張博熙，金壬順，呂紅明，徐彬，李士澤

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

我國(guó)北方寒冷地區(qū)，冬季漫長(zhǎng)且春秋季節(jié)氣溫變化較大，幼齡動(dòng)物體溫調(diào)節(jié)能力較差，更易受到突如其來的冷空氣影響進(jìn)而誘發(fā)低溫癥導(dǎo)致死亡。有研究指出低于16 ℃的冷環(huán)境，會(huì)抑制動(dòng)物自發(fā)運(yùn)動(dòng)和探究行為，引起焦慮增加[1]。當(dāng)機(jī)體暴露在低溫環(huán)境下時(shí)，機(jī)體會(huì)通過顫抖、非顫抖和自主活動(dòng)等，增加熱量的產(chǎn)生來抵御冷暴露[2]。低溫刺激下，動(dòng)物容易發(fā)生冷應(yīng)激，而冷應(yīng)激可能會(huì)促進(jìn)潛在疾病的發(fā)生。此外，寒冷造成的應(yīng)激對(duì)動(dòng)物的行為和人的學(xué)習(xí)記憶能力等都會(huì)造成嚴(yán)重的影響[3-4]，影響動(dòng)物和人的認(rèn)知表現(xiàn)[4]。因此，冷應(yīng)激作為易誘發(fā)動(dòng)物疾病的因素是北方畜牧業(yè)發(fā)展的重要障礙之一。

在以往的研究中，海馬體參與構(gòu)成腦組織邊緣系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)，率先被認(rèn)為是動(dòng)物認(rèn)知中的關(guān)鍵區(qū)域，此網(wǎng)絡(luò)涉及學(xué)習(xí)、記憶等多個(gè)方面。海馬也是控制下丘腦-垂體-腎上腺軸（The hypothalamic pituitary adrenal axis，HPA axis）功能的關(guān)鍵大腦區(qū)域。早期應(yīng)激誘導(dǎo)的海馬功能障礙會(huì)導(dǎo)致HPA 軸失調(diào)。海馬體在生活中也與情緒處理有關(guān)，在受到急性刺激后，HPA軸激活，釋放大量應(yīng)激激素，同時(shí)作用于海馬體，造成損傷。血清中去甲腎上腺素和多巴胺等均可能升高[1]，持續(xù)的高水平狀態(tài)可能會(huì)進(jìn)一步造成腦神經(jīng)元損傷[5]。生物體對(duì)氣味的選擇性，空間視圖能力，聽覺判斷能力以及情景記憶能力都與海馬體功能密不可分，也有研究報(bào)道海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶與其神經(jīng)發(fā)生和樹突形態(tài)息息相關(guān)[6]。動(dòng)物幼年時(shí)期是身體發(fā)育、學(xué)習(xí)和記憶能力建立的關(guān)鍵時(shí)期，海馬體作為高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)的重要部位，其發(fā)育是至關(guān)重要的[7]。雖然大部分大腦發(fā)育發(fā)生在生命的第一年，但海馬體的發(fā)育與整個(gè)幼年時(shí)期持續(xù)相關(guān)[8]，其發(fā)育過程中可能會(huì)受到多種應(yīng)激源的影響，例如急慢性的冷熱刺激、創(chuàng)傷后應(yīng)激、藥物刺激等。越來越多的研究揭示了冷環(huán)境誘導(dǎo)機(jī)體穩(wěn)態(tài)的改變及其機(jī)制。徐晶等[9]研究發(fā)現(xiàn)，急性冷暴露2、6 和12 h，會(huì)對(duì)斷奶仔豬骨骼肌、肺臟、腎臟等造成不同程度的損傷。前期的研究表明，每天3 h 連續(xù)7 d 的4 ℃慢性冷暴露會(huì)誘導(dǎo)小鼠海馬神經(jīng)元凋亡[10]相關(guān)蛋白表達(dá)升高。但目前急性冷暴露對(duì)幼齡動(dòng)物海馬體是否造成損傷尚未可知。

