單崇蕾　山草梅　陳蘭蘭　況衛(wèi)剛　林椏春　張連虎　崔汝強

關鍵詞：水稻潛根線蟲；烯酰輔酶A 水合酶；抗病基因

中圖分類號：S511 文獻標識碼：A

水稻是世界上最重要的農(nóng)作物之一，全球超過一半以上的人口以水稻為主食[1]。為滿足人口增長需要，據(jù)預測，至2030 年，水稻產(chǎn)量需要增加至少25%。隨著測序技術的快速發(fā)展及基因組的易操作性，水稻已經(jīng)成為一種重要的模式生物，用以研究植物性狀及與病原微生物的互作。水稻生產(chǎn)中受到多種病原物的影響，寄生線蟲是一類最具經(jīng)濟破壞性的植物病原體之一，每年導致全球產(chǎn)量損失1730 億美元，因此，防控線蟲病害是水稻生產(chǎn)中的一項重要工作[2-3]。

水稻潛根線蟲是一類寄生于水稻根部的遷移性內寄生線蟲，該線蟲在世界水稻種植區(qū)如歐洲、亞洲和非洲等地均有被發(fā)現(xiàn)，分布極其廣泛[4-6]。在我國水稻種植區(qū)，如廣東、湖南、湖北、江西、福建等地，均發(fā)現(xiàn)有潛根線蟲的為害[6]。水稻潛根線蟲利用其口針穿刺水稻細胞，進入根表皮細胞，在根表皮細胞中取食遷移，造成細胞機械損傷。線蟲的侵染會導致表皮細胞壞死，破壞皮層細胞，導致皮層和壞死區(qū)出現(xiàn)空洞，根部腐爛并呈現(xiàn)黃褐色；地上部分的為害表現(xiàn)為水稻伸長遲緩、株高降低、分蘗延遲、產(chǎn)量降低[7]。已有研究報道發(fā)現(xiàn)，有11 種潛根線蟲可成功侵染水稻，其中水稻細尖潛根線蟲是危害江西省水稻種植最嚴重的寄生線蟲[4， 8]。

在本研究前期工作中，已對來自世界各地的560 個水稻品種進行水稻潛根線蟲的抗性鑒定，并從中篩選出易感水稻品種‘霸王鞭（R155），同時對接種線蟲的‘霸王鞭（RN155）和未接種線蟲的‘霸王鞭（R155）進行了轉錄組測序[7]。結果發(fā)現(xiàn)‘霸王鞭品種中編碼烯酰輔酶A 水合酶（enoyl-CoA hydratase， OsECH1）的一個基因Os01g0752200（LOC4324637）表達量顯著上調，因此，該基因是否參與細尖潛根線蟲的侵染，加強或降低水稻的抗病性是一個非常值得研究的問題。鑒于此，本研究以OsECH1 基因作為研究對象，對其結構特點、亞細胞定位及互作蛋白進行初步分析。同時獲得OsECH1 基因的過表達及基因沉默的轉基因水稻，進一步明確OsECH1 基因的功能，為進一步研究水稻抗?jié)摳€蟲的分子機理提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料

‘日本晴水稻種子、過表達載體pCAMBIA-1302、原核載體pET28a、分子伴侶pTf16、農(nóng)桿菌GV3101、大腸桿菌感受態(tài)DH5α、水稻細尖潛根線蟲均為本實驗室保存。RNAi 載體pBWA（V）HS 及轉基因水稻由武漢伯遠生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 OsECH1 生物信息學分析 在NCBI 中進行BlastP 搜索OsECH1 在各種模式植物中的同源蛋白。選取的序列有黍（ Panicum hallii， XP025814293.1）、柳枝稷（Panicum virgatum， XP039849084.1 ）、小米（ Setaria italica， XP004969966.1）、玉米（Zea mays， NP 001150290.1）、高梁（Sorghum bicolor， XP 002458497.1）、短柄草（Brachypodium distachyon， XP 003567122.1）、秈稻（Oryza sativa Indica Group， EEC 71489.1）、大麥（ Hordeum vulgare subsp. Vulgare， XP044977061.1 ） 和小麥（ Triticum aestivum， XP044341339.1， XP 044357827.1， XP 044350069.1）。根據(jù)得到的OsECH1 的同源蛋白，利用MEGA 7.0軟件采用最大似然法（maximum likelihood）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行1000 次的bootstrap 的分析驗證。利用在線軟件MEME 進行motif 分析（ https：//meme-suite.org/meme/tools/streme ）； 在NCBI 中進行蛋白結構域的預測分析（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）；在NCBI 中對‘日本晴基因組文件下載，并完成對‘日本晴中ECH 家族的基因定位（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome）。利用在線軟件EXPASY對OsECH1 蛋白的理化性質進行分析（https：//web.expasy.org/protparam/）；利用在線軟件EXPASYProtscale對OsECH1 蛋白的親疏水性進行分析（https：//web.expasy.org/protscale/）；通過NetPhos3.1 Server 預測OsECH1 蛋白氨基酸序列的磷酸化位點情況（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetPhos-3.1）。

