邢信昊，王欣榮，陳莉，仲華，韓蕾，王彥，3*（. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系，上海 00433；. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 350；3. 軍事藥學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 00433）

白念珠菌是最常見的病原真菌之一，可引起皮膚感染、黏膜感染甚至危及生命的系統(tǒng)性感染。對膿毒癥、器官移植、惡性腫瘤等免疫功能低下的患者來說，白念珠菌引起的系統(tǒng)性感染尤為兇險，據(jù)統(tǒng)計，念珠菌血癥患者的歸因死亡率高達10%至47%[1-2]。

唑類藥物是現(xiàn)今臨床上常用的抗真菌藥物，然而其耐藥性問題日益凸顯，嚴重困擾了抗真菌治療的有效實施。目前臨床上多采用優(yōu)化劑量和多藥聯(lián)合療法應(yīng)對耐藥性問題，但存在毒性大、效率低、價格高等缺點[3]。研究白念珠菌的藥物敏感性相關(guān)基因，開發(fā)抗真菌新藥并解決耐藥性問題具有重要的臨床意義。

真菌耐藥的機制包括藥物外排功能增強、藥物攝入減少、生物被膜形成、靶蛋白動態(tài)變化以及藥物代謝相關(guān)通路改變等，而白念珠菌對唑類藥物耐藥的最主要機制是藥物外排能力的增強，尤其是能量依賴的藥物外排[3-5]。線粒體是能量代謝的核心細胞器，眾多研究表明，線粒體功能影響白念珠菌的藥物敏感性。例如，白念珠菌氧化磷酸化解偶聯(lián)突變體對氟康唑和伏立康唑的敏感性顯著降低[6]，線粒體復(fù)合體Ⅰ活性必需基因GOA1或其亞基編碼基因NDH51的缺失都會使白念珠菌對唑類藥物的敏感性顯著提高[7]，線粒體生物發(fā)生必需基因FZO1缺失使唑類藥物耐受性顯著降低[8]?？梢姡€粒體能量代謝是白念珠菌對唑類藥物的敏感性的關(guān)鍵影響因素。

前期有研究報道，小分子化合物ML316通過選擇性抑制線粒體磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白Mir1發(fā)揮抗真菌作用，并在釀酒酵母中研究了其可能的機制[9]。我們推測，線粒體磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白可能影響線粒體有氧呼吸進而影響能量代謝，成為新的白念珠菌抗真菌藥物靶點。然而，其編碼基因MIR1在白念珠菌藥物敏感性中的作用還缺乏系統(tǒng)研究。課題組前期研究了白念珠菌MIR1基因的功能，然而是基于傳統(tǒng)的營養(yǎng)標記型敲除篩選策略[10]，對表型研究有一定干擾[11-12]。本研究聚焦MIR1基因?qū)Π啄钪榫鷮蝾愃幬锩舾行缘挠绊?，利用SAT1 flipper法對白念珠菌標準株進行敲除和重組，并探索MIR1基因在其中的作用機制。

1 材料

野生型白念珠菌SC5314（wild-typeCandida albicans，WT，由美國喬治敦大學(xué)William A Fonzi教授饋贈）；SanPrep柱式質(zhì)粒抽提試劑盒（上海生工生物），SacⅠ內(nèi)切酶、XhoⅠ內(nèi)切酶、ApaⅠ內(nèi)切酶、SacⅡ內(nèi)切酶（New England Biolabs），酵母轉(zhuǎn)化試劑盒、諾爾斯菌素（上海懋康生物），Ex Taq DNA聚合酶（TaKaRa），羅丹明6G（Sigma-Aldrich），JC-1膜電位檢測試劑盒（上海碧云天生物），ATP檢測試劑盒BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay（Promega），三磷酸腺苷（ATP）溶液（北京索萊寶）；蛋白胨、酵母浸膏、營養(yǎng)肉湯（美國BD公司）；糖類、抗菌藥物、緩沖液、培養(yǎng)基、引物、DNA Marker等其他基礎(chǔ)試劑購自上海生工生物。

2 方法

2.1 菌株培養(yǎng)

