徐晨帥, 王 芳,2, 李 穎, 馮晶晶, 郭仕偉, 白玉潔, 郭建峰,3

(1.中北大學 化學與化工學院, 山西 太原 030051; 2.山西省沙棘藥茶聯(lián)合創(chuàng)新研發(fā)基地, 山西 太原 030051; 3.中國露酒植物提取與健康因子山西省重點實驗室, 山西 太原 030051)

0 引 言

傳統(tǒng)的化學治療是目前治療各類癌癥的常見手段之一, 臨床應(yīng)用時會對正常組織和器官造成毒副作用, 因而限制了其臨床應(yīng)用[1]。藥物智能給藥系統(tǒng)(SDDS)因有緩釋控釋、靶向輸送藥物等優(yōu)點, 可增強小分子化療藥物對病灶部位的靶向效果。因此, 設(shè)計具有靶向性的藥物載體可以提高藥物對腫瘤細胞的療效, 減輕對身體的毒副作用[2-3]。

載藥體系在系統(tǒng)給藥到達病灶部位的過程中存在許多生物屏障[4-5], 在設(shè)計SDDS時應(yīng)克服這些生物屏障。九聚精氨酸(Poly-arginine-9, R9)是一類在生理條件的酸堿度下具有較高正電荷的細胞穿膜肽[6-8], 可以與生物大分子結(jié)合后穿過細胞膜進入細胞內(nèi)部, 具有較強的跨膜運輸能力[9-10], 將其與藥物載體連接, 設(shè)計出具有穿膜能力的載藥納米球, 可以提高腫瘤細胞對藥物的攝取濃度[11]。

天然高分子材料果膠(Pectin, PEC)結(jié)構(gòu)中富含-COOH、-OH等基團[12], 易進行化學修飾, 可以合成具有生物活性的衍生物[13], 應(yīng)用于藥物載體材料時, 有可緩釋控釋等優(yōu)點[14]。CaCO3具有pH敏感性, 以及良好的生物相容性和可降解性[15], 使用CaCO3調(diào)控多糖聚合物結(jié)晶制備微粒的過程不涉及有機溶劑和表面活性劑的使用[16-17], 以腫瘤組織獨特的微酸環(huán)境為特異識別靶點的載藥系統(tǒng)更具智能化, 可減少小分子藥物在正常細胞中的釋放[18]。但是, 這種靶向載體的缺點是無法穿過細胞膜, 制約了靶向載體的應(yīng)用。

本研究以PEC和R9為基質(zhì)材料, 經(jīng)酯化反應(yīng), 合成了具有穿膜效果的九聚精氨酸修飾的果膠衍生物(R9-PEC); 在R9-PEC溶液中, CaCO3自組裝形成一種具有pH響應(yīng)型的藥物載體(R9-PEC-NP), 負載藥物DOX(DOX@R9-PEC-NP)后, 實現(xiàn)了藥物載體的靶向遞送, 相較于受體靶向的載藥系統(tǒng), 本文設(shè)計的載藥體系不依賴于腫瘤細胞上的受體表達, 能夠更廣泛地應(yīng)用在腫瘤細胞中; 在載體表面修飾的具有穿膜效應(yīng)的R9, 可改善靶向載體無法穿過細胞膜的缺點, 構(gòu)建出同時具有靶向功能和穿膜潛力的載藥系統(tǒng), 以期提高抗癌藥效。DOX@R9-PEC-NP的合成路線如圖1 所示。

圖1 DOX@R9-PEC-NP的合成路線圖

1 實 驗

1.1 試劑與儀器

試劑: 果膠(PEC, 相對分子質(zhì)量Mr=1.5×105, 半乳糖醛酸含量≥74%), 上海易恩化學技術(shù)有限公司生產(chǎn); 九聚精氨酸(R9, 98%), 湖北強耀生物科技有限公司生產(chǎn); 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl), 分析純, 上海畢得醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn); 4-二甲氨基吡啶(DMAP), 分析純, 上海易恩化學技術(shù)有限公司生產(chǎn); 二甲基亞砜(DMSO)、阿霉素(DOX), 上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產(chǎn)。

儀器: 臺式高速離心機, TG-18W, 上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司; Zeta電位及激光粒度分析儀, Zeta Plus, 布魯克海文儀器公司; 紫外可見分光光度計, ReadMax 1900, 上海閃譜生物科技有限公司; 傅里葉紅外光譜儀(FTIR), Nicolet Nexus 470, 美國尼高力儀器公司; 冷凍干燥機, LGJ-10, 北京四環(huán)科學儀器廠; 元素分析儀, Elemantar: Vario EL cube, 德國Elementar公司; 掃描電子顯微鏡, Nova Nano 450, FEI公司; 熒光顯微鏡, Axio Vert A 1, 卡爾蔡司公司。

