文世超 綜述 王靜萱 審校

銅是一種重要的金屬元素,參與多種生物過程,包括線粒體呼吸和抗氧化等,銅離子動態(tài)平衡紊亂會引發(fā)氧化應(yīng)激[1],引起相關(guān)細胞損傷而誘發(fā)某些疾病,如威爾遜病(Wilson′s disease)[2]?！般~死亡(Cuprotosis)”是2022年由Tsvetkov等[3]首次提出的一種銅依賴的、新型細胞死亡方式,研究表明,銅死亡參與多種腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移,包括乳腺癌和宮頸癌等,而且與惡性腫瘤的治療密切相關(guān)。目前,乳腺癌已位于全球女性惡性腫瘤之首[4]。研究發(fā)現(xiàn),不平衡的微量元素與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)[5],已證實乳腺癌患者體內(nèi)的銅水平較高,并且與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本文就銅依賴性細胞死亡的發(fā)生機制及銅在乳腺癌治療中的研究現(xiàn)狀作一綜述。

1 銅的分布與代謝過程

銅是人體必不可少的微量元素,僅次于鐵和鋅位于第三位,主要從食物中攝取,在腸道中被吸收,大部分存在于肌肉和骨骼(50%～70%),約20%分布在肝臟,其余存于血液等[6]。成人體內(nèi)約含有100～200 mg銅,進入血液中的銅與血清白蛋白結(jié)合,轉(zhuǎn)運至人體各器官,存儲于肝臟,最后經(jīng)膽道排泄。銅主要以Cu+和Cu2+兩種形式存在,胞外的Cu2+與二價金屬轉(zhuǎn)運體1(Devalent mental transporter1,DMT1)結(jié)合,經(jīng)還原酶還原為Cu+,再由跨膜銅轉(zhuǎn)運體1(Copper transporter1,CTR1)轉(zhuǎn)運進入細胞內(nèi)[6-7]。CTR1是負責(zé)飲食銅攝取到腸上皮的主要轉(zhuǎn)運體,由腸道吸收的Cu+通過銅伴侶蛋白抗氧化物1(Antioxidant 1 copper chaperone,ATOX1)轉(zhuǎn)運至高爾基體內(nèi),結(jié)合銅轉(zhuǎn)運ATP酶α(Copper-transporting ATPase alpha,ATP7A)后泵入門靜脈循環(huán),儲存于肝臟。因此當(dāng)銅缺乏時,ATP7A將發(fā)揮作用。另一種銅轉(zhuǎn)運ATP酶β(Copper-transporting ATPase beta,ATP7B)作用于銅,使其裝載到銅藍蛋白上。銅藍蛋白是血漿中分泌的銅氧化酶,在調(diào)節(jié)銅在機體的分布、合成含銅的酶蛋白等方面至關(guān)重要[8]。ATP7B可以防止銅過量,將多余的銅轉(zhuǎn)運至膽汁,然后通過糞便排出或在消化道重吸收[9]。

2 銅依賴性細胞死亡的發(fā)生機制

細胞死亡分為意外性細胞死亡(Accidental cell death,ACD)和調(diào)節(jié)性細胞死亡(Regulated cell death,RCD),其中RCD包括細胞凋亡、焦亡、壞死性凋亡、自噬和鐵死亡[10]等。不同于之前的RCD形式,Tsvetkov等[3]提出“銅死亡”是一種依賴于細胞內(nèi)銅的聚集,新型的細胞死亡方式。細胞內(nèi)的銅與線粒體三羧酸(Tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)中的酯?；牡鞍踪|(zhì)結(jié)合,經(jīng)酯酰化的蛋白質(zhì)聚集后鐵硫簇蛋白丟失,使蛋白質(zhì)發(fā)生毒性應(yīng)激最后導(dǎo)致細胞死亡。銅離子載體是一種可以與銅結(jié)合的小分子,先前發(fā)現(xiàn)的伊利司莫通過與Cu2+結(jié)合形成復(fù)合物進入細胞,進入細胞內(nèi)的Cu2+在鐵氧化還原蛋白1(Ferredoxin 1,FDX1)的作用下還原為具有毒性的Cu+,導(dǎo)致細胞死亡[11-12]。Tsvetkov團隊[3]發(fā)現(xiàn)伊利司莫單獨應(yīng)用或者加入其他金屬均不會影響細胞生長,然而當(dāng)銅離子加入時,胞內(nèi)銅的積累,會使細胞生長被抑制,這說明銅離子載體誘導(dǎo)的細胞死亡主要為銅依賴性細胞死亡。

研究者們發(fā)現(xiàn)與依賴糖酵解的細胞相比,依賴線粒體呼吸的細胞對銅離子載體的敏感度是前者的1 000倍左右,缺氧條件也能使銅死亡減輕,此外,采用抑制線粒體功能藥物后,細胞對銅離子載體的敏感性的影響非常明顯,這說明銅死亡主要依靠于線粒體的呼吸,同時線粒體解偶聯(lián)劑的應(yīng)用發(fā)現(xiàn)對銅毒性無顯著影響,這證實銅死亡并非依賴三磷酸腺苷的產(chǎn)生。

