醇與水無法分層；由圖2可知：二氯甲烷、乙酸乙酯為提取溶劑時，由于二者的極性較弱，容易提取出更多的油脂，尤其對于油脂含量高的樣品，提取過程中易出現(xiàn)嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象，對后續(xù)凈化帶來難度；乙腈作為提取溶劑時，11 種N-亞硝胺類化合物的回收率較好，且乙腈同時具有沉淀蛋白的作用，這與戴裕杰等[24]研究結(jié)果一致。因此，選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2 凈化方式的優(yōu)化

2.2.1 凈化方式的選擇

肉制品、水產(chǎn)品等食品中含有大量的油脂、蛋白質(zhì)、磷脂、色素等復(fù)雜基質(zhì)，經(jīng)乙腈提取后直接上機(jī)，不僅污染儀器，且呈現(xiàn)較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)。QuEChERS方法中的PSA和C18可吸附有機(jī)酸、脂類和糖類等干擾物，目前已被眾多學(xué)者應(yīng)用到N-亞硝胺類化合物的檢測中。Prime HLB柱為通過式固相萃取柱，能有效吸附動物源性食品基質(zhì)中的磷脂、脂肪和蛋白質(zhì)等干擾物，且無需活化、淋洗、洗脫等步驟，操作更快捷方便。

本研究選取油脂含量不同的空白火腿、扒雞、魷魚絲3 種代表性樣品，加入一定質(zhì)量濃度的N-亞硝胺類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，比較Prime HLB柱與QuEChERS 2 種凈化方式的凈化效果，結(jié)果顯示，QuEChERS凈化的回收率為78.7%～98.3%，Prime HLB柱凈化的回收率為80.1%～97.4%，均滿足要求，但Prime HLB柱的凈化操作更簡便快速，且基質(zhì)效應(yīng)明顯低于QuEChERS凈化方式（圖3），因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇Prime HLB柱凈化。

2.2.2 SPE上樣溶液體積的選擇

比較吸取不同體積（1、2、3、4、5 mL）上清液通過Prime HLB柱的凈化效果。由圖4可知：上樣1 mL時，收集到的流出液中除NDMA、NMEA、NDEA外，其他目標(biāo)物回收率均低于90%，可能由于小柱對目標(biāo)物的吸附未達(dá)到飽和，造成回收率偏低；上樣2、3、4、5 mL時，目標(biāo)物回收率相差不大?？紤]到隨著上樣體積的增加，對于油脂含量高的樣品凈化效果可能變差，故最終上樣體積選擇2 mL。

2.3 色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化

參考朱萌萌等[12]的研究結(jié)果，本研究選用強(qiáng)極性的聚乙二醇石英毛細(xì)管柱HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）對肉制品中11 種N-亞硝胺進(jìn)行分離與分析。通過對升溫速率、前級離子、碎片離子的優(yōu)化，所有分析物獲得了良好的分離效果和較高的靈敏度。11 種N-亞硝胺的總離子流色譜圖如圖5所示。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)考察

由圖3可知：采用Prime HLB柱凈化后，不同的N-亞硝胺類化合物在不同動物源性食品中基質(zhì)效應(yīng)均小于20%，為－4.4%～8.9%；但不同樣品中基質(zhì)效應(yīng)仍存在一定的差異。因此本方法采用空白基質(zhì)匹配校正曲線進(jìn)行定量，以減少基質(zhì)干擾對結(jié)果的影響。

2.5 方法學(xué)評價

2.5.1 線性范圍與靈敏度

用空白樣品溶液配制質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以各物質(zhì)定量離子對的峰面積（y）對其質(zhì)量濃度（x）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，由表2可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999。采用空白基質(zhì)加標(biāo)的方法確定方法的檢出限和定量限，分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢出限和定量限，11 種N-亞硝胺類化合物的檢出限為0.2～0.3 μg/kg，定量限為0.5～1.0 μg/kg。

2.5.2 方法回收率和精密度

采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液-外標(biāo)法定量，在火腿、扒雞、魷魚絲基質(zhì)中添加11 種N-亞硝胺類化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)水平分別為1、4、10 μg/kg，每個水平重復(fù)測定6 次，按優(yōu)化的方法測定11 種N-亞硝胺類化合物的含量。

由表3可知，所有目標(biāo)物的加標(biāo)回收率為80.1%～97.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為2.3%～8.8%。

2.6 實(shí)際樣品測定

采用本研究建立的分析方法對市場上購買的醬鹵肉制品、熏煮香腸制品、水產(chǎn)干制品等40 批次樣品進(jìn)行分析，有4 批次水產(chǎn)干制品檢出NDMA。取陽性樣品，分別采用本方法與GB 5009.26—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中N-亞硝胺類化合物的測定》[32]法進(jìn)行比對分析，由表4可知，2 種方法檢測結(jié)果相差不大，但Prime HLB法回收率高于國家標(biāo)準(zhǔn)方法。

3 結(jié) 論

本研究應(yīng)用通過式固相萃取凈化技術(shù)，建立了氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源性食品中11 種N-亞硝胺類化合物的分析方法。Prime HLB柱的提取效率和凈化效果均良好，較QuEChERS方法操作更加簡單、省時省力，平均提取及凈化時間為15 min/樣品，較國家標(biāo)準(zhǔn)方法的提取及凈化時間縮短90%。該方法大大提升了檢測效率，為更快速、準(zhǔn)確地檢測大批量動物源性食品中N-亞硝胺類化合物的殘留測定提供了新的技術(shù)手段。

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收稿日期：2023-01-10

第一作者簡介：王艷麗（1983—）（ORCID： 0000-0002-1534-7192），女，教授級高級工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩?/p>

分析與風(fēng)險預(yù)警。E-mail： wangyanli20070808@163.com

*通信作者簡介：劉艷明（1981—）（ORCID： 0000-0002-2498-5460），女，研究員，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩治雠c風(fēng)險預(yù)警。E-mail： msymliu@163.com