1.2 R9修飾PEC(R9-PEC)的制備

將50 mg R9和230 mg EDC·HCl溶于15 mL無水DMSO中, 室溫(25±2)℃下反應(yīng)6 h, 然后加入50 mg PEC和12 mg DMAP, 繼續(xù)在室溫(25±2)℃下反應(yīng)24 h后, 于透析袋(截留分子質(zhì)量為1.4×104g/cm3)中透析3 d, 將所得溶液凍干24 h, 得產(chǎn)物R9-PEC。

1.3 R9-PEC納米球(R9-PEC-NP)的制備

取10 mL去離子水, 加入10 mg R9-PEC, 磁力攪拌至充分溶解。取2 mL的CaCl2溶液(0.02 mol/L)加入R9-PEC溶液中, 繼續(xù)在室溫(25±2)℃下高速攪拌2 h后, 取2 mL Na2CO3溶液(0.02 mol/L)加至以上溶液, 繼續(xù)在室溫(25±2)℃下高速攪拌24 h后, 將混合溶液離心10 min, 取沉淀凍干, 得到產(chǎn)物R9-PEC-NP。

1.4 阿霉素(DOX)載藥量、包封率的測定

取10 mL 100 mg/L阿霉素水溶液, 加入10 mg R9-PEC-NP, 于搖床中震蕩12 h, 在4 000 r/min條件下離心10 min, 并用去離子水多次洗滌沉淀, 收集沉淀(DOX@R9-PEC-NP)及所有洗滌水, 從而可以得出藥物損失量。藥物的濃度由UV-Vis在波長480 nm處測得。測定包封率ω(EE)和載藥量ω(DL)。ω(EE)和ω(DL)的計算公式分別為

ω(EE)=[(M1-M2)/M1]×100%,

(1)

ω(DL)=[(M1-M2)/M3]×100%,

(2)

式中:M1為DOX的初始加入量, mg;M2為DOX的未裝載量, mg;M3為裝載DOX和納米球的總質(zhì)量, mg。

1.5 DOX的體外釋放率檢測

稱取2份10 mg DOX@R9-PEC-NP, 分別溶于裝有2 mL pH為5.0和7.4的磷酸鹽(PBS)緩沖液的透析袋中。將透析袋置于20 mL相應(yīng)pH的PBS緩沖液中, 在37 ℃水浴搖床中進行藥物在體外模擬環(huán)境中的釋放。利用UV-Vis在波長480 nm處測定吸光度, 根據(jù)DOX的標準曲線得出DOX的濃度, 計算得出DOX的累積釋放量。

1.6 表征方法

利用元素分析儀(EA, Elemantar: Vario EL cube)測定R9的取代度, 用傅里葉紅外光譜儀(FT-IR, Nicolet Nexus 470)對R9-PEC的化學結(jié)構(gòu)進行表征, 用Zeta電位與粒度分析儀(Zeta Plus)和掃描電子顯微鏡(SEM, Nova Nano 450)觀察R9-PEC-NP的形貌、尺寸和電位, 用紫外-可見分光光度計(UV-Vis, ReadMax 1900)研究R9-PEC-NP對DOX的裝載及釋放量。

2 結(jié)果與分析

2.1 R9-PEC的表征

2.1.1 EA的表征

聚合物PEC的羥基與R9的羧基可通過酯化反應(yīng)連接, 實現(xiàn)PEC與R9偶聯(lián)(R9-PEC), PEC和R9-PEC可通過N元素含量的差異, 確定兩者的成功偶聯(lián), 可利用元素分析儀測定兩者中N元素的質(zhì)量分數(shù), 實驗結(jié)果如表1 所示。由此間接地測定R9-PEC中R9的取代度(DS), 計算式公式為

表1 PEC和R9-PEC中C、H、N元素的質(zhì)量分數(shù)

DS=(n1-n2)×100%,

(3)

式中:n1為N元素的物質(zhì)的量, mol;n2為無水葡萄糖殘基的物質(zhì)的量, mol。

經(jīng)計算, R9-PEC中R9的取代度為7.01%。

2.1.2 FT-IR的表征

圖2 PEC、R9及R9-PEC的FT-IR圖譜

2.2 R9-PEC-NP的表征

2.2.1 SEM表征結(jié)果

R9-PEC-NP的SEM和粒徑分布如圖3 所示。由圖3 可以看出, 制備的微粒的粒徑分布在50 nm～350 nm之間, 平均粒徑為215 nm, 形態(tài)近似球形, 大小較均一。