凋亡作為神經(jīng)元死亡的一種主要方式，在腦損傷以及神經(jīng)退行性疾病等一系列復(fù)雜的病理過程中扮演著極為重要的角色。細(xì)胞凋亡自20 世紀(jì)末期被發(fā)現(xiàn)后，其相關(guān)研究絡(luò)繹不絕，急性冷應(yīng)激與細(xì)胞凋亡之間存在著緊密的聯(lián)系[11-13]。細(xì)胞凋亡是半胱天冬氨酸蛋白酶（Caspase）介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡過程，在機(jī)體中，Caspase 亞家族通常以前體的形式存在，本身無活性，Caspase-9 作為凋亡的觸發(fā)劑，可激活Caspase-3，活化后直接通過自身介導(dǎo)的信號(hào)途徑導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[14]。細(xì)胞凋亡也與Bcl-2 基因家族有密切關(guān)系，Bax 與Bcl-2 基因都屬于Bcl-2 基因家族，其中Bax 基因促進(jìn)凋亡，Bcl-2 基因抑制凋亡。在多細(xì)胞生物體的正常生命周期中，通過平衡細(xì)胞增殖和死亡來維持一定的機(jī)體穩(wěn)態(tài)。當(dāng)正常的凋亡進(jìn)程失敗或發(fā)生過度凋亡時(shí)，可能導(dǎo)致海馬神經(jīng)元功能受損，影響正常的學(xué)習(xí)和記憶功能。

鑒于幼齡動(dòng)物在北方高寒區(qū)畜牧養(yǎng)殖業(yè)中更容易受到環(huán)境影響，可能伴隨著巨大的經(jīng)濟(jì)損失風(fēng)險(xiǎn)，探究冷應(yīng)激對(duì)幼齡動(dòng)物造成的損傷情況變得尤為重要。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

雄性和雌性C57BL/6 小鼠（8 周齡，22～24 g）購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司。在24±2 ℃的環(huán)境溫度和40%的相對(duì)濕度下，在12 h/12 h 的光照/黑暗周期（從早上8：00 到晚上20：00 開燈）下，在獨(dú)立通風(fēng)的籠具（Individually Ventilated Cages，IVC）中預(yù)喂食物和水，為期1 周。按照1∶2 的比例將雄性小鼠和雌性小鼠進(jìn)行合籠飼養(yǎng)，第19 天將懷孕母鼠單獨(dú)飼并更換充足潔凈墊料，第21 天后生產(chǎn)仔鼠，與母代雌鼠共同飼養(yǎng)3 周后分離，選取20 只體態(tài)正常的雄性斷奶小鼠，隨機(jī)分成4 組（每組5 只）后飼養(yǎng)3 d，以熟悉環(huán)境、建立社會(huì)關(guān)系和避免斷奶應(yīng)激后，進(jìn)行急性冷暴露實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物分為4 組：室溫組和急性冷暴露3、6 和9 h 組（分別稱為：RT、CE-3 h、CE-6 h和CE-9 h 組）。冷暴露的方法為將冷暴露組轉(zhuǎn)移到溫度為4 ℃的氣候室，根據(jù)時(shí)間不同，取出后立即進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

RIPA 裂解液、甲基磺酰氟（PMSF，100 mmol·L-1）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、SDS-PAGE 5×蛋白上樣緩沖液購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL 顯色液、PVDF 膜（0.22/0.45 μm）購(gòu)自美國(guó)默克密理博公司；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；Caspase-9 一抗、Caspase-3 一抗、β-actin 一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，Bax 與Bcl-2 一抗購(gòu)自成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 海馬體樣品采集

急性冷暴露后，隨機(jī)選取每組內(nèi)2 只立即采集全腦組織固定于4%甲醛固定液中，待TUNEL 染色試驗(yàn)。另外3 只進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，于冰上取出全腦組織，刀片縱切后分別剝離左右側(cè)海馬體，在預(yù)冷的PBS 中洗滌，在液氮中迅速冷凍。并在-80 ℃下儲(chǔ)存，直到進(jìn)一步使用。

1.4 TUNEL 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將固定好的全腦組織，根據(jù)TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書中相關(guān)方法，脫蠟；通透；孵育Tunel反應(yīng)液、POD 反應(yīng)液；DAB 顯色；染核；封片；最后鏡檢拍照。以計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，觀察小鼠海馬體的凋亡情況，其中凋亡的神經(jīng)元細(xì)胞表現(xiàn)為褐色。

1.5 總蛋白提取及Western blot 檢測(cè)

將苯甲基磺酰氟（PMSF）和RIPA 裂解液按照1∶100 配制后，取適量與海馬組織混勻，使用冷凍混合球磨儀充分研磨后，4 ℃靜置30 min，且每10 min充分震蕩一次，12 000 r·min-1離心10 min，謹(jǐn)慎將上清吸取出備用。使用BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度，通過計(jì)算調(diào)整至各組相同。將蛋白樣品與5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液按照4∶1 的比例混合并煮沸10 min，使蛋白質(zhì)充分變性。

