胡云 鄒勇平 ?王帥 周元元 梁志春 周可欣

摘 要：目的：建立了基于優(yōu)化的免疫親和柱凈化高效液相色譜技術(shù)的嘔吐毒素檢測(cè)方法。方法：優(yōu)化的免疫親和柱淋洗條件為將1.5 mL甲醇以0.5 mL·min-1的流速分3次洗脫；優(yōu)化的流動(dòng)相為乙腈∶水=10∶90。結(jié)果：當(dāng)嘔吐毒素的載柱量在12.4～2 504.0 ng時(shí)，柱回收率為82.6%～103.2%；在98.6～4 930.0 ng·mL-1時(shí)，嘔吐毒素的校正曲線為y=0.063 35x-0.815 90，相關(guān)系數(shù)為0.999 921。以?xún)?yōu)化后的實(shí)驗(yàn)方法分析小麥粉、醋和黃酒中的嘔吐毒素，檢出限為1.2～4.2 μg·kg-1，定量限為4～14 μg·kg-1；3種食品中嘔吐毒素的3水平平均加標(biāo)回收率為84.3%～104.7%，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)為0.3%～5.5%；對(duì)特性值為1 303 μg·kg-1，特性值區(qū)間為1 043～1 563 μg·kg-1的小麥粉質(zhì)控樣品中嘔吐毒素的含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果為1 320 μg·kg-1。結(jié)論：優(yōu)化后的檢測(cè)方法靈敏、準(zhǔn)確，適用于食品中嘔吐毒素的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：免疫親和柱；高效液相色譜；嘔吐毒素；優(yōu)化

Optimization of Immunoaffinity Clean-Up and High-Performance Liquid Chromatography for Determination of Deoxynivalenol in Food Products

HU Yun， ZOU Yongping， WANG Shuai， ZHOU Yuanyuan， LIANG Zhichun， ZHOU Kexin

（Yangzhou Centre for Food and Drug Control， Yangzhou 225000， China）

Abstract： Objective： An accurate method to quantify deoxynivalenol in food is described based on an optimized immunoaffinity clean-up and high-performance liquid chromatography technique. Method： The optimized elution conditions was： the immunoaffinity columns were washed with 1.5 mL methanol at a speed of 0.5 mL·min-1 and was devided into three washout; The optimized mobile phase was： acetonitrile∶water =10∶90. Result： When deoxynivalenol was applied to a immunoaffinity column with the concentration from 12.4～2 504.0 ng， the column recovery is between 82.6%～103.2%. The linear equation of deoxynivalenol is y=0.063 35x-0.815 90 within 98.6～4 930.0 ng·mL-1 and the correlation coefficient is 0.999 921. Food such as wheat flour， vinegar， and yellow wine were treated with optimized test method. The detection limit was between 1.2～4.2 μg·kg-1 and the limit of quantification was between 4～14 μg·kg-1. Average recoveries of deoxynivalenol from the three food spiked at three levels ranged from 84.3%～104.7%， with laboratory coefficient of variation between 0.3%～5.5%. A quality control wheat flour with characteristic value of 1 303 μg·kg-1 and the characteristic value ranged from 1 043～1 563 μg·kg-1 was detected and a result of 1 320 μg·kg-1 was got. Conclusion： The optimized detection method is sensitive and accurate and suitable for the detection of deoxynivalenol in food.

Keywords： immunoaffinity chromatography; high-performance liquid chromatography; deoxynivalenol; optimization

嘔吐毒素是鐮刀屬真菌污染玉米、小麥等谷物后產(chǎn)生的具有一定毒性的真菌毒素[1]，高劑量暴露后會(huì)引起拒食、嘔吐和免疫功能抑制等癥狀[2]。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)食品中嘔吐毒素的限量要求有著嚴(yán)格的規(guī)定[3]。食品中嘔吐毒素的檢測(cè)方法較多，有液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜法、薄層色譜法、酶聯(lián)免疫吸附篩查法等，其中液相色譜法因具有操作簡(jiǎn)便、定量準(zhǔn)確、效率高等優(yōu)點(diǎn)，是檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)最常用的毒素檢測(cè)方法[4]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)小麥粉、醋和黃酒中嘔吐毒素的凈化方法和液相色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了一種靈敏、準(zhǔn)確的食品中嘔吐毒素的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

小麥粉、醋、黃酒均購(gòu)于超市；嘔吐毒素免疫親和柱：3 mL/支，美國(guó)Romer labs公司；934-AH玻璃纖維濾紙，英國(guó)Whatman公司。

