王靜然，李鵬飛，劉 苗，陶艷琳，劉亞男，朱淑芬

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院脊柱外科， 內(nèi)蒙古 呼和浩特010017；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

隨著呼吸道微生物檢測方法的進(jìn)步， 尤其是高 通 量 測 序 技 術(shù) （high-throughput sequencing，NGS）的出現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)了痰液微生物組學(xué)超越單一病原微生物的檢測， 打破了人類對(duì)下呼吸道無菌狀態(tài)的認(rèn)識(shí)［1］。 16S rDNA 測序技術(shù)證明了下呼吸道存在一個(gè)獨(dú)特的處于動(dòng)態(tài)平衡中的微生物群落，并且該微生物群落以一個(gè)優(yōu)化的比例維持微生態(tài)平衡，在預(yù)防呼吸系統(tǒng)疾病中發(fā)揮積極作用。呼吸道微生態(tài)處于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)是由Saeedi 等［2］提出的， 認(rèn)為從呼吸道進(jìn)入肺內(nèi)的細(xì)菌隨后將被迅速清除，使得肺部微生物群處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，稱為短暫停留不定居 （transient but not resident，TBNR）。 微生物群的多樣性和組成由許多因素決定，包括宿主遺傳因素、宿主免疫力及環(huán)境因素［3］。 近年來，不斷有新的呼吸道菌群檢測方法出現(xiàn)，人們對(duì)于呼吸道微生態(tài)有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)， 并開始對(duì)呼吸道微生態(tài)與呼吸系統(tǒng)疾病之間的關(guān)系進(jìn)行深入研究。 許多傳統(tǒng)觀念認(rèn)為與微生物不相關(guān)的呼吸系統(tǒng)疾病現(xiàn)在考慮與不同于健康人肺部微生物“失調(diào)”有關(guān)，即微生物組成的不平衡，從而導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)和免疫紊亂［4］。 越來越多的研究通過16S rDNA 測序技術(shù)對(duì)健康人及呼吸系統(tǒng)疾病患者的痰標(biāo)本進(jìn)行呼吸道微生態(tài)的分析， 發(fā)現(xiàn)健康期間和呼吸系統(tǒng)疾病期間的微生物組成存在顯著差異。 肺部微生物群不僅可能影響疾病的易感性或病因，還可能受到疾病活動(dòng)或治療反應(yīng)的影響［5］。因此，本文將總結(jié)呼吸道菌群的檢測方法以及近年來呼吸道微生態(tài)的研究進(jìn)展，探討呼吸道微生態(tài)與呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，以期對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病的特異性診斷和治療提供新的思路。

1 呼吸道菌群的檢測方法

1.1 細(xì)菌培養(yǎng)及涂片

細(xì)菌培養(yǎng)及革蘭染色涂片是檢測呼吸道感染病原體的傳統(tǒng)方式，是一種廉價(jià)、方便的實(shí)驗(yàn)室方法［6］，獲取標(biāo)本的方式包括經(jīng)口自然咳痰、高滲鹽水誘導(dǎo)咳痰、 口咽通氣管或氣管插管通路吸引以及支氣管鏡檢獲得支氣管肺泡灌洗液等。 該項(xiàng)檢查無法避免被口腔微生物污染的可能， 對(duì)呼吸道病原菌的診斷存在一定程度的影響。 在獲得標(biāo)本后必須完善痰液標(biāo)本質(zhì)量檢測， 保證上皮細(xì)胞及白細(xì)胞計(jì)數(shù)符合標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于門診的輕癥患者，完善細(xì)菌培養(yǎng)及涂片的可行性不高，對(duì)于重癥患者，尤其是對(duì)于咳膿痰或痰量明顯增多的住院患者，細(xì)菌培養(yǎng)及涂片對(duì)疾病的診治至關(guān)重要。 對(duì)于可疑合并有曲霉菌、 結(jié)核分枝桿菌及肺孢子菌等特殊病原體感染患者， 條件允許可行氣管鏡檢查獲取支氣管肺泡灌洗液送檢。 傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)為微生物研究奠定了基礎(chǔ)， 但是其局限性在于無法進(jìn)行整體微生物群落結(jié)構(gòu)的分析， 并且培養(yǎng)法的敏感性容易受到抗菌藥物的影響， 通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測到的微生物是有限的［7］。