根據(jù)目的蛋白的大小，配制適宜的分離膠和濃縮膠，并插入15 孔梳子待凝固備用。加入樣品后，首先選用80 V 恒壓電泳，待樣品完全進(jìn)入分離膠后，調(diào)整為120 V 恒壓電泳至結(jié)束。于-20 ℃環(huán)境中，使用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)印，根據(jù)目的蛋白大小調(diào)整轉(zhuǎn)印時(shí)間。配制5%脫脂乳，室溫封閉1 h。按照抗體說明書配制抗體，Caspase-9（1∶1 000）、Caspase-3（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）與β-actin（1∶1 000），置于4 ℃搖床孵育過夜。次日洗膜5 次，每次5 min。對(duì)應(yīng)二抗（1∶5 000）室溫下孵育1 h，然后洗膜5 次，每次5 min。將ECL 顯色液按照1∶1 配制，將混勻的顯色液均勻覆蓋在膜表面，使用ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)配套分析軟件Image J 對(duì)目的條帶灰度值進(jìn)行分析。使用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），使用Graph Pad Prism 8（LaJolla，CA，USA）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行柱狀圖繪制。所有數(shù)據(jù)均表示為“mean ± SEM”，P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，NS 表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性冷暴露對(duì)海馬體凋亡染色的影響

斷奶小鼠海馬體TUNEL 染色結(jié)果顯示，RT 組小鼠海馬體中幾乎無陽(yáng)性染色細(xì)胞（圖1A、1B 和1C），而CE-9 h 組小鼠海馬體中有大量陽(yáng)性染色的細(xì)胞（圖1D、1E 和1F），以棕黃色的深染狀態(tài)呈現(xiàn)（圖1E 和1F 紅色箭頭）。

圖1 斷奶小鼠海馬體TUNEL 染色結(jié)果Fig.1 Results of TUNEL staining in the hippocampus of weaned mice

2.2 急性冷暴露對(duì)Caspase-9 蛋白表達(dá)的影響

利用Western blot 對(duì)斷奶小鼠急性冷暴露后海馬組織中Caspase-9 的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。如圖2 所示，與RT 組相比，Caspase-9 蛋白表達(dá)水平在急性冷暴露3、6 和9 h 組均升高，且在急性冷暴露3 和6 h 組極顯著升高（圖2A 和2B，P＜0.001），CE-9h 組顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果表明急性冷暴露3、6 和9 h均可以促進(jìn)Caspase-9 的蛋白表達(dá)。

圖2 急性冷暴露對(duì)海馬體Caspase-9 蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Detection results of Caspase-9 protein expression in hippocampus by acute cold exposure

2.3 急性冷暴露對(duì)Caspase-3 蛋白表達(dá)的影響

利用Western blot 對(duì)斷奶小鼠急性冷暴露后海馬組織中Caspase-3 的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。如圖3 所示，與RT 組相比，Caspase-3 蛋白表達(dá)水平在急性冷暴露3、6 和9 h 組均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，急性冷暴露3 和6 h 組極顯著升高（圖3A 和3B，P＜0.01），CE-9 h組顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果表明急性冷暴露3、6 和9 h均可以促進(jìn)Caspase-3 的蛋白表達(dá)。

圖3 急性冷暴露對(duì)海馬體Caspase-3 蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Detection results of Caspase-3 protein expression in hippocampus by acute cold exposure

2.4 急性冷暴露對(duì)Bcl-2/Bax 蛋白表達(dá)的影響

利用Western blot 對(duì)關(guān)鍵促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白Bax/Bcl-2 蛋白表達(dá)的比值水平進(jìn)行檢測(cè)。如圖4 所示，與RT 組相比，Bax/Bcl-2 蛋白表達(dá)的比值水平在急性冷暴露3、6 和9 h 組均顯著升高（圖4A 和4B，P＜0.05）。結(jié)果表明急性冷暴露3、6 和9 h 均可以促進(jìn)Bax/Bcl-2 蛋白表達(dá)的比值，并且呈時(shí)間依賴性。

圖4 急性冷暴露對(duì)海馬體Bax/Bcl-2 蛋白表達(dá)的比值檢測(cè)結(jié)果Fig.4 The ratio of the expression of Bax/Bcl-2 protein in hippocampus after acute cold exposure

3 討論

試驗(yàn)使用三周齡斷奶小鼠模擬動(dòng)物幼齡時(shí)期，當(dāng)新生的C57BL/6 小鼠發(fā)育至三周齡時(shí)，將雄性幼鼠分離，置于25±2 ℃的氣候室中飼養(yǎng)3 d 后，避免斷奶應(yīng)激。急性冷暴露后，其神經(jīng)系統(tǒng)損傷情況可基本反應(yīng)幼齡動(dòng)物以及兒童時(shí)期冷應(yīng)激后的潛在危害。建立急性冷應(yīng)激斷奶小鼠模型，檢測(cè)海馬體凋亡相關(guān)蛋白，探究急性冷應(yīng)激后幼齡動(dòng)物海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況，以期為北方寒冷地區(qū)畜牧生產(chǎn)中幼齡仔畜預(yù)防冷應(yīng)激提供可靠幫助。