1.2.2 水稻材料的生長條件 水稻種子在28 ℃的無菌水中發(fā)芽3 d 后，移栽至營養(yǎng)土中（營養(yǎng)土壤∶珍珠巖∶蛭石=3∶1∶1），并在人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設置氣溫范圍為28～30 ℃，相對濕度范圍為85%～90%。

1.2.3 水稻RNA 制備和RT-qPCR 分析 利用RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）試劑盒提取水稻根總RNA， 利用EasyScript? One-Step gDNARemoval and cDNA Synthesis SuperMix（TRAN）試劑盒合成cDNA。在CFXTM 96 Real-Time PCRdetection system（Bio Rad）中進行實時定量PCR，使用PerfectStart Green qPCR SuperMix?（TRAN）完成RT-qPCR，其引物序列見表1，并使用2–ΔΔCT方法分析數(shù)據(jù)[9]。

1.2.4 OsECH1 亞細胞定位 構建pCAMBIA1302-OsECH1-GFP 載體用于亞細胞定位。使用電轉法將質粒轉入根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101 感受態(tài)中；轉化完成后，將轉化的細菌在含有抗生素LB 培養(yǎng)基中于28 ℃培養(yǎng)過夜；次日，取1 mL 過夜菌液以1∶100 的比例擴大培養(yǎng)，直至菌液在OD600=1～1.5 ， 使用MES 緩沖液（ 10 mmol/LMgCl2，10 mmol/L MES，pH 5.6）收集菌體重懸3 次并將懸浮液調整至OD600=0.25～0.5；將懸浮液注射至水稻原生質體中，并將材料在黑暗培養(yǎng)中保持24～48 h，最后使用激光共聚焦顯微鏡觀察亞細胞定位的熒光信號。

1.2.5 OsECH1 互作蛋白的獲得 將沒有信號肽序列的OsECH1 蛋白的編碼區(qū)插入至pET28a 載體中，并將其轉入至含有pTf16 的感受態(tài)細胞中（本實驗室保存）。構建成功的表達菌株于37 ℃涂布培養(yǎng)， 并挑取單菌落擴大培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8。加入IPTG 誘導，超聲后分別吸取上清、菌體，加入6×protein loading buffer 煮沸，進行SDS-PAGE 和Western blot 分析。對重組蛋白的表達條件優(yōu)化后進行大量表達，用于后續(xù)的蛋白純化。利用ProteinIso? Ni-NTA Resin 試劑盒獲得純化蛋白，所有步驟均按照說明書進行。誘導表達純化和濃縮的蛋白與水稻根總蛋白孵育互作完成后，使用290 mmol/L 咪唑洗脫液洗脫互作蛋白，然后進行SDS-PAGE 凝膠電泳檢測。蛋白質質譜檢測由武漢金開瑞生物工程有限公司完成。

2 結果與分析

2.1 OsECH1 蛋白的生物信息學分析

根據(jù)水稻‘霸王鞭接種細尖潛根線蟲的轉錄組數(shù)據(jù)分析，結果發(fā)現(xiàn)一個編碼烯酰輔酶A 水合酶（ enoyl-CoA hydratase， OsECH1） 的基因Os01g0752200（LOC4324637）在線蟲侵染水稻時，表達量明顯上調。從圖1 可看出，水稻‘霸王鞭在被細尖潛根線蟲侵染時，OsECH1 基因的表達量明顯提高，說明該基因響應細尖潛根線蟲的侵染。

利用OsECH1 蛋白序列在水稻基因組中的序列比對分析，結果發(fā)現(xiàn)水稻基因組中有5 個同源基因，OsECH1 基因位于Chr1（染色體1）上（圖2）。對來自其他8 個物種中的OsECH1 同源蛋白進行序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析， 結果表明，OsECH1 與秈稻（Oryza sativa Indica Group， EEC71489.1）更相似。此外，這些同源蛋白均具有相同的基序和保守結構域，這表明OsECH1 蛋白具有烯醇輔酶A 水合酶活性（圖3）。