1.2 高通量測序技術(shù)

高通量測序?yàn)橐环N價(jià)格低廉的大規(guī)模并行測序技術(shù)， 可允許同時(shí)獨(dú)立測序數(shù)千位到數(shù)十億DNA 片段［7］。 包括基于16S rDNA、18S rDNA、ITS等擴(kuò)增子測序、 宏基因組測序以及全基因組測序等，其在微生態(tài)領(lǐng)域的應(yīng)用，使呼吸道微生態(tài)的研究更加深入。 其中，16S rDNA 測序技術(shù)則是對(duì)特定環(huán)境中（疾病或健康狀態(tài)）全部細(xì)菌基因組水平的高通量測序，分析其內(nèi)部組成情況，明確該環(huán)境中微生物的種類及豐度［8］，同時(shí)，它也可以用作獨(dú)立于培養(yǎng)的技術(shù)， 發(fā)現(xiàn)常規(guī)技術(shù)無法測得的致病菌。 研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)整個(gè)16S rDNA 進(jìn)行測序比對(duì)常見的靶向可變亞區(qū)測序具有更高的分類分辨率，其局限性在于高成本及采樣深度有限，因此，可以通過對(duì)擁有高信息量的可變區(qū)進(jìn)行測序?qū)崿F(xiàn)這一目的［9］。 對(duì)于呼吸系統(tǒng)疾病的研究，可以對(duì)提取痰液總DNA 的16S rDNA 片段的V3、V4 可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建細(xì)菌基因組文庫后測序，進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)組成、多樣性及差異分析，不同于傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)僅僅針對(duì)部分致病菌的檢查。 通過對(duì)整個(gè)呼吸道微生物進(jìn)行研究， 分析群落組成變化與疾病發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系。 然而，16S rDNA 測序技術(shù)對(duì)整個(gè)呼吸道細(xì)菌組成的測定過程中無法識(shí)別已經(jīng)死亡的細(xì)菌［8］，而呼吸道微生態(tài)是處于動(dòng)態(tài)平衡中的， 該技術(shù)對(duì)最終得到的細(xì)菌群落的組成存在一定的影響?？傊?，不斷發(fā)展的高通量測序正在徹底改變對(duì)微生物的研究。

1.3 熒光顯微鏡成像技術(shù)

呼吸道微生物的熒光顯微鏡成像， 是一種基于分子生物學(xué)的熒光成像技術(shù)， 將細(xì)菌通過多種不同的熒光探針進(jìn)行可視化處理［10］，再利用熒光顯微鏡檢測熒光標(biāo)記的細(xì)菌信號(hào)， 從而實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的檢測。 該方法是一種簡單易行、效益高、便攜的微生物檢測方法， 廣泛適用于臨床樣本中的細(xì)菌鑒定， 是篩查和診斷各種不同病原菌導(dǎo)致的感染性疾病的基本方法，但是，一般的探針不能有選擇性地識(shí)別不同的細(xì)菌種類。 熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH） 是針對(duì)細(xì)菌識(shí)別的一種常用方法， 允許在屬或種水平上識(shí)別目標(biāo)微生物， 通過特定設(shè)計(jì)的核酸探針與細(xì)菌的DNA 或RNA 特定的區(qū)域發(fā)生特異性結(jié)合， 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)細(xì)菌的特異性熒光染色， 之后對(duì)環(huán)境中未標(biāo)記的細(xì)菌進(jìn)行清洗， 即可得到目標(biāo)細(xì)菌的熒光顯像圖［11-12］。 熒光顯微鏡成像技術(shù)，利用其可提供實(shí)時(shí)和高分辨率的微觀及宏觀信息， 具有快速和準(zhǔn)確診斷的優(yōu)點(diǎn)， 逐漸發(fā)展成為醫(yī)療機(jī)構(gòu)內(nèi)診斷的優(yōu)勢工具［13］。

