趙思思,趙飛駿

南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所,湖南衡陽 421001

梅毒螺旋體(Treponema pallidum,Tp)是蒼白密螺旋體屬中的蒼白亞種,其引起的梅毒是一種嚴(yán)重危害人類健康的性傳染性疾病。梅毒發(fā)病率不斷升高,中國每年報(bào)告的梅毒診斷數(shù)呈逐年遞增趨勢(shì)[1-2]。隨著基因測(cè)序技術(shù)日趨完善,基因組學(xué)得到了巨大的發(fā)展。比較基因組學(xué)通過比較分析Tp與其他致病性螺旋體的基因組數(shù)據(jù),揭示Tp與其他致病性螺旋體的相似性與差異性,以幫助了解Tp的生物特性和致病機(jī)制等。因此,本文綜述Tp基因組、Tp和其他致病性螺旋體基因組比較,以探討Tp的致病機(jī)制。

1 Tp基因組

Tp基因組為環(huán)狀染色體,有最小的螺旋體基因組,大小約為1.14 Mb,G+C的平均含量為52.8%[3]。預(yù)測(cè)Tp蛋白質(zhì)分子量為3 235～72 869 Da,等電點(diǎn)為3.9～12.3[3]。Nichols株是第一個(gè)完成全基因組測(cè)序的Tp菌株,目前已相繼完成了標(biāo)準(zhǔn)株SS14株、Chicago株、DAL-1株、Mexico A株、Sea81-4株的全基因組測(cè)序[3-8]。Tp菌株間基因序列相似性水平>99.8%[9]。

1.1 Nichols株

1912年,Nichols株從華盛頓特區(qū)的一名神經(jīng)梅毒患者的腦脊液中被分離出來,并于1998年3月完成了首次測(cè)序工作[3]。2012年,科學(xué)家使用新的測(cè)序方法對(duì)Nichols株進(jìn)行了第二次測(cè)序[4]。兩種測(cè)序方法得到的數(shù)據(jù)有些微差異[4]。NCBI最新數(shù)據(jù)顯示Nichols株基因組大小為1 138 011 bp,有1 010個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)(coding sequence,CDS)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000919.1)。根據(jù)Riley的分類方案,Nichols株中有577個(gè)承擔(dān)預(yù)測(cè)生物學(xué)功能的開放閱讀框(open reading frame,ORF),177個(gè)可與其他物種假定蛋白質(zhì)相匹配的ORF,還有287個(gè)沒有數(shù)據(jù)庫匹配的ORF[3]。Nichols株中可以發(fā)生tprK變異,但其變異速度較低[10]。

1.2 SS14株

SS14株從亞特蘭大的一名二期梅毒患者身上被分離出來,該患者對(duì)青霉素過敏且對(duì)紅霉素治療無效[4]。SS14株對(duì)紅霉素表現(xiàn)出高水平耐藥性,這是人們第一次在致病性密螺旋體中發(fā)現(xiàn)與臨床相關(guān)的抗生素耐藥性[11]。2007年8月,SS14株進(jìn)行了首次全基因組測(cè)序工作,2012年12月,研究者使用新的測(cè)序技術(shù)更新了基因組測(cè)序結(jié)果。NCBI最新數(shù)據(jù)顯示SS14株基因組大小為1 139 457 bp,有1 014個(gè)CDS(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_021508.1)。SS14株的基因組測(cè)序結(jié)果首次揭示了Tp的全基因組變異性[12]。

Matejkova等[12]發(fā)現(xiàn),SS14株與Nichols株相比有327個(gè)單核苷酸變化、14個(gè)缺失和18個(gè)插入,這其中不包括高度可變的tprK基因變化[12]。使用新的測(cè)序方法校正Nichols株和SS14株的全基因組數(shù)據(jù)后,這兩種菌株的蛋白質(zhì)組發(fā)生了顯著變化,提示Nichols株和SS14株代表了不同的Tp菌株亞群[4]。SS14株和Nichols株基因組之間的重要差異主要存在于23S rRNA、tp0326、tp0868和tp0127基因中[5]。在SS14株的23S rRNA基因中的A2058G點(diǎn)突變,是SS14株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥的原因[11]。體外測(cè)試表明,SS14株對(duì)各種抗生素的敏感性均低于Nichols株[4]。此外,SS14株基因組中的tprK基因變異性比Nichols株基因組中的tprK變異性高得多,SS14株基因組鑒定的菌株內(nèi)異質(zhì)性也顯著高于Nichols株[4]。SS14株和Nichols株之間的多樣性比SS14株和Mexico A株基因組之間的多樣性大很多[4]。

