朱宇慧 周海東

[摘要]?膿毒癥是由宿主對感染反應(yīng)失調(diào)而引起的危及生命的器官功能障礙。炎癥小體可被多種病原微生物和內(nèi)源性危險信號激活，是機體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分。機體免疫系統(tǒng)紊亂是膿毒癥的主要病理機制之一，炎癥小體的活化及活性的調(diào)節(jié)在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。本文就常見炎癥小體及其與膿毒癥的相關(guān)研究進展作一綜述。

[關(guān)鍵詞]?膿毒癥；炎癥因子；作用機制

[中圖分類號]?R459.7??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.13.028

膿毒癥是由宿主對感染反應(yīng)失調(diào)而引起的危及生命的器官功能障礙。因?qū)δ摱景Y發(fā)生機制和治療方法認識有限，膿毒癥的發(fā)病率和病死率并未明顯降低。數(shù)據(jù)顯示，我國重癥監(jiān)護病房患者中的20%是膿毒癥患者，膿毒癥患者的90d病死率為35.5%[1-2]。膿毒癥病理機制復(fù)雜，是多因素共同作用并互相影響的結(jié)果。目前認為，宿主免疫反應(yīng)失調(diào)和凝血功能紊亂是膿毒癥的兩大致病機制。炎癥小體作為機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可識別多種病原微生物和內(nèi)源性危險信號，介導(dǎo)相關(guān)細胞因子的合成和釋放，維持人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)；同時，炎癥小體也在細胞焦亡機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。膿毒癥中，炎癥小體的適度激活能抵御病原體感染，減少組織損傷；而炎癥小體的過度活化會引起膿毒癥休克、臟器功能衰竭或發(fā)生繼發(fā)感染等。炎癥小體與膿毒癥的診斷、治療和預(yù)后密切相關(guān)。本文綜述炎癥小體及其與膿毒癥的相關(guān)研究進展，以期為研究機體通過炎癥小體調(diào)控膿毒癥的預(yù)防和治療提供參考和借鑒。

1??炎癥小體概述

炎癥小體于2002年被首次報道；作為胞質(zhì)內(nèi)多蛋白復(fù)合物，炎癥小體包括受體蛋白、接頭蛋白及下游的胱天蛋白酶（caspase）家族3部分。參與形成炎癥小體的受體蛋白包括核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體（nucleotide-binding?oligomerization?domain-like?receptor，NLR）、黑色素瘤缺乏因子2樣受體（absent?in?melanoma?2-like?receptor，ALR）和Pyrin。NLR家族以含半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域（caspase?recruitment?domain，CARD）的NLRC（NOD1、NOD2、NLRC3～5）及包含蛋白結(jié)構(gòu)域的NLRP（NLRP1～14）最為常見。ALR家族包括黑色素瘤缺乏因子2（absent?in?melanoma?2，AIM2）和γ干擾素誘導(dǎo)蛋白16兩大類蛋白。受體蛋白識別病原體相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式，啟動炎癥小體組裝。凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated?speck-like?protein?containing?caspase?recruitment?domain，ASC）是由熱蛋白結(jié)構(gòu)域（pyrin?domain，PYD）及CARD組成的二肽蛋白，可通過PYD-PYD與相應(yīng)受體蛋白結(jié)合，并以CARD-CARD與caspase前體作用。