1.4 細(xì)菌的光學(xué)檢測方法

傅里葉變換紅外光譜 （Fourier-transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIRS）是一種非侵入性的細(xì)菌檢測工具， 可在不使用外源性染料或探針的情況下分析細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌病原體的快速、可靠、廉價(jià)和高效鑒定［14］。 它能夠以紅外頻率對(duì)整個(gè)細(xì)菌細(xì)胞或其他部分進(jìn)行生化掃描。 其原理是當(dāng)樣品暴露于紅外光束時(shí)， 分子的振動(dòng)行為會(huì)因傳遞能量量子而改變， 從而影響其振動(dòng)和旋轉(zhuǎn)模式［15］。FTIRS 是一種基于提取完整微生物細(xì)胞紅外光譜信號(hào)相關(guān)生化特征的細(xì)菌分型方法［16］，用于微生物分型的三種主要紅外光譜取樣模式為透射、漫反射及衰減全反射。 目前已經(jīng)發(fā)表了較多利用FTIRS 快速鑒別微生物的相關(guān)報(bào)告［17］，包括彎曲芽孢桿菌和嗜麥芽鏈球菌［18］、金黃色葡萄球 菌［19］等均有單獨(dú)報(bào)道。

生物傳感技術(shù)的出現(xiàn)， 為微生物的鑒別提供了快速靈敏的平臺(tái)， 包括包含長周期光柵的光纖傳感器［20］及光纖布拉格光柵［21］已被應(yīng)用于 疾病診斷和環(huán)境檢測領(lǐng)域。 目前已有研究報(bào)道表面增強(qiáng)拉 曼 普 光 譜 （surface -enhanced Raman spectroscopy，SERS）用于大腸桿菌的檢測，但是該方法無法獲得更大物種的所有拉曼普光譜帶的完整信息，因此具有一定的局限性［22］。 Kaushik 等［23］利用基于生物功能化二硫化鉬納米片的光纖表面等離子體共振免疫傳感器實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌的快速檢測， 該項(xiàng)研究使光纖傳感器的靈敏度得到了顯著的改善，但是也存在一定的局限性，包括其高成本及傳感器后期的不穩(wěn)定性。

2 呼吸道微生態(tài)的研究進(jìn)展

肺組織是呼吸道微生態(tài)研究最理想的標(biāo)本，但標(biāo)本的獲取難以實(shí)現(xiàn)。 痰液作為呼吸道微生態(tài)研究首選的標(biāo)本，同樣具有豐富的微生態(tài)信息，并且極易獲得。有研究表明，因呼吸道的解剖學(xué)連續(xù)性，健康人群上下呼吸道細(xì)菌種類相似，差異僅僅在于細(xì)菌的生物量上， 其生物量從上到下呼吸道逐漸減少［24］，因此，可以選擇低侵入性的方法，通過高滲鹽水誘導(dǎo)咳痰獲取標(biāo)本進(jìn)行16S rDNA 測序， 明確健康人和不同疾病狀態(tài)下患者呼吸道微生態(tài)的構(gòu)成， 研究呼吸道微生態(tài)與呼吸系統(tǒng)疾病之間的關(guān)系。

不同于傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)，Hilty 等［25］于2010年運(yùn)用16S rDNA 測序技術(shù)，首次表明下呼吸道并不是無菌的，其存在一個(gè)特征性的微生物群，通過對(duì)支氣管哮喘、 慢性阻塞性肺疾病 （chronic obstructive pulmonary disease，COPD） 患者以及健康對(duì)照者呼吸道微生物進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)， 健康人的上下呼吸道微生物群相似， 而患者的呼吸道細(xì)菌群落可能會(huì)隨著疾病而改變，因?yàn)?6S rDNA 測序技術(shù)可以檢測到環(huán)境中全部細(xì)菌基因組，該結(jié)果無法排除操作過程中污染的可能。 Erb-Downward 等［26］的一項(xiàng)針對(duì)健康者及COPD 患者支氣管肺泡灌洗液的16S rDNA 測序表明，健康人的肺部同樣存在豐富的微生物群落。由此可見，呼吸道微生物組作為人類基因的組成部分，可保障機(jī)體相關(guān)代謝的順利進(jìn)行， 共生菌在抵抗致病菌入侵方面也發(fā)揮積極作用，使呼吸道微環(huán)境處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)［27］。Haldar 等［28］通 過16S rDNA 測 序 技 術(shù) 對(duì) 健 康 者 及COPD 患者呼吸道整體微生態(tài)進(jìn)行研究， 表明健康者呼吸道常見的細(xì)菌門分別為厚壁菌門、 擬桿菌門和放線菌門，相比之下，在COPD 受試者中，變形菌則是最主要的菌門。 高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)打破了人類對(duì)下呼吸道為無菌狀態(tài)的認(rèn)識(shí)［29］，激發(fā)了人類對(duì)于呼吸道微生態(tài)與呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展關(guān)系的探索。