(a)掃描電鏡圖

2.2.2 Zeta電位表征結(jié)果

R9-PEC-NP在不同pH條件下的Zeta電位如圖4 所示。由圖4 可以看出, R9-PEC-NP在pH>5的條件下帶負電, 有利于與帶正電的DOX通過靜電相互作用結(jié)合, 實現(xiàn)DOX的負載; 在pH<5的條件下帶正電, 有利于R9-PEC-NP在酸性條件下釋放DOX。

圖4 R9-PEC-NP在不同pH下的Zeta電位

2.3 DOX@R9-PEC-NP的表征

2.3.1 倒置熒光顯微鏡表征結(jié)果

用倒置熒光顯微鏡觀察DOX@R9-PEC-NP的載藥情況(見圖5)。因DOX的紅色熒光, 可在倒置熒光顯微鏡下觀察DOX@R9-PEC-NP中DOX的分布狀態(tài)。通過觀察可以看出, 部分DOX@R9-PEC-NP粒子呈現(xiàn)出了紅色的熒光, 證明了DOX被裝載于R9-PEC-NP中。

圖5 DOX@R9-PEC-NP在倒置熒光顯微鏡下的載藥情況

2.3.2 UV-Vis表征結(jié)果

藥物DOX、藥物載體R9-PEC-NP、載藥微粒DOX@R9-PEC-NP通過UV-Vis進行全波長掃描的實驗結(jié)果如圖6 所示。DOX在480 nm左右有吸收峰, 未裝載藥物的R9-PEC-NP在480 nm左右無吸收峰, 而負載DOX的載藥微粒DOX@R9-PEC-NP在480 nm左右有吸收峰, 說明DOX有效地載入到了R9-PEC-NP中。

圖6 R9-PEC-NP負載DOX前后的全波長掃描

2.4 R9-PEC-NP的載藥性能評估

DOX的ω(DL)和ω(EE), 分別為(8.15±0.12)%和(88.70±3.56)%, 高效的DOX裝載由于載藥微粒制備過程中形成的特殊“Egg-Box”結(jié)構(gòu)和PEC的-COO-與DOX的-NH+的靜電相互作用, 從而將DOX載入R9-PEC-NP。

2.5 R9-PEC-NP體外釋藥實驗

R9-PEC-NP在pH為5.0和7.4的PBS緩沖液中釋放DOX的情況如圖7 所示。DOX@R9-PEC-NP在酸性條件(pH為5.0)下的藥物釋放率比在正常條件(pH為7.4)下的藥物釋放率明顯增加, 并且在100 h后釋放了80%左右的DOX, 是pH為7.4條件下釋放藥物量的2倍。實驗結(jié)果表明DOX@R9-PEC-NP在酸性條件下有利于釋放DOX, 因為R9-PEC-NP在酸性條件下, 無機成分CaCO3的溶解度增加, 使納米球中的DOX迅速暴露, 有利于促進DOX的釋放, 所以在微酸性的腫瘤細胞環(huán)境下, 更有利于實現(xiàn)藥物的釋放, 其釋放速率也因pH不同而得到控制, 有利于達到緩釋給藥目的。因此, 在低pH的癌細胞環(huán)境中, 這種藥物釋放模式更有利于促進藥物的釋放, 以實現(xiàn)靶向功能。在到達腫瘤組織后, CaCO3的溶解可以使納米粒子釋放DOX, 實現(xiàn)靶向功能。本文制備的R9-PEC-NP與前期研究中的果膠載藥系統(tǒng)相比, 藥物的載藥量與包封率相近[19-20], 但相比受體靶向的載藥系統(tǒng), 本文設(shè)計的R9-PEC-NP不依賴于腫瘤細胞上的受體表達, 能夠更廣泛地應(yīng)用在腫瘤細胞中; 在載體表面修飾的細胞穿膜肽九聚精氨酸, 為實現(xiàn)藥物載體在細胞內(nèi)部釋放藥物提供了可能。

圖7 DOX@R9-PEC-NP在pH為7.4和5.0的PBS緩沖液中的藥物釋放曲線

3 結(jié) 論

本研究合成了具有穿膜效果及pH響應(yīng)型的R9-PEC-NP, 且微粒呈現(xiàn)較規(guī)則的球形, 大小較均一, 平均粒徑為215 nm, R9的取代度為7.01%, 賦予藥物載體穿膜能力, 載藥量和包封率分別為(8.15±0.12)%和(88.70±3.56)%, pH為5.0條件下的藥物釋放率明顯增加, 在100 h后釋放了80%左右的DOX, 是pH為7.4條件下釋放藥物量的2倍。DOX@R9-PEC-NP不僅可以緩控釋放DOX, 而且具有較好的pH響應(yīng)性, 同時, 因R9的連接賦予了藥物載體細胞穿膜的性能, 使其成為潛在的智能給藥系統(tǒng)載體材料。