薛雅 施竹玥 李舒敏 王婷 陳淑婷 趙榮 李素華 張麗華

摘要 為研究高溫脅迫對多肉植物‘萬圣節(jié)花青素代謝的影響，以‘萬圣節(jié)扦插苗為材料，對其進行37 ℃處理，分別處理0、6、12、24、48 h，測定各處理下‘萬圣節(jié)葉片花青素含量、過氧化物酶活性、多酚氧化酶活性、過氧化物酶基因和多酚氧化酶基因的表達水平。結(jié)果表明，在高溫脅迫處理的48 h內(nèi)，‘萬圣節(jié)葉片花青素含量總體呈現(xiàn)下降的趨勢，但前12 h內(nèi)花青素含量無顯著變化；‘萬圣節(jié)葉片多酚氧化酶活性和過氧化物酶總體均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且均在24 h時達到頂峰；過氧化物酶基因cluster-7 148.177和cluster-7 148.112 77表達水平的變化趨勢總體上與過氧化物酶活性的變化較為一致，但是過氧化物酶基因cluster-7 148.326 45和cluster-7 148.152 9的變化趨勢與過氧化物酶活性的變化趨勢不一致。由此可見，高溫脅迫處理影響‘萬圣節(jié)葉片中花青素的積累、多酚氧化酶和過氧化物酶活性；多酚氧化酶基因cluster-7 148.531 8、過氧化物酶基因cluster-7 148.177和cluster-7 148.112 77可能在高溫引起的‘萬圣節(jié)花青素降解中起重要作用。

關(guān)鍵詞 高溫脅迫；多肉植物；花青素代謝

中圖分類號 TS201.3 文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）03-0029-05

Effects of High Temperature on the Metabolism of Anthocyanins in

Aeonium arboreum ′Halloween′

XUE Ya? ?SHI Zhuyue? ?LI Shumin? ?WANG Ting? ?CHEN Shuting? ?ZHAO Rong? ?LI Suhua? ?ZHANG Lihua

（Suqian College， Suqian Jiangsu 223800）

Abstract In order to study the effect of high temperature stress on the anthocyanin metabolism of Aeonium arboreum 'Halloween'， the cuttings of 'Halloween' were used as materials and treated at 37 ℃ for 0 h， 6 h， 12 h， 24 h and 48 h， respectively. Then， the anthocyanin content， peroxidase activity， polyphenol oxidase activity， peroxidase gene and polyphenol oxidase gene expression levels in the leaves of 'Halloween' under each treatment were determined. The results showed that the anthocyanin content in the leaves of 'Halloween' showed a downward trend in the 48 h of high temperature stress treatment， but there was no significant change in the first 12 h; the activity of polyphenol oxidase and peroxidase in the leaves of 'Halloween' showed a trend of increasing first and then decreasing， and both reached the peak at 24 h; the change trend of the expression level of peroxidase genes cluster-7 148.177 and cluster-7 148.112 77 was generally consistent with the change trend of peroxidase activity， however， the change trend of peroxidase genes cluster-7 148.326 45 and cluster-7 148.152 9 is not consistent with the change trend of peroxidase activity. High temperature stress affects the accumulation of anthocyanins， polyphenol oxidase and peroxidase activities in leaves of 'Halloween'; polyphenol oxidase gene cluster-7 148.531 8， peroxidase gene cluster-7 148.177 and cluster-7 148.112 77 may play an important role in the degradation of 'Halloween' anthocyanins induced by high temperature.

Keywords high temperature stress; succulent plants; anthocyanin metabolism

多肉植物是一類具有膨大且肉質(zhì)化器官的高等植物，多生于較干旱的地區(qū)，常體型小巧。這類植物因其小巧優(yōu)雅的形態(tài)、絢麗奪目的色彩和耐陰耐旱的適應性，廣受園藝愛好者的青睞，成為我國新興產(chǎn)業(yè)。近年來已經(jīng)形成四大多肉植物主產(chǎn)區(qū)，分別是山東青州、云南昆明、福建漳州和江蘇常州，多個具有相當規(guī)模的種植基地、特色小鎮(zhèn)和國家農(nóng)業(yè)龍頭企業(yè)應運而生，多肉產(chǎn)業(yè)對經(jīng)濟發(fā)展和鄉(xiāng)村振興起到了較大的推動作用[1-2]。

花青素在植物組織中廣泛存在，對植物葉片、花和果實的著色起著至關(guān)重要的作用[3]。色彩對觀賞植物的重要性不言而喻，因而花青素代謝的研究一直是觀賞植物的研究熱點，如矮牽牛、月季、百合等植物均有相關(guān)研究的報道[4-6]。合成和降解是花青素代謝中2個重要的過程?；ㄇ嗨厣锖铣赏緩揭咽置魑?，該途徑由一系列酶基因構(gòu)成[7]，在這些酶基因上游存在著一些調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平的轉(zhuǎn)錄因子，如MYB、BHLH和WD40等轉(zhuǎn)錄因子[8]。目前花青素代謝的研究主要集中在花青素生物合成及其調(diào)控上，花青素降解相關(guān)的研究還少有報道，僅有少數(shù)文獻報道花青素降解可能與過氧化物酶、多酚氧化酶活性有關(guān)[9-10]。