3 呼吸道微生態(tài)與呼吸系統(tǒng)疾病

3.1 慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺疾病是一種以持續(xù)氣流受限為特征的常見呼吸系統(tǒng)疾病， 是一項(xiàng)可預(yù)防及治療的重大公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)，當(dāng)其癥狀發(fā)生急性惡化時(shí)，稱為慢阻肺急性加重（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）［30］。 導(dǎo) 致AECOPD 最常見的誘因?yàn)楦腥荆?細(xì)菌感染占重要比例［31］。感染使呼吸道微生態(tài)平衡被破壞，加速了機(jī)體的炎癥及免疫反應(yīng)， 從而促使疾病進(jìn)展，但是， 對(duì)于呼吸道微生態(tài)失衡與COPD 之間的因果關(guān)系仍然需要進(jìn)一步研究明確。

在COPD 穩(wěn)定期，呼吸道細(xì)菌負(fù)荷相對(duì)較低，豐度從上呼吸道至下呼吸道呈梯度下降［8］。 目前研究暫時(shí)無法明確疾病加重與呼吸道微生態(tài)失衡之間的因果關(guān)系，但是可以明確的是，隨著COPD嚴(yán)重程度的增加， 其呼吸道菌群的多樣性下降。COPD 患者呼吸道炎癥反應(yīng)增強(qiáng)以及疾病進(jìn)展相關(guān)的肺部微生物群的變化已經(jīng)得到證實(shí)［32］。 Su 等［33］研究發(fā)現(xiàn)， 與穩(wěn)定期COPD 和健康對(duì)照組相比，AECOPD 組的呼吸道細(xì)菌多樣性 （Shannon 和Simpson 指數(shù)）顯著降低；在AECOPD 組的痰液樣本中發(fā)現(xiàn)的最主要的細(xì)菌門是變形桿菌， 占微生物組的30%。與穩(wěn)定期COPD 組相比，AECOPD 組中厚壁菌和擬桿菌的相對(duì)豐度降低， 而變形桿菌和放線菌的相對(duì)豐度增加。Wang 等［34］對(duì)我國漢族人群進(jìn)行研究得出了相同的結(jié)論，AECOPD 組患者較COPD 穩(wěn)定期患者呼吸道微生態(tài)多樣性下降，但該項(xiàng)研究結(jié)果無法排除AECOPD 患者長期使用糖皮質(zhì)激素或者抗生素的影響， 同時(shí)，AECOPD 的發(fā)生可能與呼吸道微生物多樣性下降和變形桿菌比例增加相關(guān)，而流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌屬及銅綠假單胞菌等常見的致病菌均屬于變形菌門。

隨著COPD 病情的進(jìn)展， 呼吸道微生態(tài)發(fā)生變化，其多樣性下降而豐度增加，共生菌與致病菌比例失衡， 可能是由于致病菌數(shù)量發(fā)生變化所導(dǎo)致，因此發(fā)現(xiàn)豐度增高的致病菌，對(duì)慢阻肺急性加重的治療有著重要的臨床意義， 通過對(duì)致病菌的針對(duì)性治療從而達(dá)到氣道微生態(tài)恢復(fù)穩(wěn)態(tài)的目的，來延緩COPD 的進(jìn)展，控制病情。