挑取凍存菌株，在YPD液體培養(yǎng)基中活化，30℃、200 r·min－1振蕩培養(yǎng)24 h后，吸取10 μL于新的1 mL YPD液體培養(yǎng)基中，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)16 h。取該菌液后接種于沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)靜置培養(yǎng)48 h。實驗時挑取單克隆菌落置于YPD液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)16 h至對數(shù)生長期用于實驗。

2.2 MIR敲除菌（mir1Δ/Δ）和回復(fù)菌（mir1Δ/MIR1）的構(gòu)建與鑒定

用引物MIR1-up-FWD和MIR1-up-RV擴增MIR1基因5'-端的一個0.661 kb片段，經(jīng)ApaⅠ和XhoⅠ雙酶切后，克隆到pSFS2載體中MAL2p-CaFLP-CaSAT1盒的上游，得到質(zhì)粒pSFS2-MIR1up；同理，用引物MIR1-down-FWD和MIR1-down-RV擴增MIR1基因3'-端的一個0.504 kb片段，經(jīng)SacⅡ和SacⅠ雙酶切后，克隆到pSFS2載體中MAL2p-CaFLP-CaSAT1盒的下游，得到質(zhì)粒pSFS2-MIR1updwn。用ApaⅠ和SacⅠ兩種限制性內(nèi)切酶對其進行雙酶切，酶切后的片段用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化進白念珠菌SC5314，然后此片段會以同源重組的方式替換掉目的基因的一個等位基因。使用多個引物通過菌落PCR鑒定出對諾爾絲菌素表現(xiàn)出抗性的轉(zhuǎn)化子，將正確的轉(zhuǎn)化子刪除諾爾絲菌素抗性標記CaSAT1后即可得到目的基因的單等位基因敲除菌。經(jīng)過兩次重組和刪除，即可得到雙等位基因敲除菌mir1Δ/Δ。

為了將MIR1基因重新整合到mir1Δ/Δ中，用引物MIR1-FWD和MIR1-RV擴增一個2.30 kb的片段，其中包含完整的開放閱讀框，以及MIR1等位基因上游0.661 kb和下游0.504 kb的序列，用ApaⅠ和XhoⅠ雙酶切。以該酶切片段替換pSFS2-MIR1updwn中MIR1基因序列的5'-端，生成質(zhì)粒pSFS2-MIR1Rec。pSFS2-MIR1Rec質(zhì)粒用ApaⅠ和SacⅠ酶切，用該酶切片段轉(zhuǎn)化mir1Δ/Δ。由此獲得了具有諾爾斯菌素抗性的菌株，再經(jīng)刪除諾爾絲菌素抗性標記CaSAT1后，即得回復(fù)菌mir1Δ/MIR1，以供進一步研究。菌株構(gòu)建和鑒定所用引物如表1所示，PCR鑒定的引物設(shè)計原理如圖1所示，預(yù)測結(jié)果如表2所示。

圖1 用于PCR鑒定的引物設(shè)計示意圖Fig 1 Schematic diagram of primer design in PCR identification

表1 菌株構(gòu)建和鑒定所用引物Tab 1 Primers for strain construction and identification

表2 所構(gòu)建菌株的PCR鑒定預(yù)測結(jié)果(kb)Tab 2 Predicted results of PCR identification of the constructed strains (kb)

2.3 斑點法（spot assay）檢測藥物敏感性

取活化的野生型白念珠菌，敲除菌mir1Δ/Δ，回復(fù)菌mir1Δ/MIR1，用PBS洗滌后，調(diào)整野生型和回復(fù)菌菌液濃度為2×106個·mL－1，再倍比稀釋為2×105、2×104、2×103、2×102個·mL－1，敲除菌濃度分別為野生型的2倍。各濃度菌液分別取5 μL點于含不同抗真菌藥物[氟康唑（Fluconazole）、酮康唑（Ketoconazole）、伊曲康唑（Itraconazole）、咪康唑（Miconazole）和伏立康唑（Voriconazole）等5種唑類藥物，以及布雷非德菌素A（Brefeldin A）、特比萘芬（Terbinafine）、卡泊芬凈（Caspofungin）、氟胞嘧啶（Flucytosine）和兩性霉素（Amphotericin）等其他藥物]的YPD平板上，自然晾干。于30℃靜置培養(yǎng)48 h，觀察并拍照。