海馬體與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病具有密切的關(guān)系，現(xiàn)階段針對(duì)海馬體的研究，包括海馬神經(jīng)發(fā)生，齒狀回中神經(jīng)元的存活，學(xué)習(xí)和記憶能力，焦慮程度以及對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的影響（如血清素、乙酰膽堿和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等），都在神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病中被廣泛研究。海馬組織作為大腦邊緣系統(tǒng)內(nèi)重要的組成部分，其生理功能尤為重要。海馬體具有高度保守的功能，不同部位具有獨(dú)特的功能。位于海馬體背側(cè)部的CA1 區(qū)主要功能為長(zhǎng)期記憶的建立和空間方向能力的鞏固；而情緒和情感的調(diào)節(jié)是腹側(cè)部海馬CA3 區(qū)的主要功能。不同程度的應(yīng)激反應(yīng)，會(huì)造成海馬神經(jīng)元功能及突觸損壞，有研究表明，冷應(yīng)激通過改變神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)和減少數(shù)量，進(jìn)而影響神經(jīng)元功能，導(dǎo)致相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的異常分泌[5]。有對(duì)幼兒的研究表明，海馬CA1 區(qū)會(huì)在4～5 歲時(shí)增大體積，而海馬CA2-4 區(qū)和齒狀回區(qū)在5～6 歲時(shí)增大體積[8]。因此，幼兒早期到中期是海馬發(fā)育的重要的時(shí)期，幼年的海馬體發(fā)育對(duì)后期學(xué)習(xí)記憶的建立有極大的影響。有研究表明，帕金森病模型中，小鼠海馬區(qū)發(fā)生細(xì)胞凋亡[15]，促進(jìn)帕金森病小鼠的運(yùn)動(dòng)障礙和身體協(xié)調(diào)性下降。此外，創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠模型中細(xì)胞凋亡誘發(fā)海馬體萎縮導(dǎo)致大鼠表現(xiàn)出明顯的空間記憶受損[16]。這些研究都表明了細(xì)胞凋亡會(huì)影響海馬體功能，進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)性疾病。吳佳穎[17]發(fā)現(xiàn)，-15 ℃急性冷暴露3 h 會(huì)使大鼠血腦屏障通透性升高，且記憶力有明顯的下降趨勢(shì)。前人研究發(fā)現(xiàn)，小鼠產(chǎn)前冷暴露會(huì)誘導(dǎo)下丘腦凋亡相關(guān)蛋白變化[18]。這些研究都暗示冷暴露可能會(huì)對(duì)海馬體在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)有潛在影響。研究發(fā)現(xiàn)，TUNEL 染色結(jié)果顯示CE-9 h 組斷奶小鼠海馬體存在一定數(shù)量的陽(yáng)性染色細(xì)胞，而RT 組無明顯陽(yáng)性染色細(xì)胞。以上研究提示急性冷暴露9 h會(huì)導(dǎo)致斷奶小鼠海馬體發(fā)生細(xì)胞凋亡，造成神經(jīng)元損傷，這種損傷可能會(huì)進(jìn)一步損害動(dòng)物成年后的學(xué)習(xí)記憶能力，甚至成為神經(jīng)退行性疾病的誘因。然而研究只評(píng)估了急性冷暴露對(duì)斷奶小鼠海馬體凋亡損傷的影響，而未直接對(duì)急性冷暴露后斷奶幼鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力進(jìn)行評(píng)測(cè)，這是研究的不足之處。此外，研究未對(duì)急性冷暴露后海馬體激素水平進(jìn)行檢測(cè)，無法通過評(píng)估各種激素的水平來判斷海馬神經(jīng)元損傷的根本原因。