3.2 哮喘

哮喘是一種影響肺部氣道的慢性疾?。?5］，是肺部最常見的炎癥性疾病， 對(duì)全球健康和經(jīng)濟(jì)造成了巨大的負(fù)擔(dān)， 其特征是慢性氣道炎癥及氣道結(jié)構(gòu)重塑，研究表明，在氣道結(jié)構(gòu)變化的基礎(chǔ)上，先天免疫機(jī)制與微生物群的相互作用是哮喘發(fā)生的主要原因［36］。 下呼吸道微生物失調(diào)在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，然而，目前對(duì)于呼吸道微生態(tài)失調(diào)與呼吸道炎癥之間的因果關(guān)系沒有明確闡述。

Marri 等［37］利用16S rDNA 測序技術(shù)對(duì)輕度活動(dòng)性哮喘患者和非哮喘受試者誘導(dǎo)痰微生物群落特征進(jìn)行比較， 發(fā)現(xiàn)所有的痰標(biāo)本均含有5 個(gè)主要的細(xì)菌門：厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、梭桿菌門和擬桿菌門， 前3 個(gè)菌門占總序列的90%以上。變形菌門在哮喘患者中比例較高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相比之下，厚壁菌門和放線菌門在非哮喘受試者中更為常見， 但是該項(xiàng)結(jié)果不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此外，與非哮喘樣本相比，哮喘患者的樣本具有更大的細(xì)菌多樣性， 該研究表明了哮喘患者呼吸道細(xì)菌的負(fù)荷量及多樣性均增加， 這與Hilty 等［25］的研究結(jié)果一致。 研究結(jié)果表明，呼吸道微生物在哮喘的發(fā)病中起重要作用［38］。 哮喘發(fā)病涉及遠(yuǎn)端支氣管， 而這些部位的細(xì)菌豐度較上呼吸道明顯降低， 關(guān)于呼吸道微生態(tài)失調(diào)與哮喘的發(fā)病機(jī)制還需進(jìn)一步明確。

3.3 肺癌

肺癌是一種發(fā)病率高、死亡率高、生存率低的高負(fù)擔(dān)疾病，吸煙是肺癌最重要的危險(xiǎn)因素［39］，肺癌是癌癥的主要死亡原因［40］。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，肺部微生態(tài)失調(diào)可能通過影響代謝、 炎癥或免疫反應(yīng)從而在致癌過程中發(fā)揮重要作用［41］，但是，目前微生態(tài)失調(diào)如何導(dǎo)致肺癌發(fā)病機(jī)制的問題仍未解決。

Jin 等［42］利用宏基因組學(xué)對(duì)肺癌患者、非惡性肺部疾病患者及健康受試者的支氣管肺泡灌洗液進(jìn)行物種水平上的微生物群落特征研究發(fā)現(xiàn)，與健康受試者相比， 肺癌患者的下呼吸道微生物豐富度顯著降低，但香農(nóng)指數(shù)顯著升高。與健康受試者相比， 非惡性肺部疾病患者的下呼吸道微生物豐富度較低。該實(shí)驗(yàn)表明，肺癌患者下呼吸道微生物種類較健康對(duì)照組顯著減少， 但其物種多樣性及均勻性較高。Liu 等［43］利用支氣管鏡防污染毛刷取樣后， 對(duì)肺癌患者和健康對(duì)照者樣本進(jìn)行16S rDNA 測序發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照者相比，肺癌患者的呼吸道微生物多樣性顯著降低。 該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Jin 等［42］的結(jié)果并不一致。 對(duì)肺部微生物態(tài)與肺癌之間的關(guān)系進(jìn)行研究， 可以更好地了解肺部微生物在肺癌發(fā)生中的潛在機(jī)制， 有利于肺癌的早期診斷，同時(shí)為肺癌的個(gè)性化治療創(chuàng)造條件。

3.4 特發(fā)性肺纖維化

特發(fā)性肺纖維化 （idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種原因不明的慢性、進(jìn)行性纖維化間質(zhì)性肺病，是間質(zhì)性肺疾病最常見的類型［44］。間質(zhì)性肺疾病是一組異質(zhì)性疾病， 遺傳及環(huán)境因素之間的相互作用被認(rèn)為是發(fā)病的主要因素， 然而導(dǎo)致其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不完全清楚。 目前對(duì)IPF的發(fā)病機(jī)制了解有限， 盡管已有抗纖維化的藥物可用于臨床，但是患者的預(yù)后仍然很差［45］。肺部微生物組可能影響間質(zhì)性肺疾病的發(fā)生及發(fā)展，但是肺部微生態(tài)失調(diào)與疾病發(fā)生發(fā)展的因果關(guān)系尚未明確。