結(jié)果顯示，在YPD培養(yǎng)平板以及含有特比萘芬、卡泊芬凈、氟胞嘧啶和兩性霉素的培養(yǎng)平板上，mir1Δ/Δ敲除菌的菌落生長情況與野生型或回復(fù)菌沒有顯著差異；而在含有5種唑類藥物和布雷非德菌素A的平板上，與野生型或回復(fù)菌相比，mir1Δ/Δ敲除菌的菌落生長明顯較少（見圖2）。該結(jié)果表明，MIR1基因敲除使白念珠菌對唑類藥物的敏感性顯著提高。

圖2 MIR1敲除菌、回復(fù)菌與野生型白念珠菌對抗真菌藥物的敏感性Fig 2 Sensitivity of MIR1 knockout，revertant and wild-type Candida albicans to antifungal drugs

2.4 藥物外排能力檢測

將上述菌株在YPD中振蕩培養(yǎng)16 h，PBS洗滌后，調(diào)整菌液濃度5×107個·mL－1。用PBS重懸細胞并振蕩培養(yǎng)2 h，耗竭能量。加入羅丹明使其終濃度為10 μmol·L－1，30℃、200 r·min－1振蕩培養(yǎng)60 min。菌液離心，PBS洗滌后，計數(shù)并調(diào)整菌液濃度為5×107個·mL－1。加入葡萄糖使其終濃度為20 mmol·L－1，提供供能底物，取1 mL在30℃下、200 r·min－1振蕩培養(yǎng)2 h。3000 r·min－1離心菌液5 min，取100 μL上清液，檢測527 nm處的OD值。

結(jié)果顯示，在30℃培養(yǎng)環(huán)境下，與野生型相比，mir1Δ/Δ敲除菌泵出的羅丹明6G顯著較低（P＜0.05，見圖3）。該結(jié)果表明，MIR1基因敲除使白念珠菌的藥物外排能力缺陷。

圖3 MIR1敲除菌、回復(fù)菌與野生型白念珠菌對羅丹明6G的外排能力Fig 3 Efflux of Rhodamine 6G by MIR1 knockout，revertant and wildtype Candida albicans

2.5 線粒體膜電位檢測

活化的菌株經(jīng)200 r·min－1振蕩培養(yǎng)16 h，收集細胞，經(jīng)PBS洗滌后，使用YPD培養(yǎng)基重懸細胞，在30℃下振蕩培養(yǎng)30 min。收集細胞并洗滌，然后用PBS調(diào)節(jié)菌液濃度至5×106個·mL－1。將0.5 mL菌液與等體積的JC-1染色工作液混合，陽性對照組使用線粒體電子傳遞鏈抑制劑CCCP（終濃度為10 μmol·L－1），37℃避光孵育20 min。使用JC-1染色緩沖液洗滌3次，重懸至100 μL。使用多功能酶標儀在490 nm激發(fā)波長下，檢測并計算紅色/綠色熒光強度比（590 nm/530 nm）。

結(jié)果顯示，與野生型相比，mir1Δ/Δ敲除菌的紅綠熒光強度之比有降低趨勢（見圖4A），表明MIR1基因敲除使白念珠菌的線粒體膜電位有降低趨勢。

圖4 MIR1敲除菌、回復(fù)菌與野生型白念珠菌的線粒體膜電位（A）和ATP生成能力（B）Fig 4 Mitochondrial membrane potential（A）and ATP production（B）in MIR1 knockout，revertant and wild-type Candida albicans

2.6 ATP生成檢測

活化的菌株經(jīng)200 r·min－1振蕩培養(yǎng)16 h，收集細胞，經(jīng)PBS洗滌后，用YPD培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度至1×106個·mL－1，在30℃下振蕩培養(yǎng)30 min。取50 μL菌液與等體積BacTiter-Glo Reagent，在96孔板中混勻，孵育10 min后，使用多功能酶標儀測定熒光信號強度。按說明書制備ATP標準曲線，根據(jù)標準曲線計算ATP含量。