1.1.2 試劑

甲醇、乙腈，色譜純，默克；聚乙二醇，化學(xué)純，國(guó)藥；氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀，分析純，國(guó)藥；超純水，由Milli-Q超純水機(jī)制備；嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液（197.2 mg·L-1）；溶劑（甲醇），色譜級(jí)，安譜。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀（配置DAD檢測(cè)器），美國(guó)Agilent公司；Milli-Q超純水儀，美國(guó)Millipore公司；S210-K酸度計(jì)，美國(guó)METTLER TOLEDO公司；XSR204電子分析天平，美國(guó)METTLER TOLEDO公司；AH40全自動(dòng)均質(zhì)器，睿科集團(tuán)股份公司；Fotector Plus高通量全自動(dòng)固相萃取儀，?？萍瘓F(tuán)股份公司；Auto EVA 80全自動(dòng)平行濃縮儀，?？萍瘓F(tuán)股份公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 前處理方法

（1）提取。①小麥粉。稱(chēng)取小麥粉25 g于均質(zhì)瓶中，參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測(cè)定》（GB 5009.111—2016）的方法[4]，加入5 g聚乙二醇和100 mL水，于20 000 r·min-1高速均質(zhì)150 s，立刻轉(zhuǎn)移至離心管中，于6 000 r·min-1離心10 min，上清液經(jīng)玻纖濾紙過(guò)濾后備用。②醋。稱(chēng)取醋25 g，滴加50%（v/v）氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測(cè)定》（GB 5009.111—2016）的方法[4]，加入5 g聚乙二醇，水定容至100 mL，混勻，全部轉(zhuǎn)移至均質(zhì)瓶中，于20 000 r·min-1高速均質(zhì)150 s，立刻用玻纖濾紙過(guò)濾后備用。③黃酒。稱(chēng)取黃酒20 g，參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測(cè)定》（GB 5009.111—2016）的方法[4]，加入1 g聚乙二醇，水定容至25 mL，混勻，全部轉(zhuǎn)移至均質(zhì)瓶中，于20 000 r·min-1高速均質(zhì)150 s，立刻用玻纖濾紙過(guò)濾后備用。

（2）凈化。將冷藏的嘔吐毒素免疫親和柱取出放置至室溫，吸取2.0 mL備用的濾液，以1.0 mL·min-1的速度通過(guò)免疫親和柱，先用5 mL PBS（pH=7.0）淋洗，再用5 mL水淋洗，淋洗速度2.0 mL·min-1，直至淋洗液全部通過(guò)免疫親和柱，吹干柱體至無(wú)殘留淋洗液，將1.5 mL甲醇以0.5 mL·min-1的流速分3次低速洗脫，收集全部洗脫液。

（3）濃縮。將洗脫液置于45 ℃的水浴中，以0.5 L·min-1的氮?dú)獯抵两桑鲃?dòng)相定容至1.0 mL，濾膜過(guò)濾后上機(jī)分析。

1.3.2 液相色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），美國(guó)Agilent公司；流動(dòng)相：乙腈∶水=10∶90；流速：0.8 mL·min-1，柱溫：35 ℃，進(jìn)樣量：50 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：218 nm。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別移取5 μL、10 μL、25 μL、50 μL、100 μL和250 μL嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液于10 mL容量瓶中，流動(dòng)相定容至刻度，配制得98.6 ng·mL-1、197.2 ng·mL-1、493.0 ng·mL-1、986.0 ng·mL-1、1 972.0 ng·mL-1和4 930.0 ng·mL-1的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件和色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 優(yōu)化免疫親和柱的凈化條件

研究嘔吐毒素的甲醇洗脫曲線，用2.0 mL甲醇洗脫柱載量為1 084.6 ng的嘔吐毒素，分4次每次以0.5 mL·min-1的流速向免疫親和柱中注入0.5 mL甲醇，等待10 s，注入和等待期間不使甲醇流出，然后以0.5 mL·min-1的流速洗脫，待此部分甲醇全部流出后，進(jìn)行下一次洗脫，直至使全部的2.0 mL甲醇洗脫液流出。此方法的嘔吐毒素洗脫情況見(jiàn)圖1。由圖1可知，第1次、第2次和第3次的甲醇洗脫液中嘔吐毒素的量分別為29.1 ng、839.0 ng和201.0 ng，第4次的甲醇洗脫液中沒(méi)有檢測(cè)到嘔吐毒素，洗脫液中嘔吐毒素的總量為1 069.1 ng，柱回收達(dá)到98.6%，可見(jiàn)，使用1.5 mL甲醇以0.5 mL·min-1的流速分3次洗脫，能得到理想的柱回收效果。

將12.4 ng、19.7 ng、25.0 ng、49.3 ng、98.6 ng、197.2 ng、256.4 ng、295.8 ng、493.0 ng、754.3 ng、1 005.7 ng、1 104.3 ng、1 202.9 ng、1 301.5 ng、1 672.3 ng、1893.1 ng、1 991.7 ng、2 090.3 ng、2 253.0 ng、2 353.0 ng、2 504.0 ng、2 997.4 ng、4 003.2 ng和5 008.9 ng的嘔吐毒素分別加載到免疫親和柱，考察柱回收率，結(jié)果見(jiàn)圖2。當(dāng)嘔吐毒素的載柱量在12.4～2 504.0 ng時(shí)，柱回收率在82.6%～103.2%，柱效較高，當(dāng)嘔吐毒素的載柱量在2 997.4 ng時(shí)，柱回收率在78.3%，柱效開(kāi)始降低，當(dāng)嘔吐毒素的載柱量在5 008.9 ng時(shí)，柱回收率已持續(xù)降低至52.9%。由于嘔吐毒素在自然界中的污染率較高，含量也高，高濃度的嘔吐毒素應(yīng)在載柱前進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

