陳麗名 綜述 夏敏 審校

RNA修飾可以以不同方式影響RNA的結(jié)構(gòu)和功能。目前存在100多種RNA修飾[1],如5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,hm5C)、N1-甲基化腺嘌呤(N1-methyladenosine,m1A)和N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)等。m6A修飾是發(fā)生在RNA腺嘌呤的第六位氮原子上、動態(tài)可逆的RNA表觀遺傳學修飾,是真核生物中最廣泛的RNA修飾形式之一,主要位于終止密碼子附近和3′非編碼區(qū)(3′untrans-lated region,3′UTR),在3′非編碼區(qū)富集明顯[2]。m6A修飾受甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶及甲基化閱讀蛋白共同調(diào)控。甲基轉(zhuǎn)移酶復合物包括甲基轉(zhuǎn)移酶3(Methyltransferase 3,METTL3)、甲基轉(zhuǎn)移酶14(Methyltransferase 14,METTL14)、WT1相關(guān)蛋白(WT1 associated protein,WTAP)、RNA結(jié)合基序蛋白15(RNA binding motif protein 15,RBM15)和病毒樣m6A甲基相關(guān)轉(zhuǎn)移酶(Vir like m6A methyltransferase associated,VIRMA)等;去甲基化酶包括肥胖相關(guān)蛋白(Fat mass and obesity-associated protein,FTO)和烷基B同系物5(AlkB homolog 5,ALKBH5),m6A閱讀蛋白包括YTH蛋白、真核起始因子3(Eukaryotic initiation factor 3,eIF3)、核不均一核糖核蛋白(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNP)和胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白(Insulin like growth factor 2 mRNA binding protein,IGF2BP)等,可特異性識別經(jīng)m6A修飾后的RNA,參與調(diào)控RNA降解、穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運和翻譯[3],與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。m6A閱讀蛋白YTH蛋白與結(jié)直腸癌關(guān)系的研究較少,本文系統(tǒng)綜述YTH蛋白的組成及結(jié)構(gòu)特點、在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中的作用及其在結(jié)直腸癌發(fā)生進展中的作用及機制。

1 YTH蛋白的組成及結(jié)構(gòu)

YTH蛋白中有一段約100～150個氨基酸組成的區(qū)域,在其同源蛋白中高度保守[4],被命名為YTH結(jié)構(gòu)域,由YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白1-3(YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 1-3,YTHDF1-3)和含有蛋白1-2(YTH-domain containing 1-2,YTHDC1-2)組成。YTH結(jié)構(gòu)域通常位于蛋白質(zhì)的C末端,其中保守的芳香族氨基酸殘基和堿性氨基酸殘基分別負責m6A的識別和結(jié)合,YTH結(jié)構(gòu)域表面具有帶正電荷的凹形結(jié)構(gòu),富含賴氨酸和精氨酸等堿性氨基酸殘基,采用特定的混合α-螺旋-β-折疊方式排列,β-折疊在中央排列成桶型,α-螺旋緊貼β-折疊將其包圍,共同構(gòu)成一個疏水核心,包含2～3個高度保守的芳香族氨基酸殘基,負責特異性識別RNA[4]。這個疏水核心像一個精巧的籠子—“芳香籠”。m6A上的甲基基團可以被“芳香籠”捕獲識別,通過嘌呤堿基和芳香族苯環(huán)之間的π-π相互作用,以及與疏水芳香族氨基酸側(cè)鏈的陽離子-π相互作用保持穩(wěn)定,介導與YTH蛋白的特異性識別[4-7]。除YTH結(jié)構(gòu)域外,YTH蛋白還具有固有無序區(qū)域(Intrinsically disordered region,IDR),這些區(qū)域自身無法折疊成穩(wěn)定且唯一的空間結(jié)構(gòu),但與其他分子相互作用中起著關(guān)鍵作用,參與信號傳導、轉(zhuǎn)錄和翻譯等重要的細胞功能[6-7];另外,YTHDC2還有多個結(jié)構(gòu)域:R3H結(jié)構(gòu)域、死亡樣解旋酶結(jié)構(gòu)域(DExDc)、解旋酶超家族C末端結(jié)構(gòu)域(HELIC)、解旋酶相關(guān)結(jié)構(gòu)域(HA2)、錨蛋白重復序列(ANK)和寡核苷酸/寡糖結(jié)合折疊結(jié)構(gòu)域(OB折疊)[4](圖1)。

圖1 YTH結(jié)構(gòu)域示意圖

YTHDF蛋白包括YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3,三者都由C末端的保守YTH結(jié)構(gòu)域及N端的IDR構(gòu)成,其YTH結(jié)構(gòu)域中的“芳香籠”結(jié)構(gòu)在芳香氨基酸組成上稍有不同:YTHDF1的“芳香籠”結(jié)構(gòu)由三個色氨酸殘基W411、W465和W470構(gòu)成;YTHDF2由三個色氨酸殘基W432、W486和W491構(gòu)成,YTHDF3由三個色氨酸殘基W438、W492和W497構(gòu)成[4]。而N端的IDR由一段富含谷氨酰胺、脯氨酸和甘氨酸的約350個氨基酸組成[6]。