2??炎癥小體的分類及活化

根據(jù)caspase的不同，炎癥小體分為依賴caspase-1的經(jīng)典途徑和依賴caspase-11/4/5的非經(jīng)典途徑兩類。參與依賴caspase-1經(jīng)典途徑的炎癥小體主要有NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2和Pyrin，通過相應(yīng)受體蛋白感知激活信號，借助ASC招募caspase-1前體至效應(yīng)區(qū)域激活。消皮素D（gasdermin?D，GSDMD）N端與C端的分子內(nèi)結(jié)合可抑制其寡聚化，caspase-1前體的活化不僅可解除該抑制，使GSDMD釋放活性N端蛋白，形成焦亡孔道，導(dǎo)致細胞腫脹裂解；GSDMD對白細胞介素（interleukin，IL）-1β/?IL-18的前體進行切割，使其成為成熟形式的蛋白，通過焦亡孔道釋放至胞外。IL-1β和IL-18可誘導(dǎo)其他細胞因子表達，募集和激活更多淋巴細胞至感染部位；亦可通過激活相關(guān)信號通路，上調(diào)多種促炎細胞因子的表達。依賴于caspase-11/4/5非經(jīng)典途徑的炎癥小體通路主要有兩種激活方式：①胞外脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）直接激活Toll樣受體4，觸發(fā)一系列胞內(nèi)級聯(lián)反應(yīng)、活化caspase-11/4/5前體；②高速泳動族蛋白B1（high?mobility?group?box-1?protein，HMGB1）和胞外LPS結(jié)合形成HMGB1-LPS復(fù)合物，經(jīng)晚期糖基化終末產(chǎn)物受體內(nèi)化，LPS進入胞質(zhì)后直接與caspase-11/4/5前體結(jié)合導(dǎo)致其寡聚激活。caspase-11/4/5切割GSDMD引起細胞焦亡，激活相關(guān)炎癥小體，活化caspase-1前體，釋放成熟的IL-1β和IL-18。目前，僅發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體參與依賴caspase-11/4/5的非經(jīng)典途徑。

3??炎癥小體與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展

既往研究認為，膿毒癥的初始階段主要發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征；當(dāng)宿主感染嚴重或抵抗力較弱、無法清除現(xiàn)有病原體、造成組織損傷后，便會發(fā)生失代償性炎癥反應(yīng)綜合征。二者在膿毒癥初期可能同時發(fā)生，只是主導(dǎo)地位不同。膿毒癥早期常表現(xiàn)為促炎癥反應(yīng)，觸發(fā)細胞因子級聯(lián)反應(yīng)，機體釋放大量促炎細胞因子，患者多有高熱、高代謝等臨床癥狀；后期則表現(xiàn)為抗炎反應(yīng)強于促炎反應(yīng)，產(chǎn)生抗炎介質(zhì)和細胞因子，可減輕細胞、組織、器官損傷，引起免疫抑制甚至免疫麻痹，導(dǎo)致現(xiàn)有感染無法完全清除或繼發(fā)再次感染，病情進一步加重。研究表明，免疫細胞所釋放的細胞因子可引起血小板減少，甚至發(fā)生彌散性血管內(nèi)凝血，這與膿毒癥患者的預(yù)后緊密相關(guān)[3-4]。人體免疫細胞合成和分泌的IL-1β、IL-18是誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)的必需介質(zhì)，又是機體清除病原體的必要因子，而維持適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)對機體極為重要。IL-1β和IL-18的成熟和活化受caspase-1的調(diào)控，而后者的調(diào)控與炎癥小體密切相關(guān)。綜上，炎癥小體在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展及治療過程中起著極為重要的作用。