2.1.2 優(yōu)化色譜條件

以甲醇∶水=20∶80的流動(dòng)相進(jìn)行分析，免疫親和柱凈化后的嘔吐毒素在色譜分離的過(guò)程中仍存在雜質(zhì)峰的干擾，改用乙腈∶水=10∶90的流動(dòng)相進(jìn)行分析，色譜基線更平穩(wěn)，嘔吐毒素色譜峰的峰型得到了改善，與雜質(zhì)峰能實(shí)現(xiàn)有效分離，與TAN等[5]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，因此，實(shí)驗(yàn)選擇以乙腈∶水=10∶90的流動(dòng)相分析嘔吐毒素。

2.2 方法的線性范圍與檢出限、定量限

嘔吐毒素在98.6～4 930.0 ng·mL-1的濃度范圍內(nèi)，校正曲線y=0.063 35x-0.815 90，相關(guān)系數(shù)為0.999 921。用實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)小麥粉、醋和黃酒中的嘔吐毒素，檢出限分別為1.2 μg·kg-1、1.2 μg·kg-1和4.2 μg·kg-1，定量限分別為4 μg·kg-1、4 μg·kg-1和14 μg·kg-1，低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中50～100 μg·kg-1的檢出限，100～200 μg·kg-1的定量限，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)采用的方法具有較高的檢測(cè)靈敏度。

2.3 方法的加標(biāo)回收率與精密度

以標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的定量限、標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間點(diǎn)和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的最高殘留限量（標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有規(guī)定的，則選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中濃度較高的點(diǎn)）進(jìn)行3水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)[3-4，6]，每個(gè)水平重復(fù)6次，計(jì)算平均加標(biāo)回收率和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。小麥粉、醋、黃酒中嘔吐毒素的3水平加標(biāo)平均回收率在84.3%～104.7%，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)在0.3%～5.5%，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢驗(yàn)方法確認(rèn)的技術(shù)要求[6]。其中，小麥粉的嘔吐毒素3水平加標(biāo)平均回收率較低，變異系數(shù)較高，主要是因?yàn)樾←湻蹫楣腆w粉末狀，嘔吐毒素在其中分布的均勻度不及醋和黃酒。3種食品中均檢出了嘔吐毒素，小麥粉中的嘔吐毒素源自小麥在生長(zhǎng)期受到的鐮刀屬真菌的污染，黃酒和醋中的嘔吐毒素源自生產(chǎn)原料中含有受鐮刀屬真菌污染的麥麩[7]，由于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)并未對(duì)黃酒和醋中的嘔吐毒素規(guī)定限量要求，因此，有必要對(duì)市場(chǎng)上的醋和黃酒進(jìn)行嘔吐毒素的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和分析評(píng)估。

2.4 方法的準(zhǔn)確度

對(duì)嘔吐毒素特性值為1 303 μg·kg-1，特性值區(qū)間為1 043～1 563 μg·kg-1的小麥粉質(zhì)控樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果為1 320 μg·kg-1，說(shuō)明本試驗(yàn)采用的檢測(cè)方法準(zhǔn)確度高，適用于食品中嘔吐毒素的檢測(cè)。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了食品中嘔吐毒素的免疫親和柱的凈化方法和色譜分離方法，方法靈敏度高，檢出限和定量限均低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，定量結(jié)果準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)使用了自動(dòng)化程度高的均質(zhì)器、固相萃取儀和平行濃縮儀，在提高工作效率的同時(shí)，檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性也得到了提升。綜上，本方法適用于食品中嘔吐毒素含量的檢測(cè)。嘔吐毒素主要存在于谷物和谷物產(chǎn)品中[8]，但是，以被嘔吐毒素污染的谷物為原料的發(fā)酵產(chǎn)品（如啤酒）的安全性也受到了越來(lái)越多的關(guān)注[9]，因此，鑒于我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)目前沒(méi)有對(duì)這類(lèi)食品中的嘔吐毒素規(guī)定限量要求，今后對(duì)這類(lèi)食品中嘔吐毒素的污染水平有必要進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和安全性評(píng)估。

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基金項(xiàng)目：江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局技術(shù)能力提升項(xiàng)目資助“食品中真菌毒素檢驗(yàn)檢測(cè)能力提升”（NL2021065）。

作者簡(jiǎn)介：胡云（1979—），女，江蘇揚(yáng)州人，碩士，高級(jí)工程師。研究方向：食品安全。