劉靜 褚艷杰 裴鳳華 徐睿玲 王彥博

食管癌是最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率均較高,近年來(lái)呈上升趨勢(shì)且日趨低齡化,GLOBOCAN 2020數(shù)據(jù)顯示全球約有新發(fā)病例60.4萬(wàn),死亡病例54.4萬(wàn),在癌癥相關(guān)的死亡病例中居第七位[1]。盡管食管癌手術(shù)聯(lián)合放化療等治療手段不斷發(fā)展,但食管癌患者預(yù)后普遍較差[2-3],進(jìn)展期食管癌患者5年生存率仍不足20%[4]。抑癌基因的失活和癌基因的激活在食管癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。因此,臨床診療中迫切需要新的診療靶點(diǎn),從而提高食管癌患者的生存期。

lncRNA在食管癌的許多生物學(xué)進(jìn)程中,包括細(xì)胞的凋亡、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移以及腫瘤干細(xì)胞特性、放化療抗性和耐藥等方面發(fā)揮重要作用[6-7]。有研究表明,缺氧誘導(dǎo)lncRNA STEAP3-as1激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,通過阻止mA介導(dǎo)的STEAP3 mRNA降解促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展[8]。然而,對(duì)食管癌中l(wèi)ncRNA的表達(dá)、作用及機(jī)制的探索還有待進(jìn)一步研究。

在前期工作中,我們通過GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載食管癌患者的測(cè)序數(shù)據(jù),進(jìn)行l(wèi)ncRNA差異表達(dá)分析,建立臨床預(yù)測(cè)模型并在數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)AP000487.1在食管癌患者中差異表達(dá)且與預(yù)后高度相關(guān)[9]。然而,AP000487.1在食管癌中的作用和機(jī)制尚不明確。本研究將通過細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)方法探究AP000487.1在食管癌中的作用及其機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 一般資料

1.1.1 人食管癌細(xì)胞株和食管正常上皮細(xì)胞株 人食管癌細(xì)胞株TE-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生化細(xì)胞研究所;食管正常上皮細(xì)胞HEEC購(gòu)自上海子實(shí)科技有限公司;人食管癌細(xì)胞株ECA109、KYSE150和EC9706由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院食管外科贈(zèng)予。

1.1.2 人食管鱗狀細(xì)胞癌及癌旁組織樣本 收集哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院食管外科2019年1月—12月期間19例食管鱗狀細(xì)胞癌及癌旁組織。納入標(biāo)準(zhǔn):患者年齡40～69歲;性別不限;病理組織類型為鱗狀細(xì)胞癌;腫瘤組織大于2 cm。排除標(biāo)準(zhǔn):其他惡性腫瘤病史及其他伴發(fā)疾病。本研究經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理編號(hào):2020-50-IIT)。

1.1.3 基因操作工具與引物 選用RiboTM AP000487.1 Smart silencer表達(dá)載體沉默人食管鱗狀細(xì)胞癌中AP000487.1的表達(dá)。采用pEXP-RB-Mam-AmpR質(zhì)粒過表達(dá)AP000487.1,上述兩種產(chǎn)品均委托銳博生物科技有限公司加工合成。AP000487.1、GAPDH、TNF-α、IL-1β和IL-6的引物委托賽默飛世爾科技有限公司合成及純化。所用引物具體序列如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 10% FBS、1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液,用于培養(yǎng)ECA109和EC9706細(xì)胞系;10% FBS、1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液用于培養(yǎng)TE-1和KYSE150細(xì)胞系;MEM完全培養(yǎng)基:10% FBS、1%青-鏈霉素的MEM培養(yǎng)液用于培養(yǎng)HEEC細(xì)胞系。細(xì)胞放置于37℃恒溫、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 準(zhǔn)備無(wú)青鏈霉素的完全培養(yǎng)基的食管癌細(xì)胞懸液,鋪6孔板,培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)染用;配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物,將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入6孔板中,轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行傳代;用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中AP000487.1的過表達(dá)及沉默情況。沉默及過表達(dá)AP000487.1實(shí)驗(yàn)分組:Control組、Smart silencer-NC組、Smart silencer-AP000487.1組;pEXP-RB-Mam、AP000487.1組。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 使用TRI提取細(xì)胞和組織RNA。采用abm試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。qRT-PCR采用SYBR熒光染料進(jìn)行,其反應(yīng)條件為:95℃ 10 min;95℃15 s;60℃ 30 s;72℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)數(shù)。用2-△△Ct計(jì)算后得到的目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn) 96孔板每孔接種細(xì)胞總量約為1×104個(gè)。分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h取出96孔板,每孔貼壁加入110 μL CCK-8稀釋液。于酶標(biāo)儀選擇450 nm為檢測(cè)波長(zhǎng),測(cè)量各孔的吸光度值。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 六孔板每孔接種細(xì)胞數(shù)量一般為5×105～10×105個(gè)細(xì)胞,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜。次日用20 μL槍頭劃線,在0 h和24 h拍照記錄。采用Image Pro Plus 6.0軟件處理,計(jì)算細(xì)胞遷移對(duì)比距離,繪制柱狀圖并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將80 μL(50 mg/L)Matrigel凝膠稀釋液包被Transwell小室上室底部。細(xì)胞濃度為4×104/mL,將200 μL細(xì)胞懸液加入上室中。24孔板放置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),24 h后,擦除小室上室內(nèi)部的Matrigel膠和殘留的非侵入細(xì)胞,結(jié)晶紫染色拍照記錄。

