溫彩怡，江 飚，孫龑鑫，黃偉民，馬 壯，梁芝源，劉 春，胡 雄，蘇友祿

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院/健康養(yǎng)殖創(chuàng)新研究院，廣東 廣州 510225；2.佛山市順德區(qū)活寶源生物科技有限公司，廣東 佛山 528300）

【研究意義】雜交鱧（Hybrid snakehead）屬鱸形目（Perciformes）、攀鱸亞目（Anabantoidei）、鱧科（Channidae）、鱧屬（Channa）［1］，是以斑鱧（Channa maculata）為母本、烏鱧（Channa argus）為父本，通過(guò)雜交獲得的子一代，俗稱生魚(yú)、黑魚(yú)、財(cái)魚(yú)等。雜交鱧不僅具有生長(zhǎng)速度快、適應(yīng)性強(qiáng)、耐運(yùn)輸、耐低氧、生長(zhǎng)性狀好、成活率高等優(yōu)點(diǎn)，而且肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，有滋補(bǔ)調(diào)養(yǎng)等藥用價(jià)值，深受消費(fèi)者喜愛(ài)［2-5］，已成為我國(guó)重要的特種經(jīng)濟(jì)魚(yú)類之一。2022 年雜交鱧養(yǎng)殖年產(chǎn)量高達(dá)54.85 萬(wàn)t，同比增長(zhǎng)約10%［6］。自然狀態(tài)下的雜交鱧抗病力強(qiáng)，極少發(fā)病，但由于養(yǎng)殖密度增大、水質(zhì)富營(yíng)養(yǎng)化和種質(zhì)資源退化等原因，導(dǎo)致雜交鱧病害逐年遞增暴發(fā)［7-9］。近年來(lái)，雜交鱧彈狀病毒（Hybrid snakehead rhabdovirus,HSHRV）頻繁檢出，其可感染雜交鱧親本、魚(yú)苗和不同養(yǎng)殖規(guī)格的雜交鱧，已成為制約雜交鱧養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素［10］。開(kāi)展HSHRV流行病學(xué)調(diào)查分析對(duì)雜交鱧養(yǎng)殖與病害防控具有重要的指導(dǎo)意義。