通過對全基因組CRISPR-Cas9功能喪失篩選,研究者們瞄準了銅誘導(dǎo)死亡的關(guān)鍵基因FDX1[13],其被伊利司莫直接靶向,將Cu2+還原為Cu+,其他銅死亡相關(guān)基因,包括硫辛酸合成酶(Lipoic acid synthetase,LIAS)、酯酰轉(zhuǎn)移酶(Lipoyltransferase,LIPT1)、二氫硫辛酰轉(zhuǎn)乙?；?Dihydrolipoamide S-acetyltransferase,DLAT)等[14]。對FDX1、LIAS進行基因敲除后可以增加對銅死亡的抵抗力,進一步說明FDX1、蛋白質(zhì)酯?；c銅死亡之間的關(guān)系。同樣,在糖酵解的環(huán)境下,大多數(shù)銅離子載體喪失殺傷功能,再次證實這個過程依賴于線粒體的代謝。蛋白質(zhì)酯酰化是一種高度保守的賴氨酸翻譯后修飾[15],僅發(fā)生在四種酶且都參與調(diào)節(jié)碳開啟TCA循環(huán)的入口的代謝復(fù)合物,這些蛋白質(zhì)的酯?；俪闪嗣复俜磻?yīng)。研究者發(fā)現(xiàn)通過敲除FDX1或酯酰化相關(guān)酶可以阻止銅死亡[16]。為了證實,Tsvetkov等[3]先通過數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)FDX1和硫辛酸通路的成分與細胞活力高度相關(guān)。然后對208例腫瘤標本進行FDX1和硫辛酸的免疫組化染色,驗證了FDX1與酯化蛋白表達相關(guān),且FDX1敲除會導(dǎo)致完全喪失蛋白質(zhì)酯?；?同時細胞呼吸也顯著下降,因此證實FDX1是蛋白質(zhì)酯酰化上游調(diào)控因子并參與銅死亡。另一方面,研究發(fā)現(xiàn)銅與酯?；牡鞍踪|(zhì)直接結(jié)合導(dǎo)致DLAT的酯?；蕾囆怨丫刍?使鐵-硫簇蛋白丟失誘導(dǎo)蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激,最終導(dǎo)致細胞死亡[3]。

此前,沒有明確的數(shù)據(jù)指明銅死亡對三陰性乳腺癌存在影響,Sha等[17]發(fā)表的關(guān)于銅死亡相關(guān)基因(Cuproptosis-related genes,CRGs)在三陰性乳腺癌預(yù)后中的研究,包含16個CRGs,通過記錄CRGs在乳腺癌中的拷貝變異數(shù)(Copy number variation,CNV)和體細胞突變的發(fā)生率分析,證實了CRGs的失衡在對乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中有重要作用。通過風(fēng)險評分計算風(fēng)險中位數(shù)將患者分為低風(fēng)險組和高風(fēng)險組,低風(fēng)險組患者的生存時間更長,預(yù)后更好,而高風(fēng)險組的患者更容易發(fā)生免疫抑制。CRGs對三陰性乳腺癌的預(yù)后存在預(yù)測作用,因此,銅死亡在乳腺癌治療中的研究值得深入探索。

3 銅在乳腺癌治療中的研究現(xiàn)狀

3.1 銅配合物在乳腺癌治療中的研究

目前,臨床中乳腺癌的治療主要以手術(shù)、化療、放療、靶向和免疫治療等為主[18],但傳統(tǒng)的治療常會產(chǎn)生耐藥,因此正在探索新興的治療手段。銅參與腫瘤細胞增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移[19],許多研究發(fā)現(xiàn),腫瘤患者體內(nèi)的銅水平高于健康人群[20],包括乳腺癌、宮頸癌和口腔癌等。因此銅被認為是一種新的抗腫瘤治療靶點,20世紀60年代,銅配合物的抗腫瘤活性第一次被Booth團隊提出[21]。

銅配合物目前主要有銅絡(luò)合劑和銅離子載體兩種類型[22]。前者是與銅離子結(jié)合,降低其生物利用度,減少腫瘤細胞中銅離子的含量發(fā)揮抗腫瘤作用[23]。美國安德森癌癥中心使用銅絡(luò)合劑聯(lián)合卡鉑治療卡鉑耐藥的卵巢癌患者,證實銅絡(luò)合劑可能是克服鉑耐藥的關(guān)鍵[24]。而后者銅離子載體則將銅轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi),增加胞內(nèi)銅離子水平,產(chǎn)生活性氧,激活氧化應(yīng)激,引起相關(guān)細胞的損傷,誘導(dǎo)癌細胞凋亡[25]。來自美國杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的一項研究發(fā)現(xiàn)雙硫侖(Disulfiram,DSF)作為銅離子載體誘導(dǎo)銅發(fā)生氧化應(yīng)激,介導(dǎo)炎性乳腺癌發(fā)揮抗腫瘤作用[26]。雙硫侖是一種酒精戒斷藥物,作為氧化還原調(diào)節(jié)劑,它與Cu2+結(jié)合形成雙硫侖-銅復(fù)合物(DSF-Cu)[27],使胞內(nèi)銅離子含量增加,DSF-Cu能拮抗NF-kB信號[28]、醛脫氫酶活性和抗氧化水平,誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,使多種乳腺癌細胞凋亡,因此,DSF可以顯著抑制乳腺癌生長,可能是乳腺癌治療的新思路。

