李曉娜，齊先梅，張?zhí)锾?，?婧

中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 病理生理學系，北京 100005

硅沉著病是由長期吸入大量有害粉塵引起的以彌漫性肺纖維化為特征的疾病。硅沉著病造成肺功能低下、炎性反應、最終導致呼吸衰竭[1-2]。目前缺乏有效的治療藥物,因此探究硅沉著病的治療靶點已迫在眉睫。SiO2通過呼吸道進入肺泡,肺泡巨噬細胞吞噬SiO2,最終導致大量炎性因子被釋放,主要為腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)和白介素6(IL-6),促進纖維化[1,3]。FcγRⅢ是Fcgr3基因編碼的一種膜蛋白,是免疫球蛋白G的受體之一,具有增強攝取、吞噬融合、激活免疫和調節(jié)細胞因子的生理功能。在巨噬細胞中,FcγRⅢ對大腸桿菌的吞噬起到了關鍵的作用,由此影響機體炎性水平[4]。目前,Fcgr3在SiO2吞噬過程中的作用仍未見報道,探究參與吞噬SiO2的受體將有利于新的治療靶點的發(fā)現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞:人胚腎細胞系293T(實驗室保存),小鼠肺泡巨噬細胞系MH-S(普諾賽公司)。

1.1.2 試劑:質粒pLKO.1(實驗室保存),Opti-MEM 培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司),Lipofactamine 2000和FcγRⅢ抗體(Invitrogen公司),高糖DMEM培養(yǎng)基和青鏈霉素(索萊寶公司),MH-S細胞專用培養(yǎng)基(普諾賽公司),ELISA試劑盒(R&D公司),反轉錄試劑盒(天根公司),晶體SiO2(Forsman Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒沉默質粒的構建:選擇用于shRNA表達的慢病毒載體pLKO.1-shRNA,其圖譜如下(圖1):pLKO.1-shNC為陰性對照質粒,psPAX2和pMD2.G為包裝質粒。

圖1 pLKO.1-shRNA質粒圖Fig 1 Map of pLKO.1 containing a shRNA insert

表1 Fcgr3 shRNA序列Table 1 Sequence of Fcgr3 shRNA

1.2.2 慢病毒的包裝:將細胞分為4組:對照組(pLKO-shNCshRNA)與FcγRⅢ沉默組(pLKO-Fcgr3shRNA1、pLKO-Fcgr3shRNA2、pLKO-Fcgr3shRNA3)。在FcγRⅢ沉默組中,將pLKO-Fcgr3shRNA1/pLKO-Fcgr3shRNA2/pLKO-Fcgr3shRNA3、psPAX2、pMD2.G各10 μg加入1.5 mL培養(yǎng)基opti-MEM中,同時將25 μL Lipofactamine 2000加入到1.5 mL培養(yǎng)基opti-MEM中,分別室溫孵育5 min后,將質粒混合液與Lipofactamine 2000混合液混勻,室溫孵育20 min。滴加入無抗生素的含10%血清的細胞培養(yǎng)基中。6 h后更換含有10%血清的DMEM高糖培養(yǎng)基10 mL,24 h后第一次收取細胞上清即病毒液,0.22 μm濾器過濾后-80 ℃冰箱保存。培養(yǎng)皿加入新的完全培養(yǎng)基10 mL,48 h后第2次收取細胞上清即病毒液,0.22 μm濾器過濾后-80 ℃冰箱保存。60 h后第3次收取細胞上清即病毒液,0.22 μm濾器過濾后-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 穩(wěn)定細胞系的建立:將MH-S細胞接種在6孔板中,每孔接種細胞數(shù)為5×103個。貼壁12 h后,吸棄培養(yǎng)液,加入2 mL病毒稀釋液(病毒∶完全培養(yǎng)基=1∶1),5 μL Polybrene輔助病毒感染細胞,12 h后,吸棄培養(yǎng)液。上述步驟重復兩次。加入含2 μg/mL 嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基篩選細胞,篩選1周后收集細胞,提取RNA及蛋白質進行檢測。

1.2.4 MH-S的分組及處理:將穩(wěn)定細胞系分為MH-S+sh-NC、MH-S+SiO2+sh-NC、MH-S+sh-Fcgr3和MH-S+SiO2+sh-Fcgr3組。以每孔5×105個細胞接種在6孔板中。貼壁12 h后,吸棄培養(yǎng)液,加入含或不含濃度為100 mg/L SiO2的MH-S專用培養(yǎng)基,共2 mL。連續(xù)刺激12 h后,收集細胞上清-20 ℃保存,收集細胞-80 ℃保存。

1.2.5 qPCR檢測Fcgr3沉默效率及炎性因子轉錄水平:細胞經(jīng)Trizol法提取RNA,反轉錄為cDNA,設計相應引物,進行PCR實驗,分析熔解曲線,通過2-ΔΔCt計算mRNA相對表達水平,比較Fcgr3沉默效率及沉默前后炎性因子的表達。

1.2.6 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測Fcgr3沉默效率:提取sh-NC、sh-Fcgr3-1、sh-Fcgr3-2和sh-Fcgr3-3處理的細胞的蛋白。在蛋白液中加入載樣緩沖液,將不同樣品調整為相同濃度和體積,置于-20 ℃保存。蛋白上樣量為20 μg,電泳條件為80 V/30 min、120 V/90 min。電轉條件為260 mA/90 min。5%脫脂牛奶封閉1 h,一抗于4 ℃條件下孵育18 h,TBST清洗后,用二抗于室溫孵育1 h,TBST清洗后,加入化學發(fā)光液曝光,使用化學發(fā)光儀拍照,Image J分析吸光值。