1.3 Chicago株

1951年,Chicago株從梅毒患者的原發(fā)性硬下疳中被分離出來,其可以在兔睪丸內(nèi)生長良好[6]。2009年9月,研究者成功完成了對(duì)Chicago株基因組的測(cè)序。NCBI最新數(shù)據(jù)顯示Chicago株基因組大小為1 139 281 bp,編碼989個(gè)CDS(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_017268.1)。與Nichols株基因組相比,Chicago株有44個(gè)核苷酸替換、21個(gè)缺失和75個(gè)插入[6]。Chicago株tprK序列具有高度多樣性,而Nichols株的tprK基因變異較慢[10]。

1.4 DAL-1株

1991年,DAL-1株從達(dá)拉斯的一名二期梅毒孕婦的羊水中被分離出來;2011年11月,美國研究者組合使用454測(cè)序、Solexa測(cè)序和Sanger測(cè)序確定完整DAL-1基因組序列[5]。NCBI數(shù)據(jù)表明其基因組大小為1 139 971 bp,包含986個(gè)CDS(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_016844.1)。

1.5 Mexico A株

1953年,Mexico A株從居住在墨西哥的一名患有原發(fā)性梅毒的18歲男性患者體內(nèi)被分離出來[7]。NCBI最新數(shù)據(jù)顯示,Mexico A株基因組大小為1 140 038 bp,編碼986個(gè)CDS(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_018722.1)。與Nichols株相比,體外培養(yǎng)的Mexico A株生長速率和運(yùn)動(dòng)性降低[13]。Mexico A株在目前研究的所有Tp菌株中擁有最大的基因組,其基因組有1 140 038個(gè)堿基。Mexico A株的兩個(gè)基因tp0326和tp0488結(jié)合了Tp和蒼白密螺旋體極細(xì)亞種的特異性核苷酸序列,這可能是因?yàn)閱蝹€(gè)宿主同時(shí)感染兩種菌株時(shí)菌株間進(jìn)行了基因重組,這證明密螺旋體亞種之間可以進(jìn)行水平基因轉(zhuǎn)移[7]。對(duì)Mexico A株的G+C含量、密碼子和氨基酸使用以及基因位置進(jìn)行分析,預(yù)測(cè)其有77個(gè)基因能水平轉(zhuǎn)移[7]。Mexico A株基因組與SS14株基因組親緣關(guān)系最近。Mexico A基因組與SS14基因組相比只有175個(gè)替換、85個(gè)插入和28個(gè)缺失;與Chicago株基因組相比有419個(gè)替換、18個(gè)插入和20個(gè)缺失,而與Nichols基因組相比有438個(gè)替換、94個(gè)插入和38個(gè)缺失[7]。

1.6 Sea81-4株

Sea81-4株于1980年從西雅圖的一名患者的原發(fā)性硬下疳中被分離出來,在2012年完成了測(cè)序[8]。NCBI最新數(shù)據(jù)顯示,Sea81-4株基因組大小為1 139 203 bp,有1 000個(gè)CDS(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NZ_CP003679.1)。與其他5種Tp分離株不同,Sea81-4株靜脈接種感染兔模型后會(huì)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)持續(xù)感染[8,14]。

編碼假定毒力因子的基因、參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)和過程的基因和編碼DNA復(fù)制、修復(fù)和重組的基因,是Tp不同菌株間基因差異的主要發(fā)生位點(diǎn)。相比之下,編碼一般代謝、轉(zhuǎn)錄、翻譯、基因調(diào)控和轉(zhuǎn)運(yùn)成分的Tp基因是保守的[7]。Tp菌株之間的遺傳差異首先在tprD基因和tp0126～tp0127基因間的區(qū)域中被發(fā)現(xiàn)[5]。tprK基因在Tp各菌株之間具有高度變異,這種變異使得Tp可以逃脫免疫清除,導(dǎo)致宿主的慢性感染[15]。來自不同實(shí)驗(yàn)室的Nichols株的tprK基因在經(jīng)過幾十年的獨(dú)立傳代后仍只有很小的序列多樣性[10]。但除Nichols株外,其他菌株均已鑒定出基因序列多樣性高的tprK基因[10]。tprK序列的多樣性位于7個(gè)可變區(qū)域(V1～V7)和保守區(qū)域的兩側(cè)[16]。在Tp感染期間,T細(xì)胞免疫反應(yīng)針對(duì)tprK的保守區(qū),而抗體反應(yīng)針對(duì)V區(qū)[17]。tprK的多樣性隨著Tp在兔睪丸中的連續(xù)傳代而積累,其中V6是V區(qū)中變化最大的[16]。