O′Dwyer 等［46］進(jìn)行了一項(xiàng)前瞻性觀察性研究，利用16S rDNA 測序技術(shù)對(duì)IPF 患者的支氣管肺泡灌洗液進(jìn)行研究， 發(fā)現(xiàn)進(jìn)展性IPF 患者的細(xì)菌負(fù)荷明顯高于非進(jìn)展性IPF 患者，并且，細(xì)菌負(fù)荷的增加還與群落組成的顯著差異和群落多樣性喪失有關(guān)。 該結(jié)果表明可以利用呼吸道細(xì)菌負(fù)荷預(yù)測IPF 患者的疾病進(jìn)展，但是同樣無法證實(shí)細(xì)菌負(fù)荷增加與IPF 發(fā)生的因果關(guān)系。 Invernizzi 等［47］進(jìn)行的一項(xiàng)前瞻性研究表明， 對(duì)受試者的支氣管肺泡灌洗液進(jìn)行16S rDNA 測序后發(fā)現(xiàn)，IPF 患者下呼吸道微生物群以厚壁菌門占主導(dǎo)地位， 與健康對(duì)照者相比，IPF 組厚壁菌門及放線菌門豐度增加且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 并且IPF 組微生物群落均勻度降低。 該實(shí)驗(yàn)同樣證明了IPF 微生物群落的特點(diǎn)是支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)菌負(fù)荷增加，并且與疾病進(jìn)展相關(guān)， 其程度可以預(yù)測IPF 的進(jìn)展速度和死亡風(fēng)險(xiǎn)。

目前的研究已經(jīng)證明IPF 患者呼吸道細(xì)菌負(fù)荷可以預(yù)測疾病進(jìn)展， 但尚未明確與疾病進(jìn)展相關(guān)的特定微生物， 并且細(xì)菌負(fù)荷與疾病發(fā)生發(fā)展之間的因果關(guān)系尚未明確［48］。 目前的研究正著力尋找與微生態(tài)相關(guān)的IPF 潛在發(fā)病機(jī)制， 從而為IPF 的治療提供科學(xué)依據(jù)。

3.5 囊性纖維化

囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）是一種常見的常染色體隱性遺傳疾病，病變可累及肺部，肺部的囊性纖維化典型的臨床表現(xiàn)為慢性阻塞性氣道疾病伴有細(xì)菌定植， 主要為銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌［49］。慢性感染伴隨氣道炎癥是CF 患者發(fā)病和死亡的主要原因。 目前對(duì)于肺部微生態(tài)與CF發(fā)病機(jī)制的關(guān)系仍存在一定爭議。

在CF 患者中，可以觀察到患者肺部微生物的遷移和消除出現(xiàn)失衡， 并且無論其處于穩(wěn)定期或者加重期， 幾乎所有的年輕患者均可在痰中檢測到特定的呼吸道病原體，例如金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等［50］。 Cuthbertson 等［51］對(duì)13 個(gè)CF 中心299 名患者的痰標(biāo)本進(jìn)行高通量測序發(fā)現(xiàn)，隨著肺功能的降低， 微生物多樣性喪失伴隨著優(yōu)勢菌群的增加， 多樣性與優(yōu)勢度之間存在顯著的負(fù)相關(guān)，其中可見優(yōu)勢菌種銅綠假單胞菌，這與之前的試驗(yàn)一致［52］。 CF 的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于如何使用呼吸道微生物態(tài)的信息指導(dǎo)呼吸道慢性感染的臨床管理。 只有了解呼吸道微生物組之間的相互關(guān)系及其與宿主的關(guān)系才能進(jìn)一步協(xié)助CF 的治療，為進(jìn)一步改善CF 患者的生活質(zhì)量提供了希望。