1.2.7 蛋白免疫印跡(Western blot) 使用適量裂解液于冰上裂解細(xì)胞提取蛋白,BCA法檢測(cè)樣品濃度。配制SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白樣品。轉(zhuǎn)膜、封閉后孵育一抗,p-p65(鼠抗)按1∶1 000、p-IκBα(鼠抗)按1∶2 000比例稀釋,內(nèi)參為GAPDH。孵育二抗按1∶2 000比例稀釋,采用ECL顯影液進(jìn)行顯影。實(shí)驗(yàn)分組:Smart silencer-NC組、Smart silencer-AP000487.1組。采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19.0軟件和Graphpad Prism7.0軟件分析數(shù)據(jù)并繪圖,所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次以上,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn),多組間比較采用方差分析,重復(fù)測(cè)量資料采用重復(fù)測(cè)量方差分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA在食管癌組織中的表達(dá)結(jié)果

本研究中,通過qRT-PCR檢測(cè)了AP000696.1、LINC00689、LINC00900和AP000487.1在19例食管癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況。與癌旁組織相比,AP000487.1、LINC00900、AP000696.1在食管癌組織中表達(dá)均顯著上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1A-C);LINC00689在食管癌組織中表達(dá)下調(diào)(圖1D)。

圖1 lncRNA在食管癌組織中的表達(dá)水平

2.2 lncRNA在食管癌細(xì)胞株的表達(dá)結(jié)果

qRT-PCR檢測(cè)了4個(gè)lncRNAs在食管癌細(xì)胞株ECA109、TE-1、KYSE150、EC9706和食管正常上皮細(xì)胞株HEEC中的表達(dá)情況。與HEEC相比,AP000487.1、LINC00900和AP000696.1在各食管癌細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)(圖2A-C);LINC00689在食管癌細(xì)胞株TE-1、ECA109、EC9706中表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05),在KYSE150中表達(dá)輕度下調(diào)(圖2D)。

圖2 qRT-PCR檢測(cè)lncRNA在食管癌細(xì)胞株中的表達(dá)

2.3 沉默AP000487.1抑制食管癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力

為了研究AP000487.1在食管癌中的生物學(xué)功能,采用特異性的RNA抑制劑lncRNA Smart Silencer沉默AP000487.1在細(xì)胞中的表達(dá),qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Smart silencer-AP000487.1組AP000487.1表達(dá)顯著下調(diào)(圖3A)。在ECA109和TE-1細(xì)胞中沉默AP000487.1表達(dá)后,探究AP000487.1對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的影響。如圖3B所示,與Smart silencer-NC組對(duì)比,Smart silencer-AP000487.1組OD值顯著降低,細(xì)胞增殖能力顯著下降。Transwell實(shí)驗(yàn)表明降低AP000487.1在食管癌細(xì)胞株中的表達(dá)可顯著抑制ECA109和TE-1細(xì)胞的侵襲能力(圖3C)。降低AP000487.1在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)可有效抑制腫瘤細(xì)胞的遷移(圖3D)。

圖3 沉默AP000487.1對(duì)食管癌細(xì)胞的影響

2.4 過表達(dá)AP000487.1對(duì)促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響

為了進(jìn)一步研究AP000487.1在食管癌中的生物學(xué)功能,采用過表達(dá)純化質(zhì)粒pEXp-RB-Mam-AmpR-AP000487.1轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞株ECA109和TE-1中過表達(dá)AP000487.1,結(jié)果顯示與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組AP000487.1表達(dá)均顯著升高(圖4A)。在ECA109細(xì)胞中過表達(dá)AP000487.1后,探究其對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的影響。如圖4B所示,與Smart silencer-NC組對(duì)比,實(shí)驗(yàn)組OD值明顯升高,細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)AP000487.1組細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著增多(圖4C)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移速度均顯著升高(圖4D),表明上調(diào)AP000487.1在食管癌細(xì)胞中的表達(dá),可顯著提高腫瘤細(xì)胞的遷移能力。