‘萬圣節(jié)（Aeonium arboreum‘Halloween）為景天科蓮花掌屬多肉植物，分布于亞洲、非洲和美洲的干旱和半干旱地區(qū)?！f圣節(jié)形態(tài)優(yōu)雅、色彩艷麗、觀賞價值高，在多肉生產(chǎn)中占有重要地位。然而，夏季高溫下葉色紅艷的‘萬圣節(jié)易變暗淡，觀賞價值降低，經(jīng)濟效益不理想。本課題組前期的研究表明，彩葉‘萬圣節(jié)葉片中主要的色素是矢車菊3-o-半乳糖苷，該色素是一種天然花青素，這意味著高溫影響了‘萬圣節(jié)葉片中花青素的代謝?；诖?，該研究以‘萬圣節(jié)扦插苗為材料，對其進行37 ℃處理，分別處理0、6、12、24、48 h，測定各處理下‘萬圣節(jié)葉片花青素含量、過氧化物酶活性、多酚氧化酶活性、過氧化物酶基因和多酚氧化酶基因的表達水平，探明高溫對‘萬圣節(jié)花青素代謝的影響，以期為減輕或消除高溫對‘萬圣節(jié)葉片呈色的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取宿遷學院園林實驗基地苗床上當年扦插的‘萬圣節(jié)單頭植株為材料，將大小一致的扦插苗移入盆中栽培，盆高20 cm，上口直徑24 cm，每盆1 株，分5個處理，每處理6盆，共移栽30盆，培養(yǎng)于室溫為18 ℃的生長室內(nèi)。在移栽21 d后，‘萬圣節(jié)生長趨于穩(wěn)定，此時將30盆植株轉(zhuǎn)至37 ℃的人工氣候箱進行培養(yǎng)，分別培養(yǎng)0、6、12、24、48 h后取‘萬圣節(jié)植株第4至第5輪的葉片，檢測不同處理時長下葉片花青素含量、過氧化物酶活性、多酚氧化酶活性、過氧化物酶基因和多酚氧化酶基因的表達水平，3次重復，取平均值進行統(tǒng)計分析。

1.2 試驗方法

花青素含量測定采用0.1%鹽酸比色法[11]，過氧化物酶活性測定采用愈創(chuàng)木酚比色法[11]，多酚氧化酶活性測定采用鄰苯二酚比色法[12]，‘萬圣節(jié)葉片RNA提取采用天根生化的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒，熒光定量PCR采用朗基Q2000B進行。采用Primer Premier 5設(shè)計過氧化物酶基因和多酚氧化酶基因的定量引物（表1），‘萬圣節(jié)AaACT2為內(nèi)參基因。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用GraphPad Prism 5制圖，采用SPSS 25.0進行ANOVA單因素分析，分析數(shù)據(jù)間是否具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對‘萬圣節(jié)葉片花青素含量的影響

由圖1可知，高溫脅迫對‘萬圣節(jié)葉片中花青素積累量影響很大。在高溫脅迫處理的48 h內(nèi)，隨著時間的延長，‘萬圣節(jié)葉片花青素含量總體呈現(xiàn)下降的趨勢，花青素含量在高溫脅迫處理的12 h內(nèi)無顯著變化，24 h后才表現(xiàn)出顯著下降，且24和48 h后的花青素含量無顯著性差異。

2.2 高溫脅迫對‘萬圣節(jié)葉片多酚氧化酶含量的影響

由圖2可知，高溫脅迫對‘萬圣節(jié)葉片中多酚氧化酶活性具有一定的影響。在高溫脅迫處理的48 h內(nèi)，隨著時間的延長，‘萬圣節(jié)葉片多酚氧化酶活性總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，多酚氧化酶活性在高溫脅迫處理的6 h內(nèi)無顯著的變化，12 h后才表現(xiàn)出顯著的上升，在24 h時達到頂峰，后呈現(xiàn)下降趨勢。

2.3 高溫脅迫對‘萬圣節(jié)葉片過氧化物酶含量的影響

由圖3可知，高溫脅迫對‘萬圣節(jié)葉片中過氧化物酶活性具有一定的影響。在高溫脅迫處理的48 h內(nèi)，隨著時間的延長，‘萬圣節(jié)葉片過氧化物酶活性總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，多酚氧化酶活性在高溫脅迫處理的12 h內(nèi)無顯著的變化，24 h后才表現(xiàn)出顯著的上升，后呈現(xiàn)下降趨勢。