3.2 銅依賴蛋白在乳腺癌治療中的研究

在最近的一項Meta分析中,Feng的團隊納入36項研究共5 747例患者,其中2 369例乳腺癌患者,其余為良性乳腺疾病組和健康對照組,通過監(jiān)測血清銅水平,得出乳腺癌組血清銅水平明顯高于其他兩組(P<0.001)[29],一部分因為銅是腫瘤細胞增殖的細胞啟動子,另一原因是在乳腺癌組織中,銅依賴蛋白的表達上調(diào)。銅依賴蛋白已被證明可以刺激血管生成及腫瘤的轉(zhuǎn)移,包括細胞運動介質(zhì)1(Mediator of ErbB2-driven cell motility 1,MEMO1)[30]、溶質(zhì)載體家族3成員1(Solute carrier family 3 member 1,SLC31A1)[31]、ATOX1[32]和賴氨酰氧化酶2(Lysyl oxidase like 2,LOXL2)[33]。

Karginova等[34]研究發(fā)現(xiàn)銅和一些銅依賴性蛋白是新興治療靶點。DCAC50是一種胞內(nèi)銅伴侶蛋白的小分子抑制劑,可以減少腫瘤細胞增殖并提高氧化應(yīng)激,從而使三陰性乳腺癌細胞凋亡。DCAC50抑制ATOX1活性與破壞銅穩(wěn)態(tài),導(dǎo)致細胞內(nèi)銅水平升高[32]。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)在異種移植的小鼠模型中,DCAC50可以減緩腫瘤的生長速度同時抑制血管生成;在體外可以阻止內(nèi)皮細胞網(wǎng)絡(luò)的形成,其與紫杉醇的聯(lián)用可以增強三陰性乳腺癌的細胞毒性,同時可減少兩種藥物使用劑量,因此抑制胞內(nèi)銅的轉(zhuǎn)運是治療乳腺癌的潛在療法。

3.3 其他銅相關(guān)因素在乳腺癌中的研究

銅穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因(FOXO1)促進含銅蛋白的表達,在維持銅平衡中發(fā)揮重要作用,同時FOXO1與腫瘤發(fā)生有關(guān),包括乳腺癌和卵巢癌[35]等。Zeng等[36]研究發(fā)現(xiàn)FOXO1在乳腺癌中顯著下調(diào),并且FOXO1高表達的乳腺癌患者預(yù)后良好,此外還發(fā)現(xiàn)其表達水平可能影響免疫治療的反應(yīng),因此可將FOXO1作為乳腺癌患者治療的新方向。

此外,銅介導(dǎo)的腫瘤局部光療法在乳腺癌治療也初步得到證實[37]。在小鼠試驗中,Shrestha等[38]發(fā)現(xiàn),新型光敏劑銅半胱胺納米粒子激活后可使小鼠的乳腺癌腫瘤組織明顯減小,盡管目前暫時無相關(guān)的人體試驗數(shù)據(jù)支撐,但可以預(yù)期的是光療可作為乳腺癌的一種治療。除以上之外,銅介導(dǎo)的其他療法的研究也正在進行中,如化學(xué)動力學(xué)療法(Chemodynamic therapy,CDT)[39]和聯(lián)合免疫治療[40]等。

4 小結(jié)與展望

銅參與線粒體呼吸、鐵吸收等重要的細胞代謝,維持銅的動態(tài)平衡對機體的健康至關(guān)重要,銅動態(tài)平衡紊亂可誘發(fā)多種疾病,包括心血管疾病和惡性腫瘤等。銅死亡作為一種新型細胞死亡方式,依賴于細胞內(nèi)銅聚集,通過銅與線粒體TCA循環(huán)中酯酰化的蛋白質(zhì)結(jié)合后聚集,鐵硫簇蛋白丟失,蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激最后導(dǎo)致細胞死亡。研究表明,銅死亡與乳腺癌和宮頸癌等惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān),同時作為一種新興的抗腫瘤治療靶點,銅死亡在乳腺癌的治療應(yīng)用中也有所突破。盡管目前尚未在臨床中廣泛應(yīng)用,但銅絡(luò)合劑、銅離子載體、銅伴侶蛋白抑制劑及銅相關(guān)聯(lián)合方案等已經(jīng)在乳腺癌的治療中展開研究。未來,我們可以通過進一步對銅死亡在乳腺癌中作用機制的研究,研發(fā)靶向銅死亡的乳腺癌治療新藥物,通過不同的機制達到抗腫瘤目的。