3.1??NLRP1炎癥小體與膿毒癥

NLRP1炎癥小體由NLRP1受體、ASC和caspase-1前體組成。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP1b經(jīng)自切割或被炭疽致死因子水解后，可產(chǎn)生新的N末端。新的N末端促使NLRP1b經(jīng)N端介導(dǎo)的蛋白酶體降解途徑發(fā)生降解，釋放含有CARD結(jié)構(gòu)域的NLRP1b活性C端，完成炎癥小體組裝及下游caspase-1前體的活化[5-7]。Robinson等[8]研究表明，人NLRP1受體也可在腸病毒3C蛋白酶刺激下，通過此途徑暴露含CARD結(jié)構(gòu)域的活性C端，激活人NLRP1炎癥小體。鼠NLRP1各亞型的刺激物不甚相同，NLRP1b除可響應(yīng)炭疽致死因子外，還參與宿主對原蟲（如剛地弓形蟲）的清除。缺乏NLRP1b和NLRP3，宿主感染剛地弓形蟲后，IL-1β和IL-18促炎細胞因子生成減少，攜帶寄生蟲量增加，最終可死于感染[9]。NLRP1a則可促進NLRP1a-caspase-1復(fù)合物的形成，活化IL-1β。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP1aQ593P?Il1r–/–?小鼠在感染淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒后，會出現(xiàn)較長時間的骨髓發(fā)育不良甚至免疫抑制[10]。人NLRP1炎癥小體則可識別胞壁酰二肽、雙鏈RNA及多種病毒蛋白酶[11-13]。另有研究表明，膿毒癥患者的外周血單個核細胞中NLRP1基因表達減少，指出NLRP1的表達與膿毒癥患者病情嚴重程度、存活率相關(guān)[14-15]。膿毒癥休克患者中，存活者NLRP1的信使RNA明顯高于死亡者。當(dāng)膿毒癥患者處于免疫抑制時，可通過增加炎癥小體活性，改善患者的免疫功能，這可能有利于改善膿毒癥患者的預(yù)后。

3.2??NLRP3炎癥小體與膿毒癥

既往研究表明，NLRP3炎癥小體與膿毒癥的發(fā)生及預(yù)后密切相關(guān)。蓽苃明堿、大黃素、紫丁香酚等多種藥物均可通過抑制NLRP3炎癥小體活性，提高膿毒癥模型組的細胞活力和小鼠存活率[16-19]。NLRP3炎癥小體的激活受多種因素調(diào)節(jié)，如胞外腺苷三磷酸（adenosine?triphosphate，ATP）濃度升高、胞外滲透壓或酸堿度變化、K+外流、活性氧（reactive?oxygen?species，ROS）過量、線粒體功能障礙、NLRP3翻譯后修飾等，這些因素均可影響膿毒癥患者的預(yù)后。嘌呤能離子通道型受體7（purinergic?ligand-gated?ion?channel?7?receptor，P2X7R）是一類非特異性陽離子通道，與K+外流相關(guān)，可被胞外ATP激活。Sun等[20]研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥相關(guān)性腦病的P2X7R、NLRP3高度表達，給予P2X7R抑制劑后，NLRP3表達減少，病情進展得以延緩。Martínez-García等[21]研究發(fā)現(xiàn)，因胞外ATP濃度升高而被激活的P2X7R，可通過線粒體缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-?inducible?factor-1?alpha，HIF-1α）使NLRP3炎癥小體活化受損，誘發(fā)免疫抑制。提示無論激活的P2X7R促進或抑制NLRP3蛋白表達，均可能加快病情發(fā)展，在膿毒癥早期降低胞內(nèi)ATP濃度、抑制P2X7R，可改善患者預(yù)后。硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin?interacting?protein，TXNIP）是一種內(nèi)源性氧化還原調(diào)節(jié)劑，ROS生成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，促使TXNIP與NLRP3受體結(jié)合，誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體組裝。Yang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，LPS處理后TXNIP、NLRP3、切割型caspase-1表達均升高，沉默TXNIP可明顯降低上述蛋白的表達，提高細胞和小鼠存活率。多項以膿毒癥患者和同期健康體檢者為研究對象的臨床試驗發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者外周血單個核細胞中NLRP3蛋白高度表達、血清IL-1β濃度增高[14，23]。另有研究表明，膿毒癥患者若外周血單個核細胞中IL-1β濃度降低、ASC斑點形成受抑，NLRP3炎癥小體形成受損，預(yù)后更差[21，24]。推測輕度炎癥可活化NLRP3炎癥小體，減輕炎癥或減緩炎癥發(fā)展過程；重度炎癥除不能激活NLRP3炎癥小體外，可破壞其組裝，炎癥進一步加重，波及全身。