【前人研究進(jìn)展】彈狀病毒（Rhabdovirus）是一類有包膜的單股負(fù)鏈 RNA 病毒，其種類較多，在自然界中分布廣泛，多數(shù)具有很強(qiáng)的致病性［11］。HSHRV 粒子直徑約60 nm，長(zhǎng)度為160 nm，形態(tài)似橢圓形或圓形，通常具有5 種主要結(jié)構(gòu)蛋白（L、G、N、P 和M）［12-13］。曾偉偉等［10］發(fā)現(xiàn)HSHRV 與鱖魚(yú)彈狀病毒（Siniperca chuatsirhabdovirus,SCRV）、鯉春病毒血癥病毒（Spring viremia of carp virus,SVCV）等聚為一支；雷燕等［13］分析發(fā)現(xiàn)，大口黑鱸彈狀病毒（Micropterus salmoidesrhabdovirus,MSRV）與HSHRV、SCRV核苷酸序列同源性分別為 96.9%和95.3%，推測(cè)HSHRV可能為MSRV 和SCRV的變異株。HSHRV 曾被歸屬于水泡病毒屬（Vesiculovirus），但根據(jù)國(guó)際病毒分類學(xué)委員會(huì)2022 年最新分類結(jié)果顯示，彈狀病毒被分為45 個(gè)屬共265 種，但仍有多種彈狀病毒未被納入分類，其中包括MSRV和HSHRV，而與其同源性較高的SCRV 則歸為Siniperhavirus屬［14］。彈狀病毒病在發(fā)病初期缺乏典型臨床病癥，且無(wú)防治特效藥，因此對(duì)雜交鱧彈狀病毒的快速、精準(zhǔn)診斷尤為重要。病毒的檢測(cè)方法主要包括細(xì)胞學(xué)、組織病理學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等，qPCR 因具備特異性強(qiáng)、靈敏度高、快捷高效等優(yōu)點(diǎn)，已成為水產(chǎn)病原檢測(cè)的常用技術(shù)［15］。梁紅茹等［16］利用雙重PCR 方法可特異檢測(cè)出彈狀病毒；而劉春等［17］基于雜交鱧彈狀病毒的G 蛋白序列構(gòu)建了TaqMan qPCR 檢測(cè)方法，不僅特異性強(qiáng)、靈敏性高，還極大節(jié)省時(shí)間，非常適合雜交鱧彈狀病毒的臨床檢測(cè)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】珠三角地區(qū)主要養(yǎng)殖的雜交鱧、大口黑鱸、鱖魚(yú)等名特優(yōu)水品種產(chǎn)量居全國(guó)首位，且均為彈狀病毒的易感宿主。近年來(lái)，廣東省佛山市、中山市和江門(mén)市的雜交鱧主要養(yǎng)殖場(chǎng)頻繁暴發(fā)彈狀病毒病，引起巨大的經(jīng)濟(jì)損失。雖然珠三角地區(qū)雜交鱧養(yǎng)殖規(guī)模不斷增大，但雜交鱧感染彈狀病毒的流行病學(xué)仍缺乏全面系統(tǒng)的調(diào)查與分析?；诖耍狙芯繉?duì)珠三角地區(qū)的雜交鱧彈狀病毒進(jìn)行完整周年的監(jiān)測(cè)，以進(jìn)一步了解該病毒的感染情況?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究從2021 年3 月至2022 年2 月對(duì)珠三角地區(qū)養(yǎng)殖的雜交鱧進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從不同養(yǎng)殖時(shí)間和不同規(guī)格的宿主角度分析彈狀病毒陽(yáng)性率變化，以期探明HSHRV 在雜交鱧不同養(yǎng)殖階段的流行規(guī)律，為雜交鱧彈狀病毒病的綜合防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集 樣品采集時(shí)間為2021 年3 月至2022年2月，于珠三角地區(qū)（中山、佛山和江門(mén)）疑似染病的雜交鱧養(yǎng)殖場(chǎng)隨機(jī)采集繁育階段的雜交鱧親本、魚(yú)苗、水樣以及不同養(yǎng)殖階段的魚(yú)體，共采集333 份樣品（每尾魚(yú)的肝臟、脾臟和腎臟混合成1 份樣品，共292 份；繁育階段每池水樣為1 份樣品，共8 份；每20 尾魚(yú)苗混為1 份樣品，共33 份）。雜交鱧樣品均經(jīng)無(wú)菌解剖后采集肝臟、脾臟和腎臟組織置于同一凍存管中，迅速放入液氮中冷凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)于北京擎科生物有限公司，F(xiàn)astPure? Plasmid Mini Kit 購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司，動(dòng)物組織總RNA 提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司，TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix購(gòu)于北京全氏金生物科技有限公司，2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix（with blue dye）購(gòu)于北京聚合美生物科技有限公司，pMD-18T質(zhì)粒、T4連接酶、DL2000 Marker、Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄 分別取樣品約100 mg，采用動(dòng)物組織總RNA 提取試劑盒提取組織總RNA，隨后利用TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA 模板。

1.2.2 qPCR 檢測(cè) 參照劉春等［17］建立的彈狀病毒TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量（qPCR）檢測(cè)方法，委托廣州天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成引物和探針（引物1∶P1∶5’-CGCGGATCCATCATGAAATCA ATCATTGCACT-3’，P2∶5’-CATCTGCAGAATTGAT ACTGCTGCAAAGGG-3’；引物2：HSHRV-2F∶5’-CACCAGTCATATCAATCC-3’，HSHRV-2R∶5’-CGGACTTAAACCTCATTC-3’；探針：HSHRV-2PFAM-ACCTCTCCGCACATTGACATCT-BHQ1）。采用G 蛋白引物P1、P2 分別對(duì)合成的cDNA 模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增并構(gòu)建重組質(zhì)粒。