2.4 高溫脅迫對‘萬圣節(jié)葉片多酚氧化酶基因表達的影響

為進一步探究多酚氧化酶對高溫脅迫下花青素積累的影響，從已構(gòu)建的‘萬圣節(jié)葉片轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選出1個可能的多酚氧化酶基因cluster-7 148.531 8，并以高溫脅迫下的‘萬圣節(jié)葉片為材料，進行了該基因的表達量分析。由圖4可知，高溫脅迫對‘萬圣節(jié)葉片中多酚氧化酶基因的表達影響很大，在高溫脅迫處理的48 h內(nèi)，隨著時間的延長，‘萬圣節(jié)葉片多酚氧化酶基因的表達水平總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，多酚氧化酶基因的表達水平在高溫脅迫處理的12 h內(nèi)無顯著的變化，24 h后才表現(xiàn)出顯著的上升，后呈現(xiàn)下降趨勢。

2.5 高溫脅迫對‘萬圣節(jié)葉片過氧化物酶基因表達的影響

為進一步探究過氧化物酶對高溫脅迫下花青素積累的影響，從已構(gòu)建的‘萬圣節(jié)葉片轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選出了4個可能的過氧化物酶基因，并以高溫脅迫下的‘萬圣節(jié)葉片為材料，進行了上述基因的表達量分析。由圖5可知，高溫脅迫對‘萬圣節(jié)葉片中過氧化物酶基因的表達影響很大，在高溫脅迫處理的48 h內(nèi)，隨著時間的延長，‘萬圣節(jié)葉片中4個過氧化物酶基因的表達水平總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，cluster-7 148.177、cluster-7 148.112 77和cluster-7 148.326 45這3個過氧化物酶基因的表達水平在高溫脅迫處理的12 h內(nèi)無顯著的變化，24 h后才表現(xiàn)出顯著的上升，前2個基因在48 h后呈現(xiàn)下降趨勢，而最后一個基因48 h與24 h的表達水平無顯著變化。過氧化物酶基因cluster-7 148.152 9較為獨特，在高溫脅迫處理的48 h內(nèi)，隨著時間的延長，該基因的表達水平總體呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢，表達水平的高峰分別在0和24 h。

3 結(jié)論與討論

花青素是植物中分布較為廣泛的一類色素，其負責的顏色范圍從紅色到紫色及藍色。目前，花青素的生物合成途徑已被解析清楚，花青素的合成調(diào)控已有諸多研究進展，然而學界目前對花青素在植物中的穩(wěn)定性和分解代謝知之甚少。在紅花檵木[13]、茄子[14]和‘紅陽獼猴桃[15]中的研究表明，高溫會顯著減少植物中花青素的積累，這一結(jié)論與該研究結(jié)果相一致。然而，不同的物種對不同高溫的反應并不相同，紅花檵木中35 ℃處理1周即可使紅色的葉片轉(zhuǎn)青，‘紅陽獼猴桃40 ℃處理后，其果肉內(nèi)果皮中花青素含量迅速下降?；ㄇ嗨卦诟邷貤l件下顯著減少，這一過程中肯定存在著花青素降解這一過程。氧化水果提取物中花青素的主要酶之一是多酚氧化酶，該酶是一大類酶，普遍存在于高等植物中，在綠原酸或咖啡酰酒石酸存在下，多酚氧化酶增加了水果提取物和果汁中花青素的降解速率[16]。另一種可降解水果提取物中花青素的酶是過氧化物酶，因為在H2O2存在的條件下，過氧化物酶可降解水果提取物中的花青素[17]，且過氧化物酶在高溫條件下可直接參與紅葡萄漿果花青素分解代謝[18]。因而，該研究主要測定了以上2種酶的活性及可能編碼這2類酶的基因表達水平。結(jié)果顯示，在‘萬圣節(jié)葉片經(jīng)受高溫脅迫的過程中，多酚氧化酶活性的變化與多酚氧化酶基因cluster-7 148.531 8表達水平的變化趨勢一致，均為先上升后下降，過氧化物酶活性的變化總體上與過氧化物酶基因cluster-7 148.177和cluster-7 148.112 77表達水平的變化趨勢較為一致，均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，但是過氧化物酶基因cluster-7 148.326 45和cluster-7 148.152 9的變化趨勢與過氧化物酶活性的變化趨勢并不一致。過氧化物酶是一類酶，具有多個成員，每個成員的功能不盡相同，因而推測cluster-7 148.326 45和cluster-7 148.152 9可能并不負責高脅迫下的花青素降解過程。

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（責編：王慧晴）

基金項目 2021年宿遷學院省級大學生創(chuàng)新訓練項目（202114160039Y）；宿遷學院創(chuàng)新團隊項目（2021td05）。

作者簡介 薛雅（2001—），女，江蘇鹽城人。研究方向：多肉植物種質(zhì)資源創(chuàng)新與應用。

趙榮*通信作者

收稿日期 2022-04-05