3.6 支氣管擴(kuò)張

支氣管擴(kuò)張是一種異質(zhì)性的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其特征是氣道的病理性永久性擴(kuò)張［53］，不同于遺傳性疾病肺囊性纖維化導(dǎo)致，該處支氣管擴(kuò)張?zhí)刂阜悄倚岳w維化支氣管擴(kuò)張，目前沒有批準(zhǔn)用于支氣管擴(kuò)張的治療方法［54］。在支氣管擴(kuò)張患者中，可以觀察到肺部微生態(tài)失衡及微生物負(fù)荷增加，同時(shí)也檢測到呼吸道病原微生物的定植， 發(fā)現(xiàn)最常見的細(xì)菌為銅綠假單胞菌和流感嗜血桿菌［55-56］。目前對(duì)于呼吸道微生態(tài)失衡與支氣管擴(kuò)張發(fā)病機(jī)制之間的因果關(guān)系尚不明確。

Lee 等［57］根據(jù)病情嚴(yán)重程度將63 名支氣管擴(kuò)張患者分為兩組，利用16S rDNA 測序技術(shù)對(duì)其痰微生物組進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)， 兩組患者中常見的細(xì)菌門均是變形菌門和厚壁菌門， 兩個(gè)研究組在細(xì)菌門水平上的相對(duì)豐度沒有顯著差異； 而在屬水平上， 輕度支氣管擴(kuò)張組的嗜血桿菌和羅氏菌屬明顯多于中/重度患者組，而假單胞菌在中/重度患者組更為常見，并且都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組患者痰微生物群落多樣性未見明顯差異。 測序技術(shù)的出現(xiàn)， 可以更全面地分析支氣管擴(kuò)張患者肺部細(xì)菌的組成， 對(duì)于支氣管擴(kuò)張患者的慢性感染也有了更進(jìn)一步的理解，通過對(duì)呼吸道微生態(tài)的認(rèn)識(shí)，從而得到如何進(jìn)行慢性呼吸道感染預(yù)防與管理的啟示，延緩疾病的進(jìn)展。

3.7 肺結(jié)核

肺結(jié)核是全世界主要的傳染性死亡原因，全世界大約四分之一的人口潛伏感染結(jié)核分枝桿菌［58］。 結(jié)核分枝桿菌與肺內(nèi)常駐微生物群相互作用，導(dǎo)致肺部微生態(tài)失調(diào)，這可能與肺結(jié)核的發(fā)生及發(fā)展相關(guān)。 目前對(duì)于呼吸道微生態(tài)與肺結(jié)核之間的關(guān)系知之甚少，相關(guān)的研究樣本量比較小，還無法避免口腔微生物污染的可能。

Hu 等［59］利用16S rDNA 測序技術(shù)， 通過對(duì)163 名痰陰性疑似肺結(jié)核患者和12 名結(jié)核分枝桿菌陽性患者及其抗結(jié)核治療后轉(zhuǎn)陰的支氣管肺泡灌洗液微生物組的特征分析發(fā)現(xiàn)，70 名患者感染結(jié)核分枝桿菌， 痰陰性患者樣本中結(jié)核分枝桿菌患病率為42.9%，另外70 名患者根據(jù)肺結(jié)核指南診斷，剩余23 名患者為細(xì)菌感染導(dǎo)致，與痰陰性患者相比， 痰陽性患者的肺部微生物群落α 多樣性顯著降低， 兩組患者的肺部微生物群落β 多樣性存在顯著差異。 痰陽性患者與抗結(jié)核治療痰培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰的支氣管肺泡灌洗液微生物群落特征相比， 經(jīng)過治療后的微生物群落具有更高的α 多樣性。該研究結(jié)果提示，支氣管肺泡灌洗液中結(jié)核分枝桿菌的存在可能會(huì)影響呼吸道微生態(tài)的構(gòu)成，使其多樣性降低。Hu 等［60］再次利用宏基因組測序技術(shù)， 對(duì)30 名痰陰性肺結(jié)核患者和30 名痰陽性肺結(jié)核患者的支氣管肺泡灌洗液微生物組學(xué)特征進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)， 兩組樣本中均檢測到結(jié)核分枝桿菌，在痰陽性組中占優(yōu)勢，痰陽性患者組的α 多樣性往往低于痰陰性組， 兩組之間的β 多樣性存在顯著差異； 痰陽性組呼吸道微生物以結(jié)核分枝桿菌為主，而痰陰性組富含鏈球菌、普雷沃桿菌及奈瑟菌等，更加接近正常呼吸道微生物群，通過網(wǎng)絡(luò)分析表明， 結(jié)核分枝桿菌對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)有很大的影響， 結(jié)核分枝桿菌可能對(duì)特定的分類群存在競爭。該實(shí)驗(yàn)同樣利用16S rDNA 測序?qū)?biāo)本進(jìn)行研究與前期利用16S 測序?qū)嶒?yàn)得出一致結(jié)論，同時(shí)該實(shí)驗(yàn)表明16S rDNA 測序方法低估了結(jié)核分枝桿菌， 并不是研究結(jié)核相關(guān)微生物組的最佳方式。