2 Tp和其他螺旋體基因組比較

2.1 Tp和其他蒼白密螺旋體基因組比較

近年來全基因組測(cè)序結(jié)果表明,密螺旋體是高度克隆的生物,其基因組的細(xì)微差異可導(dǎo)致疾病的臨床表現(xiàn)和宿主范圍的深層次差異[5]。對(duì)人致病的密螺旋體有蒼白密螺旋體和品他密螺旋體。蒼白密螺旋體又分為3個(gè)亞種,分別為蒼白亞種、極細(xì)亞種和地方亞種。除此之外,還有一種未分類的類人猿密螺旋體分離株(Fribourg-Blanc)。梅毒螺旋體、雅司螺旋體和Fribourg-Blanc螺旋體關(guān)系密切,這三者無法通過形態(tài)學(xué)、蛋白質(zhì)電泳、細(xì)菌生理學(xué)或宿主免疫反應(yīng)來區(qū)分[18]。

2.1.1 Tp和雅司螺旋體基因組比較 雅司螺旋體是雅司病的病原體。雅司病是一種熱帶病,主要以皮膚、關(guān)節(jié)、軟組織和骨骼影響為特征。一般來說,雅司螺旋體的毒性比Tp小[9]。盡管Tp和雅司螺旋體會(huì)引起完全不同的疾病,但這兩個(gè)亞種的基因組總差異僅為0.36%～0.37%;提示Tp和雅司螺旋體之間存在極大的序列相似性[5,18]。使用下一代測(cè)序技術(shù)確定了3種雅司螺旋體菌株的完整基因組序列,其基因組長度為1 139 330～1 139 744 bp[9]。

Tp和雅司螺旋體之間的大部分遺傳差異主要累積在6個(gè)基因組區(qū)域中,包括第122位的tp0138(tpF1)、16S rRNA、tpp15(tp0171)的5′側(cè)翼區(qū)域和3′側(cè)翼區(qū)域、第579位的gpd(Tp0257)、tp0326(Tp92)以及tprI和tprC,這些基因位點(diǎn)的差異可能導(dǎo)致了Tp和雅司螺旋體之間致病性的差異[9]。在tpp15的5′側(cè)翼區(qū)域和3′側(cè)翼區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的序列變化可以將Tp與其他密螺旋體區(qū)分開來,包括雅司螺旋體、地方密螺旋體和Fribourg-Blanc密螺旋體[18]。

2.1.2 Tp和Fribourg-Blanc株基因組比較 Fribourg-Blanc株是1962年從非洲幾內(nèi)亞的一只狒狒中分離出來,能夠感染倉鼠及人類[18]。Fribourg-Blanc株在所有不可培養(yǎng)的密螺旋體中有最大的基因組(1 140.4 kb)[9]。Fribourg-Blanc分離株在tp0696～tp0697之間的基因間區(qū)域中鑒定出了DNA重復(fù),因此Fribourg-Blanc分離株不太可能包含Tp菌株中缺失的任何獨(dú)特DNA區(qū)域[9]。在tprK供體位點(diǎn)所在的基因組區(qū)域中,蒼白密螺旋體和Fribourg-Blanc分離株之間存在高程度的相似性和序列保守性(99.57%),其進(jìn)化關(guān)系非常密切[9]。此外,Fribourg-Blanc分離株與雅司螺旋體的關(guān)系比與Tp的關(guān)系更密切[9,19]。

2.2 Tp和其他致病性螺旋體基因組比較

通過比較Tp與其他不同屬的致病性螺旋體間的基因差異(表1),可以進(jìn)一步揭示Tp的生物學(xué)特性。

表1 螺旋體基因組的特征

2.2.1 Tp與問號(hào)鉤端螺旋體基因組比較 問號(hào)鉤端螺旋體的基因組由兩條環(huán)狀染色體組成,其基因組大小遠(yuǎn)大于Tp和Bb[22]。問號(hào)鉤端螺旋體共有4 727個(gè)CDS,4 360個(gè)位于CⅠ上,367個(gè)位于CⅡ上,所有rRNA和tRNA基因都位于CⅠ上。問號(hào)鉤端螺旋體、Tp和Bb有315個(gè)同源基因[22]。與Tp不同的是,問號(hào)鉤端螺旋體缺乏編碼己糖激酶的基因,但其有Tp中不存在的編碼完整長鏈脂肪酸利用系統(tǒng)、三羧酸循環(huán)(TCA)和呼吸電子傳遞鏈的基因[22]。因此,Tp的腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)產(chǎn)生方式與問號(hào)鉤端螺旋體不同,Tp通過糖酵解途徑生成ATP,而問號(hào)鉤端螺旋體通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP[22]。除此之外,問號(hào)鉤端螺旋體通過編碼完整的氨基酸和核苷酸生物合成代謝系統(tǒng)來獲得營養(yǎng)[23],而Tp編碼廣泛的轉(zhuǎn)運(yùn)體從宿主獲取營養(yǎng)[24]。與Tp一樣的是,問號(hào)鉤端螺旋體使用FlaA鞘蛋白和FlaB核心蛋白作為其內(nèi)鞭毛細(xì)絲的基本成分[22]。