結(jié)果顯示，mir1Δ/Δ敲除菌與野生型相比ATP濃度顯著降低（P＜0.01，見圖4B），表明MIR1基因敲除使白念珠菌的ATP生成能力缺陷。

3 討論

本項研究發(fā)現(xiàn)MIR1基因的缺失顯著提高了白念珠菌的唑類藥物敏感性，而對特比萘芬、卡泊芬凈、氟胞嘧啶和兩性霉素等其他抗真菌藥物的敏感性沒有顯著改變，表現(xiàn)出一定的特異性。通過羅丹明6G外排實驗發(fā)現(xiàn)MIR1敲除使白念珠菌對唑類藥物敏感性的提高可能與藥物外排能力缺陷有關(guān)，MIR1敲除引起的線粒體膜電位降低和ATP生成能力缺陷可能是其作用機制。

與其他抗真菌藥物耐藥機制不同，ABC轉(zhuǎn)運蛋白依賴的藥物外排作用是白念珠菌對唑類藥物耐藥性的主要機制，特異性阻斷ABC轉(zhuǎn)運蛋白是逆轉(zhuǎn)唑類藥物耐藥性的一種可行手段，小分子抑制劑FK506、普羅帕酮以及米爾貝霉素等均可以提高對唑類藥物的敏感性[13-14]。由于ABC轉(zhuǎn)運蛋白功能的發(fā)揮依賴于ATP，因此線粒體ATP生成障礙會抑制其轉(zhuǎn)運功能，進而提高白念珠菌對唑類藥物敏感性。例如，白念珠菌線粒體復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ的功能變化，可能會改變線粒體有氧呼吸及ATP生成，影響藥物外排活性，從而改變對唑類藥物的敏感性[7，15]。琥珀酸脫氫酶編碼基因SDH2缺失也會導(dǎo)致白念珠菌藥物外排能力下降，唑類藥物敏感性提高[16]。可見，線粒體相關(guān)基因是研究白念珠菌唑類耐藥性機制及其逆轉(zhuǎn)手段的重要方向。

MIR1基因編碼線粒體磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，其缺失會導(dǎo)致向線粒體基質(zhì)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運障礙[17]。在線粒體基質(zhì)中，二磷酸腺苷（ADP）和無機磷酸鹽在ATP合酶的催化下生成ATP，無機磷酸鹽的轉(zhuǎn)運障礙會引起ATP合成受阻[9]，這可能是本研究中MIR1敲除提高白念珠菌對唑類藥物敏感性的主要機制。此外，線粒體功能障礙也可能通過減少藥物外排泵表達或提高活性氧（ROS）累積來提高抗真菌藥物敏感性，未來值得通過實驗進一步探索。

課題組前期在白念珠菌MIR1基因功能的研究中，考察了MIR1基因和白念珠菌耐藥性的相關(guān)性[10]，但是存在缺陷：在構(gòu)建MIR1基因敲除菌時采用了營養(yǎng)缺陷型標記篩選策略，親本菌是URA3基因缺陷的白念珠菌CAI4株，不能在缺乏尿苷或尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長，這種代謝相關(guān)基因的缺陷會對白念珠菌的表型產(chǎn)生影響，繼而對表型研究造成干擾[11]。在本研究中，我們以SC5314標準株為親本菌，采用了更加先進的SAT1 flipper技術(shù)進行敲除菌的構(gòu)建，得到了更加可信的結(jié)果和結(jié)論。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MIR1基因缺失會導(dǎo)致白念珠菌對唑類藥物敏感性提高；MIR1基因缺失后，白念珠菌的藥物外排能力缺陷，可能是MIR1敲除對線粒體膜電位降低和ATP生成能力缺陷所導(dǎo)致的?？梢?，MIR1基因?qū)Π啄钪榫哪芰抗?yīng)和藥物敏感性至關(guān)重要，Mir1蛋白特異性抑制劑有望開發(fā)為與唑類藥物協(xié)同的新型抗真菌藥物，以MIR1為靶點開發(fā)抗真菌藥物可能具有較好的應(yīng)用前景。