圖4 過表達(dá)AP000487.1對(duì)食管癌細(xì)胞的影響

2.5 沉默AP000487.1對(duì)TLR/NF-κB信號(hào)通路的影響

Western blot方法發(fā)現(xiàn)TE-1細(xì)胞沉默AP000487.1表達(dá)后,p-p65和p-IκB表達(dá)顯著下調(diào);AP000487.1沉默前后蛋白表達(dá)灰度值比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5A-B)。說(shuō)明在TE-1細(xì)胞沉默AP000487.1表達(dá)后,可抑制NF-κB信號(hào)通路的活化。qRT-PCR方法檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路活化后炎癥因子的表達(dá),實(shí)驗(yàn)組TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)顯著下調(diào)(圖5C)。在TE-1細(xì)胞中沉默AP000487.1后,下調(diào)NF-κB信號(hào)通路,進(jìn)而影響TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)。以上結(jié)果表明,AP000487.1可能通過TLR/NF-κB信號(hào)通路調(diào)控食管癌發(fā)生發(fā)展。

圖5 Western blot和qRT-PCR檢測(cè)TLR/NF-κB下游相關(guān)蛋白及炎癥因子的表達(dá)

3 討論

食管癌是一類具有不同分子特征的異質(zhì)性疾病,由遺傳因素和環(huán)境因素等多因素共同作用發(fā)生[10]。在腫瘤進(jìn)展相關(guān)研究中,發(fā)現(xiàn)包括lncRNA在內(nèi)的分子圖譜可作為潛在的分子標(biāo)記物,在病人的早期診斷、預(yù)測(cè)病人的預(yù)后及靶向治療方面發(fā)揮重要作用[11-12]。

前期研究中,我們通過生物信息技術(shù)分析揭示了4個(gè)TLR/NF-κB相關(guān)lncRNAs在食管癌預(yù)后中的作用[9],但仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其在腫瘤發(fā)展中的作用。我們檢測(cè)了19例食管癌配對(duì)組織和食管癌細(xì)胞株中4個(gè)lncRNAs的表達(dá)情況,結(jié)果顯示AP000487.1在食管癌組織中表達(dá)差異最為顯著,且在4株食管癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)。AP000487.1在食管癌組織及食管癌細(xì)胞系中均表達(dá)上調(diào),說(shuō)明其可能在食管癌的發(fā)展中發(fā)揮生物學(xué)功能。盡管如此,AP000487.1在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用及調(diào)控機(jī)制尚不明確。

癌細(xì)胞獲得運(yùn)動(dòng)和侵襲能力、促進(jìn)轉(zhuǎn)移是腫瘤發(fā)展過程中最具危險(xiǎn)性的過程[13-14]。我們選用Smart silencer沉默lncRNA的表達(dá)。Smart silencer由3條ASO和3條siRNA構(gòu)成,采用優(yōu)化的設(shè)計(jì)計(jì)算和較新的化學(xué)修飾方式,相比普通的siRNA具有更高的抑制效率和靈敏度。我們發(fā)現(xiàn)在兩種食管癌細(xì)胞系中沉默AP000487.1后,可顯著抑制食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移情況。此外,在兩種食管癌細(xì)胞系中過表達(dá)AP000487.1,食管癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力顯著升高,這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明AP000487.1可能在食管癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的表型獲得中發(fā)揮重要作用。

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中,TLR/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮了重要作用[15]。大部分TLRs識(shí)別其配體后最終通過激活NF-κB信號(hào)通路調(diào)控一系列與腫瘤相關(guān)的炎癥因子的表達(dá)。Jia等[16]研究發(fā)現(xiàn),TLR3刺激觸發(fā)β-Catenin和NF-κB共同激活,促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞樣表型。Rajamanickam等[17]結(jié)果表明L6H21通過阻斷TLR4-MD2/NF-κB信號(hào)通路來(lái)抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移,靶向TLR/NF-κB/NLRP信號(hào)通路是增強(qiáng)腫瘤化療和免疫治療以及對(duì)抗化療耐藥新策略[18-19]。前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)AP000487.1與TLR/NF-κB信號(hào)通路高度相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)我們采用PCR法及Western blot方法檢測(cè)了TLR/NF-κB信號(hào)通路活化后相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)AP000487.1在細(xì)胞系中的表達(dá),可顯著抑制TLR/NF-κB信號(hào)通路的活化,提示AP000487.1參與了TLR/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控,并進(jìn)一步影響了食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述,本研究驗(yàn)證了AP000487.1在食管癌中高表達(dá),并通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證明AP000487.1可能通過TLR/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)了食管癌的增殖、侵襲和遷移,是食管癌診療的潛在靶點(diǎn)。