細(xì)胞凋亡是一種程序化的細(xì)胞死亡形式，在根除威脅發(fā)育、體內(nèi)平衡的異常細(xì)胞方面起著至關(guān)重要的作用。為確保細(xì)胞凋亡的適當(dāng)發(fā)生，內(nèi)在細(xì)胞凋亡途徑在不同階段受到控制。機(jī)體對(duì)抗應(yīng)激時(shí)會(huì)增強(qiáng)Caspase-9 的自動(dòng)加工，Caspase-9 是內(nèi)在或線粒體凋亡途徑中的關(guān)鍵參與者，Caspase-9 在凋亡體復(fù)合物上被激活以保持催化狀態(tài)。若未能激活Caspase-9，會(huì)導(dǎo)致退行性和發(fā)育障礙甚至癌癥等不良后果。Pro-Caspase-9 作為內(nèi)在細(xì)胞凋亡途徑的起始半胱天冬酶，是通過裂解與細(xì)胞凋亡有關(guān)的多個(gè)關(guān)鍵參與者來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)所必需的。Caspase-9 促進(jìn)Caspase-3 激活的信號(hào)通常被認(rèn)為是執(zhí)行細(xì)胞凋亡[19]。 被稱為細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者Caspase-3 進(jìn)一步發(fā)揮功能。研究結(jié)果顯示，急性冷暴露3 h 時(shí)，Pro-Caspase-9 大量活化成Cleaved-Caspase-9，此時(shí)Cleaved-Caspase-9 蛋白表達(dá)極顯著升高，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。并進(jìn)一步將Pro-Caspase-3 剪切成具有活性的Cleaved-Caspase-3 執(zhí)行凋亡，這種Cleaved-Caspase-3 蛋白表達(dá)的極顯著升高狀態(tài)持續(xù)到急性冷暴露6 h 并達(dá)到峰值，提示此時(shí)細(xì)胞凋亡程度加劇。急性冷暴露9 h 時(shí)Cleaved-Caspase-9 與Cleaved-Caspase-3 蛋白表達(dá)略有下降，但與RT 組相比仍保持升高的狀態(tài)。可能是由于斷奶小鼠耐受力較低，急性冷暴露通過激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷抑制了Cleaved-Caspase-9 與Cleaved-Caspase-3 蛋白的進(jìn)一步表達(dá)。此外，研究結(jié)果表明急性冷暴露后，Bax/Bcl-2 蛋白表達(dá)的比值顯著升高，隨著冷暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，可能形成Bax/Bax 同源二聚體，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，促使小鼠海馬體向細(xì)胞凋亡的趨勢(shì)發(fā)展。但隨著Bcl-2 蛋白表達(dá)的增加，可能會(huì)形成更穩(wěn)定的Bcl-2/Bax 的異二聚體，并發(fā)揮抑制凋亡的作用。因此，CE-9h 組Cleaved-Caspase-9 與Cleaved-Caspase-3 蛋白表達(dá)略有下降的原因，可能是Bcl-2/Bax 的異二聚體通過阻斷上游Caspase 蛋白酶的激活，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡的持續(xù)發(fā)展。對(duì)大鼠的研究表明，海馬神經(jīng)元中Caspase-3 和Caspase-9 的活性增強(qiáng)會(huì)誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡，導(dǎo)致大鼠海馬神經(jīng)元組織形態(tài)學(xué)發(fā)生顯著變化，可加重大鼠認(rèn)知障礙[20-21]。對(duì)小鼠的研究表明，海馬區(qū)Caspase-9 和Caspase-3 的蛋白表達(dá)增加導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加[22]，會(huì)誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)變性，促進(jìn)神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。與研究結(jié)果相同的是，急性冷暴露誘導(dǎo)了斷奶小鼠海馬體Caspase-3、Caspase-9 以及Bax/Bcl-2 比值的表達(dá)增加。因此可以推測(cè)，急性冷暴露通過激活Casepase 信號(hào)通路誘導(dǎo)斷奶小鼠海馬體發(fā)生凋亡，進(jìn)而會(huì)造成海馬神經(jīng)元損傷，導(dǎo)致海馬功能下降。但研究未檢測(cè)斷奶小鼠海馬體炎癥、抗氧化等相關(guān)信號(hào)通路的變化，因此，急性冷暴露誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)4 ℃急性冷暴露3、6 和9 h可以增加凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9、Caspase-3 和Bax/Bcl-2 比值的表達(dá)，增加斷奶小鼠海馬體凋亡陽(yáng)性染色細(xì)胞。說明急性冷暴露通過激活Casepase 信號(hào)通路誘導(dǎo)斷奶小鼠海馬神經(jīng)元發(fā)生細(xì)胞凋亡。試驗(yàn)為北方幼齡動(dòng)物預(yù)防冷應(yīng)激提供理論基礎(chǔ)并期望為抗急性冷應(yīng)激藥物的開發(fā)尋找相關(guān)靶點(diǎn)，為高寒地區(qū)的幼齡動(dòng)物防治冷災(zāi)害提供新的理念，為畜牧生產(chǎn)行業(yè)提供幫助。