對(duì)肺部微生物群的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)可能在今后肺結(jié)核的預(yù)防、診斷及治療方面提供更好的策略。目前對(duì)于患者肺部微生物組的特征與肺結(jié)核的關(guān)系在很大程度上仍不明確。

4 益生菌在治療呼吸系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用前景

益生菌已經(jīng)成為未來治療呼吸系統(tǒng)疾病的研究熱點(diǎn)，益生菌可解釋為給予足夠的量時(shí)，會(huì)給宿主帶來健康益處的活的非致病微生物［61］。 益生菌可能成為抗生素的替代療法或聯(lián)合療法， 從而減少因過度使用或?yàn)E用抗生素治療而產(chǎn)生的耐藥性及微生態(tài)失衡。已有部分研究表明，口服益生菌將通過影響胃腸道菌群從而改變呼吸道菌群的組成［62］。胃腸道與呼吸道菌群如何相互影響，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)提出了肺腸軸的理論， 該理論是利用免疫系統(tǒng)和定植在肺和腸道的微生物群作為連接樞紐，形成連接肺部和腸道的雙向軸［63］，這一理論對(duì)我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“肺與大腸相表里”做出了科學(xué)的解釋。也有學(xué)者對(duì)益生菌鼻腔給藥對(duì)呼吸道微生態(tài)的影響進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)鼻腔給藥與口服相比，對(duì)于維持呼吸道微生態(tài)的平衡具有更高的療效， 可以降低COPD 患者的免疫反應(yīng)， 從而達(dá)到緩解病情的目的［64］。 但是，一項(xiàng)針對(duì)益生菌治療COPD 療效的Meta 分析表明， 雖然益生菌已被廣泛應(yīng)用并且具有一定的效果， 但是治療COPD 的臨床療效和安全性尚不清楚［65］，因此，還需要對(duì)益生菌的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究后決定是否可以應(yīng)用于臨床治療。

5 小結(jié)

新一代測序技術(shù)的出現(xiàn)， 使人類對(duì)呼吸道微生態(tài)的認(rèn)識(shí)更加深入， 對(duì)于呼吸系統(tǒng)疾病的呼吸道微生態(tài)的研究也更加詳細(xì)和全面。 鑒于上呼吸道微生物的影響， 痰標(biāo)本所包含的微生態(tài)信息可能僅部分代表呼吸道微生態(tài)的情況。 呼吸道微生態(tài)受到多種因素的影響， 其與呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制的關(guān)系需要進(jìn)一步明確。 呼吸道微生物組的研究仍然面臨許多挑戰(zhàn)，例如16S rDNA 測序技術(shù)中對(duì)可變亞區(qū)的選擇， 痰標(biāo)本的獲取方法以及測序平臺(tái)的選擇，都會(huì)對(duì)最終獲得的結(jié)果造成影響。益生菌作為未來治療呼吸系統(tǒng)疾病的切入點(diǎn)，可以通過對(duì)機(jī)體炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)的調(diào)控和干預(yù)實(shí)現(xiàn)治療的目的， 還可以通過直接參與平衡呼吸道微生態(tài)用于呼吸系統(tǒng)疾病的治療中。