3.3??NAIP-NLRC4炎癥小體與膿毒癥

神經(jīng)元凋亡抑制蛋白（neuronal?apoptosis?inhibitor?protein，NAIP）和NLRC4同屬NLR家族。C57BL/6小鼠可編碼7種NAIP亞型，但目前僅發(fā)現(xiàn)4種亞型能夠識別不同的刺激物。NAIP1可識別Ⅲ型分泌系統(tǒng)（type?Ⅲ?secretion?system，T3SS）針樣蛋白，NAIP2可識別T3SS基座蛋白，NAIP5和NAIP6可識別胞質(zhì)鞭毛蛋白。人只有1種NAIP蛋白，僅識別T3SS針樣蛋白。因CARD結(jié)構(gòu)域的存在，NLRC4受體可直接活化caspase-1前體。在炎癥小體的組裝中，通常需要ASC放大信號，ASC允許caspase-8與NAIP/NLRC4結(jié)合，誘導(dǎo)細胞凋亡[25]。Zhang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，NLRC4受體可通過caspase-1激活內(nèi)源性凋亡。NLRC4因在鼠傷寒沙門菌感染引起的細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用而被發(fā)現(xiàn)，其機制可能為NAIP/NLRC4通過識別沙門菌毒力島（Salmonella?pathogenicity?islands，SPI）-1和SPI-2抑制細菌復(fù)制和感染，再聯(lián)合小腸上皮細胞將炎癥局限于腸道進而清除[27-28]。研究發(fā)現(xiàn)，感染傷寒沙門菌后，若NAIP/NLRC4活性不足，NLRP3-ASC-caspase-1也可被激活，但可能因小腸上皮細胞未能參與，并不能阻止炎癥侵犯淋巴結(jié)及全身[28-29]。NAIP/NLRC4除在腸道表達外，肺臟、脾臟、皮膚等器官也有表達，且已有研究證明其在銅綠假單胞菌感染引起的急性肺炎及LPS所致急性肺損傷中的表達明顯增高，基因敲除或抑制NLRC4受體活性，小鼠病死率降低[30-32]。NLRC4炎癥小體在獲得性肺炎繼發(fā)膿毒癥患者中表達明顯增高，尤其是未存活者[14]。整體而言，NAIP/?NLRC4炎癥小體具有保護肺、胃、腸等黏膜屏障免受細菌、病原體侵襲的作用，可影響膿毒癥的發(fā)生發(fā)展，改善其預(yù)后；但也可能因病原體不同、感染途徑各異、宿主細胞的差別，導(dǎo)致預(yù)后不盡相同，需更多的臨床試驗加以驗證。

3.4??AIM2炎癥小體與膿毒癥

AIM2炎癥小體包括AIM2受體、ASC、caspase-1前體3部分。靜態(tài)下，AIM2因PYD和HIN結(jié)構(gòu)域間形成的某一分子內(nèi)復(fù)合物而處于自我抑制狀態(tài)。當(dāng)HIN與雙鏈DNA結(jié)合后，可誘發(fā)PYD寡聚，而后與ASC結(jié)合，再招募caspase-1前體至活化區(qū)域，隨后IL-1β、IL-18成熟釋放，GSDMD-NT形成。但有研究表示，PYD結(jié)構(gòu)域也可通過自身寡聚而活化AIM2炎癥小體。AIM2炎癥小體參與如動脈粥樣硬化、結(jié)腸炎、癌癥等無菌炎癥過程；也在弗朗西絲菌、肺炎球菌等細菌感染和小鼠巨細胞病毒、牛痘病毒等病毒感染及真菌、原蟲感染中發(fā)揮重要作用。與此相對，某些病原體也可通過相關(guān)蛋白抑制AIM2活化，從而使病毒得以復(fù)制，如病毒蛋白pUL83在人巨細胞病毒感染早期、單純皰疹病毒1型的被膜蛋白VP22、乙型肝炎e抗原。研究表明，M2型丙酮酸激酶抑制劑紫草寧可減少活化的AIM2、NLRP3炎癥小體，提高經(jīng)LPS處理的細胞活力及盲腸結(jié)扎穿孔膿毒癥模型小鼠的生存率，而M2型丙酮酸激酶介導(dǎo)的糖酵解主要通過磷酸化真核翻譯起始因子2α激酶2調(diào)節(jié)巨噬細胞炎癥小體活性，提示代謝組學(xué)可能是膿毒癥的另一靶點[33]。另有研究報道，在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中，中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil?extracellular?trap，NET）合成增多，AIM2識別相關(guān)DNA并活化，進一步促進肺泡巨噬細胞焦亡，加重病情；基因敲除AIM2或NET?DNA降解后，小鼠生存率得以提高[34]。過量NET可附著于受損的血管上皮細胞，促進血小板聚集和凝血，形成免疫血栓。研究表明，免疫血栓全身性形成是彌散性血管內(nèi)凝血發(fā)展的一個階段[35]。在膿毒癥患者中，AIM2炎癥小體的基因表達增多[36]。因此，調(diào)控AIM2炎癥小體可能是治療膿毒癥的新靶點。