2.2.2 Tp與伯氏疏螺旋體基因組比較 Bb最顯著的特征之一是有一個(gè)不尋常的基因組,其中包含一個(gè)線性染色體和許多線性/環(huán)狀質(zhì)粒[25]。Bb的線性染色體包含了853個(gè)基因,編碼一組用于DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和能量代謝的基本蛋白質(zhì)[20]。同時(shí),Bb的11個(gè)質(zhì)粒上的30個(gè)基因中,大多數(shù)沒有已知的生物學(xué)功能[20]。

Tp和Bb之間差異有顯著性,兩個(gè)病原體基因組的整體直系同源系數(shù)值約為0.43[26]。參與核心生物學(xué)功能的基因同源性很高,而參與特定過程的基因存在顯著的變異性[26]。Tp和Bb有476個(gè)ORF同源,其中有76%具有預(yù)測(cè)的生物學(xué)功能,24%編碼功能未知蛋白質(zhì)[3]。編碼功能未知蛋白的ORF中有近50%是螺旋體獨(dú)有的,這組螺旋體屬獨(dú)有的蛋白質(zhì)可能決定了螺旋體結(jié)構(gòu)和生理的特殊性,可能與Tp和Bb感染人類并引起慢性傳播性疾病的能力有關(guān)。此外,Tp中有90個(gè)功能未知的ORF與Bb染色體上的編碼基因相匹配,沒有ORF與Bb質(zhì)粒上的編碼基因匹配,表明質(zhì)粒是Bb所特有的[3,20]。Tp的第三密碼子位置有G或C偏向,Bb在該位置有A或T偏向,這使得Tp基因組中的G+C含量幾乎是Bb基因組中的兩倍[3]。Tp與Bb基因組之間不同的G+C含量會(huì)造成總體密碼子使用的偏差,是預(yù)測(cè)編碼序列中的氨基酸組成不同[20]。

2.2.3 Tp和齒垢密螺旋體基因組比較 齒垢密螺旋體是一種與牙周病相關(guān)的口腔螺旋體。齒垢密螺旋體的基因組構(gòu)象與Tp一致,但其基因組大小比Tp大得多[21]。齒垢密螺旋體預(yù)計(jì)編碼2 786個(gè)CDS,其中734個(gè)CDS是獨(dú)特的[21]。盡管Tp和齒垢密螺旋體基因組大小顯著不同,但這兩種病原體間存在的穩(wěn)定RNA的數(shù)量幾乎相同[21]。有觀點(diǎn)認(rèn)為,1.14 Mb的Tp基因組是由齒垢螺旋體缺失和(或)分化而來[27]。Tp基因組與齒垢密螺旋體基因組可以共享有限的核苷酸相似性,大約25%的齒垢密螺旋體基因與Tp基因組中68%的CDS最匹配[27]。除了編碼核糖體和鞭毛蛋白的高度保守操縱子外,Tp基因組與齒垢密螺旋體基因組之間基本上不存在同線性[27]。與齒垢密螺旋體相比,Tp沒有公認(rèn)的限制修飾系統(tǒng)、插入序列元件或噬菌體[21]。Tp基因組編碼一個(gè)有12個(gè)成員家族(TprA-L)的假定膜蛋白,這個(gè)家族蛋白具有免疫保護(hù)性和調(diào)理活性,編碼這些蛋白的基因家族在不同亞種和菌株之間表現(xiàn)出異質(zhì)性[28]。齒垢密螺旋體中也擁有一個(gè)與該基因家族相關(guān)的成員,即TDE0405,其編碼齒垢密螺旋體的主要外鞘蛋白[28]。同時(shí),Tp和齒垢密螺旋體都具有磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(phosphotransferase system,PTS)的HPr、酶Ⅰ和酶ⅡA,但沒有PTS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合物,表明這些蛋白質(zhì)在Tp和齒垢密螺旋體體內(nèi)只起著調(diào)節(jié)作用[21]。齒垢密螺旋體中存在糖酵解和TCA循環(huán),表明其產(chǎn)生ATP的方式與Tp相似都是由糖發(fā)酵產(chǎn)生。但與Tp不同的是,齒垢密螺旋體可以從頭合成脂肪酸、輔因子和核苷酸[21]。

3 展 望

比較基因組學(xué)應(yīng)用于Tp,使Tp的生物特性、進(jìn)化方向以及致病機(jī)制等方面更進(jìn)一步得到了解。目前已經(jīng)有許多Tp標(biāo)準(zhǔn)株和臨床株的全基因組測(cè)序工作已經(jīng)完成。通過Tp菌株間的比較,Tp的主要突變區(qū)域和保守區(qū)域被明確,這為梅毒疫苗的開發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。比較Tp基因組與其他致病性螺旋體基因組的差異為研究Tp的致病機(jī)制提供了新的方向。