取cDNA模板進(jìn)行qPCR 檢測(cè)，20 μL 反應(yīng)體系為：2×Premix Ex TaqTM10 μL，10 μ mol/L HSHRV-2F 與HSHRV-2R引物各0.4 μL，10 μmol/L HSHRV-2P 探針0.8 μL，cDNA 模板1.6 μL，ddH2O 6.8 μL。同時(shí)設(shè)重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照、ddH2O 為陰性對(duì)照。使用CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad）進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，循環(huán)40 次，在每個(gè)循環(huán)的60 ℃處采集FAM 熒光信號(hào)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析 病毒檢測(cè)陽(yáng)性評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：Ct 值≤35 為陽(yáng)性；Ct 值＞35 或顯示為N/A，且沒(méi)有特異性擴(kuò)增曲線則判定為陰性。所有數(shù)據(jù)的圖表繪制使用GraphPad 9.0 和OriginPro。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同規(guī)格雜交鱧感染彈狀病毒的臨床癥狀

本研究根據(jù)體長(zhǎng)將雜交鱧分成3 種規(guī)格：小規(guī)格體長(zhǎng)為1～10 cm，中規(guī)格體長(zhǎng)為11～20 cm，大規(guī)格體長(zhǎng)＞20 cm。不同規(guī)格雜交鱧感染彈狀病毒后均表現(xiàn)游動(dòng)異常，小規(guī)格雜交鱧出現(xiàn)打轉(zhuǎn)癥狀比例較高（圖1A），而中規(guī)格和大規(guī)格雜交鱧出現(xiàn)此癥狀的比例明顯減少（圖1E）。解剖后發(fā)現(xiàn)小規(guī)格魚(yú)體的臟器發(fā)紅，但腫大癥狀不明顯；而中規(guī)格和大規(guī)格魚(yú)體的內(nèi)臟器官普遍充血和腫大（圖1B、C、F），且中規(guī)格魚(yú)體腸道充血、發(fā)炎（圖1D）的比例高于小規(guī)格魚(yú)，還可在大規(guī)格魚(yú)體中觀察到魚(yú)鰾充血和出血現(xiàn)象（圖1G）。

圖1 不同規(guī)格雜交鱧感染彈狀病毒的主要臨床癥狀Fig.1 Main clinical symptoms of rhabdovirus disease in different sizes of hybrid snakehead

2.2 不同養(yǎng)殖階段雜交鱧彈狀病毒感染情況

qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，333 份樣品的HSHRV平均陽(yáng)性率為13.21%，其中，92 份繁育階段樣品的平均陽(yáng)性率較低、為3.26%，親本和水樣均未檢出HSHRV，魚(yú)苗陽(yáng)性率為9.10%；241 份養(yǎng)殖階段樣品的平均陽(yáng)性率為17.01%，明顯高于繁育階段（表1）。

表1 不同養(yǎng)殖階段雜交鱧彈狀病毒感染情況Table 1 Infection of HSHRV in different culture stages of hybrid snakehead

2.3 不同養(yǎng)殖時(shí)間雜交鱧彈狀病毒感染情況

從季度角度分析，HSHRV 陽(yáng)性率呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)（圖2），陽(yáng)性樣品主要在春季和夏季檢出；其中，春季樣品的陽(yáng)性率為16.98%，而夏季樣品的陽(yáng)性率則高達(dá)21.78%，秋季樣品陽(yáng)性率降到13.33%，冬季未檢出陽(yáng)性樣品，這可能與冬季樣品量相對(duì)較少有一定關(guān)系。

圖2 不同養(yǎng)殖季節(jié)雜交鱧彈狀病毒陽(yáng)性率Fig.2 Positive rates of HSHRV in different culture seasons of hybrid snakehead