表2 PCR引物序列Table 2 PCR primer sequences

1.2.7 ELISA測定炎性因子表達:收集的細胞上清,常溫條件下,800 r/min離心5 min,吸取上清。使用ELISA試劑盒測定炎性因子的含量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 shRNA能夠顯著沉默MH-S細胞中的Fcgr3

與對照組相比,在shRNA病毒處理的細胞中,shRNA沉默細胞的Fcgr3轉錄水平和蛋白水平均改變,其中sh-Fcgr3-3的沉默效率最高(P<0.05)(圖2),后續(xù)將使用sh-Fcgr3-3穩(wěn)定表達的細胞系進行實驗。

A.mRNA expression of Fcgr3 in MH-S cells; B.protein expression of FcγRⅢ in MH-S cells; *P<0.05 compared with the sh-NC group.圖2 MH-S細胞 Fcgr3沉默效率的檢測Fig 2 Silencing efficiency validation of Fcgr3 in MH-S cells n=3)

2.2 沉默F(xiàn)cgr3減少SiO2誘導的MH-S細胞炎性因子mRNA的表達

與MH-S+sh-NC組相比, MH-S+SiO2+sh-NC組細胞的Tnf、Il1b和Il6的mRNA水平明顯升高(P<0.05)(圖3);而與MH-S+SiO2+sh-NC組相比,MH-S+SiO2+sh-Fcgr3組細胞的Tnf、Il1b和Il6的mRNA水平顯著降低(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with the MH-S+sh-NC group; #P<0.05 compared with the MH-S+SiO2+sh-NC group.圖3 qPCR檢測炎性因子的mRNA水平Fig 3 The mRNA levels of inflammatory factors were measured by qPCR n=3)

2.3 沉默F(xiàn)cgr3減少SiO2刺激的MH-S細胞培養(yǎng)上清中炎性因子的含量

與MH-S+sh-NC組相比, MH-S+SiO2+sh-NC組細胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-6的表達水平明顯升高(P<0.05,圖4);而與MH-S+SiO2+sh-NC組相比,MH-S+SiO2+sh-Fcgr3組細胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-6的表達水平顯著下降(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with the MH-S+sh-NC group; #P<0.05 compared with the MH-S+SiO2+sh-NC group.圖4 ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中炎性因子的含量Fig 4 The inflammatory factors contents in cell culture supernatants were measured by n=3)

3 討論

FcγRⅢ在結構上分為胞外區(qū)、胞膜區(qū)和胞質區(qū)。其胞質區(qū)含有免疫受體酪氨酸激活基序,當受體與其配體結合后,其酪氨酸被磷酸化,招募其他蛋白激酶或銜接蛋白,進一步向細胞內傳導信號促進吞噬和炎性因子表達[5]。炎性反應及炎性因子在矽肺纖維化中發(fā)揮著重要的作用,肺泡巨噬細胞吞噬SiO2后,誘導巨噬細胞產生TNF-α、IL-1β和IL-6[6-8]。TNF-α和IL-1β促進膠原沉積,而IL-6則與單核細胞、中性粒細胞的浸潤有關[9-10]。FcγRⅢ是否可以參與巨噬細胞SiO2的吞噬介導TNF-α、IL-1β和IL-6的表達,目前沒有明確的研究報道。有研究表明,巨噬細胞上的FcγRⅢ可以通過募集SYT同源磷酸酶-1(SHP-1),抑制下游磷脂酰肌醇三羥基激酶(PI3K)的磷酸化,抑制具有膠原結構的巨噬細胞受體(MACRO)對大腸桿菌的吞噬,最后導致大腸桿菌清除受影響,使得機體炎性反應增強[4]。亦有研究表明,v-maf肌肉腱膜纖維肉瘤癌基因同源物B(MafB)可以通過上調FcγRⅢ促進巨噬細胞系RAW264.7的吞噬功能[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)沉默巨噬細胞系Fcgr3后能夠顯著降低炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的產生,與以往研究報道的FcγRⅢ的促炎作用相一致[12],巨噬細胞釋放的IL-1β較少,濃度較低不在檢測范圍內,結果未在本文中顯示。既往研究證實清道夫受體家族蛋白參與了巨噬細胞對SiO2的吞噬過程,包括MARCO、清道夫受體(SR-A1)、清道夫受體(SR-B1)和清道夫受體(CD36)。MARCO和CD36的激活與FcγRⅢ的下游蛋白的激活同時發(fā)生,包括脾酪氨酸激酶(SYK)、PI3K和SH2結構域肌醇磷酸酶(SHIP1),且抑制FcγRⅢ下游蛋白的磷酸化,如PI3K和SYK,可顯著抑制清道夫受體的吞噬作用[13-14]。結合先前的研究與本文的結果,推測FcγRⅢ可能通過與清道夫受體家族蛋白協(xié)同作用,介導下游信號傳導過程,參與巨噬細胞系對SiO2的吞噬過程,進而影響炎性因子的產生,具體的協(xié)同機制仍需要更進一步的探索。

綜上所述,本研究表明FcγRⅢ促進了SiO2刺激的炎性因子的產生,有望作為硅沉著病治療的潛在靶點。