3.5??Pyrin炎癥小體與膿毒癥

Pyrin炎癥小體包括Pyrin受體、ASC、caspase-1前體。靜態(tài)下，Pyrin蛋白受多種因素影響而處于靜息狀態(tài)。如被小G蛋白超家族成員RhoA鳥苷三磷酸（guanosine?triphosphate，GTP）激活的RhoA蛋白激酶C樣激酶磷酸化人Ser208、Ser242（小鼠對應(yīng)位點為Ser205、Ser241），調(diào)節(jié)蛋白14-3-3再與之結(jié)合覆蓋活化位點；PYD結(jié)構(gòu)域同B-box結(jié)合，未能暴露活化位區(qū)域；CC結(jié)構(gòu)域形成反平行二聚體；B30.2二聚體同富含脯氨酸的CC結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成三聚體等?；罨疨yrin通過RhoA?GTP酶修飾和失活，使肌動蛋白細胞骨架紊亂，Pyrin蛋白Ser208、Ser242同時發(fā)生去磷酸化，激活的Pyrin在微管蛋白的協(xié)助下募集ASC與caspase-1前體。研究證實，艱難梭菌毒素A和艱難梭菌毒素B糖基化、嗜組織菌Fic-結(jié)構(gòu)域效應(yīng)蛋白腺苷?；?、肉毒桿菌C3毒素腺苷二磷酸-核糖基化、副溶血性弧菌腺苷?；?、洋蔥伯克霍爾德菌TecA脫氨化等修飾信號可被Pyrin炎癥小體識別[37-38]。后續(xù)研究證實，百日咳毒素腺苷二磷酸-核糖基化、耶爾森菌YopE/T/M/J通過不同作用機制也可激活Pyrin炎癥小體[39-41]。適度激活該炎癥小體有利于病原菌的清除，恢復(fù)機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)；而過度刺激可能致感染無法有效控制甚至進一步加重，誘發(fā)膿毒癥。有關(guān)Pyrin炎癥小體在膿毒癥患者中的作用機制亟待進一步研究探索。

4??總結(jié)和展望

綜上所述，在膿毒癥的不同階段，針對不同的臨床表現(xiàn)和炎癥反應(yīng)狀態(tài)，對不同炎癥小體的活性進行精準調(diào)控，對膿毒癥的預(yù)防、發(fā)展、治療和預(yù)后都有積極意義。隨著對膿毒癥、炎癥小體研究的不斷深入，人們對炎癥小體的分子結(jié)構(gòu)、作用機制、信號傳導(dǎo)、活性調(diào)控等有了更清晰的認識。各炎癥小體在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。但仍有很多問題亟待探究，如各炎癥小體具體激活物的信號路徑、各炎癥小體之間的相互作用機制等。亟需更多關(guān)于炎癥小體的臨床及相關(guān)通路研究，為膿毒癥的早期診斷、針對性治療提供理論依據(jù)。

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