從月份角度分析，HSHRV 陽(yáng)性率表現(xiàn)為4－8 月份不斷增長(zhǎng)，但從10 月份開(kāi)始（11 月除外）多個(gè)月份未檢出陽(yáng)性樣品。月份流行趨勢(shì)與季度流行趨勢(shì)大體一致，為先升后降。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，不同養(yǎng)殖月份的HSHRV 陽(yáng)性率存在一定差異，3 月、6－8 月和11 月的HSHRV 陽(yáng)性率均≥20.00%，其中，8 月份樣品的陽(yáng)性率最高（23.91%）；4 月、5 月和9 月的HSHRV 陽(yáng)性率較低，介于10.00%～ 20.00%；總體來(lái)看，4 月、6－9 月平均Ct 值較低，病毒載量較高，其中4 月Ct值最低，為21.41；10 月、12 月至次年2 月均未檢出陽(yáng)性樣品（表1）。

2.4 不同規(guī)格雜交鱧彈狀病毒感染情況

從不同規(guī)格的雜交鱧HSHRV 檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，小規(guī)格雜交鱧的HSHRV 感染率最高、平均陽(yáng)性率為32.20%，中規(guī)格雜交鱧的H SHRV 感染率次之（22.86%），大規(guī)格雜交鱧的HSHRV 感染率最低（9.52%）（圖3A）。從感染的月份來(lái)看，小規(guī)格雜交鱧的HSHRV 主要在3－9 月檢出，陽(yáng)性率從3 月開(kāi)始逐月增加，8 月陽(yáng)性率最高、達(dá)71.43%，而從10 月至次年2 月均未檢出該病毒；中規(guī)格雜交鱧的HSHRV主要在6－9月、11月中檢出，其中，6 月、8 月和11 月陽(yáng)性率均為33.33%，7 和9 月樣品陽(yáng)性率分別為22.22%和9.10%；大規(guī)格雜交鱧在春季與秋季HSHRV 陽(yáng)性率較高：3、4 和11 月陽(yáng)性率較高，分別為28.57%、16.67%和20.00%，而夏季陽(yáng)性率較低，7－ 9 月陽(yáng)性率分別為6.67%、12.12%和7.40%（圖3B）。

圖3 不同規(guī)格雜交鱧彈狀病毒陽(yáng)性率Fig.3 Positive rates of HSHRV in different sizes of hybrid snakehead

3 討論

彈狀病毒可感染多種魚(yú)類，并且感染后出現(xiàn)不同的臨床癥狀。滕建等［8］研究發(fā)現(xiàn)彈狀病毒可導(dǎo)致雜交鱧肝臟、脾臟腫大，魚(yú)鰾血管?chē)?yán)重腫脹和出血等病變；大口黑鱸感染彈狀病毒后出現(xiàn)游動(dòng)不規(guī)則、爛身、“花肝”和腎臟腫大現(xiàn)象［18-19］。Fu 等［20］發(fā)現(xiàn)，魚(yú)類感染彈狀病毒后主要癥狀為出血性敗血癥，影響多種器官的功能。本研究發(fā)現(xiàn)，雜交鱧感染彈狀病毒后表現(xiàn)出類似的上述臨床癥狀，但不同規(guī)格雜交鱧感染彈狀病毒后呈現(xiàn)一定差異：小規(guī)格雜交鱧主要出現(xiàn)不規(guī)則螺旋狀翻轉(zhuǎn)，解剖癥狀不明顯；而中、大規(guī)格雜交鱧主要表現(xiàn)臟器充血發(fā)紅或腫大，且多伴有腸道發(fā)炎現(xiàn)象。

彈狀病毒在不同地區(qū)和不同品種的魚(yú)類上的檢出情況有一定差異。2014 年和2015 年，全國(guó)多種名特優(yōu)養(yǎng)殖魚(yú)類的彈狀病毒平均陽(yáng)性率分別為18.29%和12.29%，其中，雜交鱧彈狀病毒平均陽(yáng)性率最高，分別為27.98%和34.01%，大口黑鱸彈狀病毒的平均陽(yáng)性率分別為6.19%和12.24%［21］。2007 年和2018 年，北京市和上海市地區(qū)SVCV 陽(yáng)性率分別為4.16%和14.4%［22-23］；林強(qiáng)等［24］2016 年3－11 月對(duì)廣東省鱖魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行病毒病監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)SCRV 陽(yáng)性率高達(dá)20.42%。本研究檢測(cè)結(jié)果顯示，HSHRV 平均陽(yáng)性率為13.21%，高于SVCV 在其他魚(yú)類中的陽(yáng)性率。