2.2 OsECH1 蛋白的理化性質分析利用DNAMAN 8 軟件對OsECH1 基因序列及其編碼氨基酸序列進行分析，結果顯示，該基因ORF 為1170 bp，編碼389 個氨基酸。利用在線軟件ExPASy-ProtParam tool 分析OsECH1 蛋白的氨基酸組成及理化性質，結果表明，該蛋白分子式為C1915H3029N517O595S15，相對分子質量為43.30 kDa，理論pI 為5.15，脂肪系數(shù)為84.50，該蛋白有159 個疏水性氨基酸，230 個親水性氨基酸，84 個酸性氨基酸，51 個堿性氨基酸（圖4）。

2.3 OsECH1 蛋白的親疏水性分析

借助軟件ProtScale 分析OsECH1 蛋白的親/疏水性，結果顯示，最大值為–2.75，最小值為2.25，總平均親水性（GRAVY）為–0.316，表明OsECH1 蛋白為親水性肽鏈（圖5）。

2.4 OsECH1 蛋白的磷酸化位點分析

OsECH1 蛋白含有絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）磷酸化位點數(shù)分別為26 個、14個和3 個（圖6）。

2.5 OsECH1 蛋白的亞細胞定位

蛋白質的亞細胞定位是闡明其相互作用的蛋白質、功能及其在細胞中的潛在作用的重要步驟[10]。本研究將構建好的1302-OsECH1 質粒轉入水稻原生質體細胞中， 熒光信號結果顯示OsECH1 蛋白定位于細胞核中（圖7）。

2.6 OsECH1蛋白與5個防御相關蛋白互作分析

將重組載體pET28a-OsECH1 成功轉入BL21（pTf16）中進行擴大培養(yǎng)后，用IPTG 大量誘導表達。利用親和鎳層析柱進行蛋白純化，分別用濃度從低至高20、60、80、100、200、500 mmol/L咪唑進行洗脫。以純化的OsECH1 蛋白作為誘餌，以水稻根總蛋白作為獵物，進行His-tag pull down分析。結果發(fā)現(xiàn)5 個蛋白與OsECH1 蛋白相互作用（表2），包括vATP-synt_E 家族蛋白（OsVE，Os01g0659200）、Ricin-B 家族蛋白（OsR40C1，Os03g0327600；OsR40G2，Os07g0683900）、過氧化氫酶（OsCATB，Os06g0727200）、B_lectin（OsBAT1， Os09g0111950）。

2.7 OsECH1 基因調控5 個互作蛋白的表達

為了更好地了解OsECH1 基因對其互作蛋白的調控，本研究構建了OsECH1 基因的過表達載體及RNAi 載體，并獲得過表達（OE-OsECH1）水稻和基因沉默（RNAi-OsECH1）水稻。為了確保已獲得轉基因水稻的陽性植株，在轉基因水稻中觀察OsECH1 的表達水平變化。與野生型‘日本晴（WT）相比，該基因的表達量在RNAi-ECH水稻中顯著減少，在OE-ECH 水稻中顯著增強。表明已成功獲得了OsECH1 基因的過表達和基因沉默轉基因水稻（圖8A）。

為了研究OsECH1 基因與5 個蛋白之間的關系，分別分析其在3 種水稻中的表達量變化情況。RT-qPCR 結果顯示，OsVE、OsCATB、OsR40G2基因的表達量在RNAi-OsECH1 水稻中顯著上調，OsBAT1 基因的表達量在OE-OsECH1 水稻中顯著上調， OsR40C1 基因在RNAi-OsECH1 、OEOsECH1水稻中均顯著上調（圖8B）。以上結果表明，OsECH1 基因對這5 個蛋白具有調控作用，為后續(xù)探究OsECH1 基因的功能提供新思路。

2.8 OsECH1 蛋白影響細尖潛根線蟲的侵染

為了驗證轉錄組分析結果，比較OsECH1 基因在健康的野生型‘日本晴（WT）與受侵染的野生型‘日本晴中的表達水平（圖9A）。OsECH1基因在受侵染的WT 水稻根部中表達較高（12%～15%）。通過比較3 種水稻中細尖潛根線蟲基因的表達量變化，發(fā)現(xiàn)與WT 水稻相比，在RNAi-OsECH1 水稻中細尖潛根線蟲的侵染量增加，但在OE-OsECH1 水稻中細尖潛根線蟲的侵染量減少（圖9B）。結果再次表明OsECH1 蛋白可能在植物與細尖潛根線蟲的互作中起作用。