YTHDC1的YTH結(jié)構(gòu)域包括兩個色氨酸殘基W377和W428所組成的“芳香籠”,而兩側(cè)由兩個精氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和富含谷氨酸的約300個氨基酸組成的IDR構(gòu)成[6]。YTHDC2是由包含三個芳香殘基(W1310、W1360和L1365)的YTH結(jié)構(gòu)域[4]、IDR及多個結(jié)構(gòu)域組成。

2 YTH蛋白識別m6A的功能機制

YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3三者具有高度相似的序列、功能域、相互作用蛋白和細胞內(nèi)定位,對于m6A修飾的mRNA顯示出相似的結(jié)合親和力,三者同時敲低才能充分發(fā)揮YTHDF蛋白調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性的能力[6,9-10]。YTHDF1與起始因子作用,招募其他翻譯起始復合體成員及核糖體,促進翻譯啟動,引導m6A修飾的轉(zhuǎn)錄本與YTHDF2結(jié)合,促進RNA降解,從而影響mRNA的穩(wěn)定性[11]。YTHDF2通過與m6A結(jié)合并招募CCR4/CAF/NOT腺嘌呤酶復合物,使m6A修飾的mRNA發(fā)生脫腺苷化,促進靶mRNA降解[6,9]。YTHDF3不能直接促進翻譯,與YTHDF1互作以增強YTHDF1介導的翻譯,引導m6A修飾的轉(zhuǎn)錄本與YTHDF2結(jié)合,進入RNA降解途徑[12](圖2)。

圖2 YTHDF1-3功能示意圖

YTHDC1通過招募絲氨酸/精氨酸富集剪接因子3(Serine/arginine-rich splicing factor 3,SRSF3)促進其與靶基因位點結(jié)合,調(diào)節(jié)mRNA的選擇性剪接[4];YTHDC1可通過m6A依賴方式調(diào)控轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)染色體相關(guān)RNA的穩(wěn)定性[13]。YTHDC1還參與核mRNA向細胞質(zhì)的運輸過程[14]。YTHDC2的R3H結(jié)構(gòu)域可參與YTHDC2可與核糖體結(jié)合,作用于核糖體小亞基,提高翻譯效率;ANK結(jié)構(gòu)域可介導與5′-3′核糖核酸外切酶XRN1的相互作用,在mRNA的穩(wěn)定性方面發(fā)揮作用[15]。

3 YTH蛋白在結(jié)直腸癌中的作用機制

3.1 YTHDF1通過調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt通路并影響細胞周期促進腫瘤的浸潤生長

通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)YTHDF1在結(jié)腸腺癌組織中表達顯著上調(diào),相對于癌旁組織YTHDF1在結(jié)直腸癌組織中呈高表達,并與預后不良有關(guān)[16]。

Wnt/β-連環(huán)蛋白經(jīng)典信號通路與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),通路中相關(guān)分子的變化導致該經(jīng)典Wnt通路的異?；罨?可影響結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移。β-連環(huán)蛋白是經(jīng)典Wnt信號通路中的核心蛋白分子,介導信號從細胞質(zhì)傳遞到細胞核,并在核內(nèi)參與組成轉(zhuǎn)錄復合體,激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄。YTHDF1表達上調(diào)可以增加Wnt/β-連環(huán)蛋白表達和β-連環(huán)蛋白細胞核信號活性,從而啟動Wnt/β-連環(huán)蛋白下游靶基因轉(zhuǎn)錄及相關(guān)蛋白表達,引起結(jié)直腸癌腫瘤增殖及浸潤生長[17],YTHDF1與Wnt信號分子FZD9、WNT6、TCF7L2和TCF4基因呈正相關(guān),YTHDF1能夠識別并促進這些Wnt信號分子的mRNA翻譯,導致Wnt/β-連環(huán)蛋白信號的異常激活,從而促進結(jié)直腸癌腫瘤生長(圖3)[4,17];另外,敲除YTHDF1會使細胞停滯在G1期(DNA合成前期),不進入S期(DNA合成期),使大腸癌細胞DNA合成和復制相對減少,促進結(jié)直腸癌的細胞周期進程,進而促進腫瘤的浸潤生長[17-18]。

圖3 YTH蛋白在結(jié)直腸癌中的作用機制

3.2 YTHDF2通過抑制程序性死亡配體1影響結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展

程序性死亡配體1(Programmed death-ligand 1,PD-L1)是PD-1的配體,是結(jié)直腸癌免疫治療的靶點,在結(jié)直腸癌組織中高表達,PD-1高表達與患者預后不良有關(guān)[19-20]。在腫瘤微環(huán)境中,腫瘤細胞和腫瘤相關(guān)抗原遞呈細胞高表達PD-L1,PD-L1可通過與其受體PD-1的結(jié)合抑制抗腫瘤免疫反應,增加腫瘤微環(huán)境的炎癥反應,促進結(jié)直腸癌細胞免疫逃逸[21]。YTHDF2與PD-L1在結(jié)直腸癌細胞及組織中的表達呈負相關(guān)(圖3),YTHDF2可使m6A特異性抗體募集到的PD-L1 mRNA豐度明顯減少,抑制PD-L1 mRNA的m6A水平,上調(diào)YTHDF2表達導致PD-L1啟動子活性減弱,YTHDF2通過PD-L1潛在的5個m6A位點識別并與PD-L1結(jié)合[22],但其識別PD-L1的m6A修飾位點進而影響下游翻譯、降解的具體機制還有待研究。