王娟等［21］發(fā)現(xiàn)，魚(yú)類彈狀病毒在 4－12月皆有檢出，其中12 月份的平均陽(yáng)性率高達(dá)71.43%，而夏季的陽(yáng)性率普遍低于10%。本研究與上述研究結(jié)果存在一定差異，而與黃志斌等［25］對(duì)珠三角地區(qū)鱖魚(yú)病害調(diào)查結(jié)果較一致，即每年11 月中下旬水溫降低后死亡率大幅度下降。彈狀病毒在25～28 ℃ 時(shí)穩(wěn)定性高，對(duì)鱖魚(yú)、斑馬魚(yú)等具有較強(qiáng)的感染能力［26-27］。本研究結(jié)果顯示，HSHRV 在春夏季節(jié)的檢測(cè)Ct 值較低，表明春夏季節(jié)病毒載量較高，這與大多數(shù)研究學(xué)者的結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，繁育階段的樣品中，只有魚(yú)苗檢測(cè)出HSHRV，這可能與剛孵化的魚(yú)苗自身免疫力低，因此更容易感染彈狀病毒有關(guān)。但魚(yú)苗檢測(cè)Ct 值較高，表明魚(yú)苗攜帶彈狀病毒載量很低，且未在雜交鱧親本中檢測(cè)出HSHRV，可能與繁育過(guò)程中注重篩選免疫力強(qiáng)、活力好的親本有關(guān)。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，HSHRV 最易感體長(zhǎng)10 cm 以下的魚(yú)苗，而對(duì)20 cm 以上的大規(guī)格魚(yú)感染率較低。也有研究發(fā)現(xiàn)MSRV 可引起體長(zhǎng)2～4 cm和更小規(guī)格（體長(zhǎng)0.8～1 cm）的大口黑鱸幼魚(yú)死亡［28-30］；SVCV 對(duì)大規(guī)格鯉魚(yú)的感染率很低［31-32］，這與魚(yú)對(duì)彈狀病毒的抵抗力隨年齡增加而上升有一定關(guān)系［33］。人工感染斑鱧的結(jié)果表明，規(guī)格越大的親本感染彈狀病毒后，魚(yú)體的死亡時(shí)間越慢［34］，隨著魚(yú)體規(guī)格增大，機(jī)體代謝更加旺盛，其免疫力逐漸提高。與上述研究類似，本次調(diào)查的中規(guī)格和大規(guī)格雜交鱧彈狀病毒陽(yáng)性率呈現(xiàn)大幅度下降的趨勢(shì)。

4 結(jié)論

本研究對(duì)珠三角地區(qū)雜交鱧彈狀病毒進(jìn)行了周年監(jiān)測(cè)，以明確感染彈狀病毒的主要流行癥狀。患病雜交鱧體表癥狀不明顯，小規(guī)格魚(yú)出現(xiàn)打轉(zhuǎn)現(xiàn)象，解剖癥狀不明顯；中規(guī)格魚(yú)主要表現(xiàn)為肝臟、脾臟充血發(fā)紅以及腸炎；大規(guī)格魚(yú)則主要表現(xiàn)為脾臟和魚(yú)鰾充血發(fā)紅和腫大現(xiàn)象。本次調(diào)查結(jié)果顯示，雜交鱧彈狀病毒的平均陽(yáng)性率在13%左右，養(yǎng)殖階段的平均陽(yáng)性率（17.01%）顯著高于繁育階段的平均陽(yáng)性率（3.26%）；該病毒病主要流行于4—11 月份，夏季陽(yáng)性率最高，冬季未檢出陽(yáng)性樣品；該病毒最易感體長(zhǎng)10 cm 以下的小規(guī)格雜交鱧，而大規(guī)格雜交鱧彈狀病毒陽(yáng)性率低于10%。