3 討論

目前，水稻病害日益嚴重，尤其是植物寄生線蟲病。隨著水稻中植物寄生線蟲抗性基因的分離和克隆技術的快速發(fā)展，極大地促進了植物與線蟲之間互作的研究，更有利于防治植物線蟲病。雖然關于線蟲效應子的研究越來越多，但關于水稻潛根線蟲的研究較少。通過研究線蟲效應子尋找水稻抗病基因一直是一個研究熱點。廖金鈴和卓侃團隊發(fā)現(xiàn)了根結線蟲效應子MgMO289 靶向水稻銅金屬伴侶OsHPPO4 抑制水稻的方位反應，以影響植物免疫并促進侵染，這是首次發(fā)現(xiàn)植物病原物利用植物超氧陰離子降解系統(tǒng)清除活性氧，從而抑制植物免疫反應[11]。雖然在寄主植物中已經(jīng)成功克隆了一些抗線蟲基因，但其抗性機制尚不清楚，并且寄主植物與線蟲的相互作用模型尚未建立。因此，線蟲效應子與抗性基因蛋白相互作用的研究將有助于進一步研究寄主植物-寄生線蟲相互作用的機制。

前期研究表明，烯酰輔酶A 水合酶（ECH）屬于水合酶/異構酶家族，并且ECH 在不同物種中序列同源性非常高[12-13]。ECH 是脂肪酸β 氧化過程中不可缺少的酶，ECH 的異常代謝會導致脂肪酸代謝紊亂[14]。因此，酰輔酶A 水合酶在生命活動中有著非常重要的作用。目前，ECH 的功能在哺乳動物中被廣泛研究，而在植物中的研究較少。已有研究證明水稻中的ECH 與MAP1 相互作用，MAP 蛋白與稻瘟病的防治有關，從而證明ECH 可能為稻瘟病的防治提供新的方向[15]。編碼烯脂酰輔酶A 合成酶的ACTT5、編碼烯脂酰輔酶A 水合酶ACTT6 是葡萄孢白僵菌柑橘致病型中活性毒素生物合成的必需基因[16]。

本研究在日本晴根部cDNA 中克隆出OsECH1基因并獲得其純化蛋白。通過His-tag pull down實驗發(fā)現(xiàn)5 種蛋白與OsECH1 互作，包括vATPsynt_E 家族蛋白、Ricin-B 家族蛋白、過氧化氫酶（CAT）和B_lectin 家族蛋白，而這些家族均已經(jīng)被證明與防御相關。

OsR40C 家族于1997 年由MOONS 等[17]首次報道，OsR40C1 和OsR40G3 的表達水平在鹽處理的水稻根中顯著上調。CAT 在植物生長發(fā)育、脅迫防御反應、氧化衰老等生理過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，脫落酸（ABA）通過誘導水分脅迫下水稻葉片中的OsCATB 控制H2O2 積累[18]。低溫、干旱、氧化應激、水楊酸（SA）和ABA可誘導擬南芥中CAT1、CAT2 和CAT3 基因的表達和CAT 酶活性[19]。V-ATPase 酶對植物生長和發(fā)育至關重要。研究發(fā)現(xiàn)細胞中的V-ATPase 酶參與植物對寒冷、鹽分和重金屬脅迫的反應。高鹽和低溫脅迫可以誘導V-ATPase 酶的結構和數(shù)量發(fā)生變化，從而提高個體植物對環(huán)境變化的適應性，減少逆境對個體植物的傷害[20]。擬南芥的V-ATPase 酶的a、e 和g 亞基也可被高鹽脅迫誘導，這表明 V-ATPase 酶在應激反應中存在潛在功能[21]。植物凝集素廣泛分布于動物、植物和微生物中，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)1000 多種植物凝集素，它已被公認是高表達蛋白，在水稻中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了1100個基因[22]。植物凝集素可以特異性結合糖類，在植物防御反應中發(fā)揮重要作用[23]。Pi-d2 是水稻中的一種G 型凝集素受體激酶，主要功能是參與抗稻瘟病[24]。OsLecRK 不僅參與調控水稻種子萌發(fā)，而且在抗病性方面也發(fā)揮著重要作用。敲除該基因可抑制抗病基因的表達，從而降低水稻對真菌和細菌病原菌及害蟲的抗性[25]。這些結果為進一步研究OsECH1 的功能提供了新思路。通過分析OsECH1 基因的功能，可增加對ECH 家族功能的理解，進一步分析OsECH1 蛋白及互作蛋白的功能，有助于探究抗?jié)摳€蟲侵染的作用機理。