3.3 YTHDF3通過GAS5-YAP-YTHDF3負反饋軸參與調(diào)控結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展

YTHDF3在TCGA及GEO數(shù)據(jù)庫中的結(jié)直腸癌組織中表達顯著下調(diào),YTHDF3的表達與結(jié)腸腺癌患者的預后呈負相關(guān),是結(jié)直腸癌的獨立預后因素[23]。

研究發(fā)現(xiàn)YTHDF3可與Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein,YAP)以及生長抑制特異因子5(Growth arrest specific 5,GAS5)形成GAS5-YAP-YTHDF3負反饋軸,YAP介導YTHDF3的表達,而YAP受到GAS5調(diào)控,GAS5使YAP磷酸化以促進其降解,從而使YTHDF3表達下降,即GAS5通過抑制YAP介導的YTHDF3的表達來抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖和侵襲;而YTHDF3選擇性地結(jié)合m6A甲基化修飾的GAS5又可以觸發(fā)GAS5的降解,繼而減弱對YAP介導YTHDF3的表達的抑制[24],從而形成負反饋環(huán)(圖4),這個負反饋環(huán)維持YTHDF3的表達,而在結(jié)直腸癌患者中負反饋環(huán)失調(diào)導致YTHDF3表達失調(diào),最終影響結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展。

圖4 GAS5-YAP-YTHDF3負反饋調(diào)節(jié)

3.4 YTHDC1通過穩(wěn)定HMGA2的表達促進結(jié)直腸癌侵襲與轉(zhuǎn)移

CircNSUN2是一種m6A修飾的在結(jié)直腸癌中高表達的環(huán)狀RNA(Circular RNA,circRNA),circNSUN2過表達能顯著增加結(jié)腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,而YTHDC1促進circNSUN2從細胞核輸出到細胞質(zhì),使其進一步結(jié)合m6A閱讀蛋白IGF2BP2,通過在細胞質(zhì)中形成circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2蛋白復合物來穩(wěn)定高遷移率族AT HOOK蛋白2(High mobility group ATHook 2,HMGA2)的mRNA表達(圖3)[25],而HMGA2是包括Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路在內(nèi)的多種通路的關(guān)鍵分子,在結(jié)直腸癌中異常過表達,HMGA2參與腫瘤細胞的細胞轉(zhuǎn)化、增殖、凋亡、衰老、轉(zhuǎn)移及上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT),在體內(nèi)外促進結(jié)直腸癌的侵襲與轉(zhuǎn)移[26]。

3.5 YTHDC2通過促進HIF-1α翻譯而促進結(jié)直腸癌增殖轉(zhuǎn)移

YTHDC2作為RNA解旋酶,可促進缺氧誘導因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1alpha,HIF-1α)mRNA的5′非翻譯區(qū)(5′untranslated regions,5′UTRs)二級結(jié)構(gòu)的解開,促進HIF-1α起始翻譯,提高HIF-1α的翻譯效率(圖3)[27]。HIF-1α是細胞應答缺氧應激的主要調(diào)節(jié)因子,研究表明HIF-1α在結(jié)直腸癌早期出現(xiàn)高表達,且與腫瘤分期和轉(zhuǎn)移成正相關(guān),HIF-1α可以與多種蛋白組成不同的信號通路,調(diào)控細胞產(chǎn)生一系列對缺氧的代償反應,參與調(diào)節(jié)細胞存活、血管生成和細胞運動相關(guān)靶基因的表達,腫瘤的迅速增長易導致微環(huán)境缺氧,誘導HIF-1α誘導環(huán)氧合酶(Cyclooxygenase,COX2)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、β-連環(huán)蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)等蛋白表達,增加腫瘤血管生成,促進EMT,促進腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移[28]。

4 小結(jié)與展望

本文闡述了YTH蛋白的結(jié)構(gòu)、功能以及與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制。YTH蛋白可能通過參與Wnt通路,調(diào)節(jié)PD-L1、HIF-1α、HMGA2等相關(guān)因子的表達,形成GAS5-YAP-YTHDF3負反饋軸等調(diào)控結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。隨著高通量測序和生物芯片技術(shù)的日益發(fā)展,YTH蛋白作為重要的m6A閱讀蛋白,其多種亞型在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用,YTH蛋白或可成為預測結(jié)直腸癌進展及預后的新分子標志物,然而YTH不同蛋白亞型對于結(jié)直腸癌的作用機制仍有待進一步研究。