孟鎮(zhèn)，張媛媛，田雨，郭新光，康忠媛，姬鈺，胡雯欽，陳家好*

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015；2.全國食品發(fā)酵標準化中心，北京 100015；3.中輕檢驗認證有限公司，北京 100015；4.湖南武陵酒有限公司，湖南常德 415001）

中國白酒釀造具有悠久的歷史，以獨特的風味和酒文化成為世界六大名酒之一[1]。白酒的發(fā)酵過程與其他烈酒有很大的不同，通常是由谷物，如高粱和大米等在固態(tài)條件下通過多種微生物發(fā)酵產(chǎn)生[2-3]。醬香型是中國白酒三大典型香型之一，主要產(chǎn)區(qū)包括貴州、四川、山東、湖南等，因其“無色（或微黃）透明，醬香突出，幽雅細膩，醇厚協(xié)調(diào)，回味悠長，空杯留香持久”的特點，深受國內(nèi)廣大消費者的喜愛，在國際市場上也屢獲好評[4]。醬香型白酒獨特的風味主要源于其獨特的釀造工藝，傳統(tǒng)醬香型白酒采用“四高一長一大一多”的生產(chǎn)工藝，即高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒和長期儲存[5]等工藝。高溫堆積工藝又稱“二次制曲”[6]，是醬香型白酒釀造過程中不可缺少的典型工藝之一，是指將糧食原料蒸煮糊化后，拌入高溫大曲，在窖池旁邊場地自然發(fā)酵的過程，期間可在空氣和環(huán)境中網(wǎng)羅、富集微生物，形成獨特的微生物群落結(jié)構，共同參與醅料糖化發(fā)酵，積累微生物酶類，形成風味前體物質(zhì)、產(chǎn)酯產(chǎn)香[7]。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，高溫堆積的時間、溫度和微生物群落結(jié)構等對醬香型白酒酒體風味質(zhì)量等具有較大的影響[8]。

近年來，隨著高通量測序技術的不斷發(fā)展，由于其分析微生物群落多樣性具有快速、通量高、更具全面性的優(yōu)勢[9-12]，已被廣泛用于白酒釀造過程中微生物群落結(jié)構的研究[13]。張春林等[14]采用高通量測序技術分析醬香型白酒二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅微生物群落結(jié)構組成情況，并探討微生物與理化指標的相關性；孫利林等[15]采用高通量測序技術解析醬香型白酒第四輪次釀造過程中高溫大曲、酒醅（堆積酒醅、窖內(nèi)酒醅）和窖泥的細菌多樣性，結(jié)果表明，堆積發(fā)酵微生物組成與發(fā)酵車間環(huán)境有關；王歡[16]采用高通量測序技術對醬香型白酒三輪、四輪、五輪次堆積發(fā)酵酒醅進行研究，共檢出17 個細菌門、5 個真菌門，其中14 個細菌屬是堆積酒醅中的重要菌屬；王歡等[17]采用高通量測序技術對醬香型白酒機械化釀造不同輪次堆積發(fā)酵細菌菌群結(jié)構多樣性進行分析，結(jié)果顯示，7 各輪次中共檢出14 個門，456 個屬，Caulobacter和Rhodococcus為機械化釀造過程中的特有菌屬，可能來源于機械設備和環(huán)境。

細菌是醬香型白酒堆積過程中生香和產(chǎn)酶的關鍵功能微生物，對酒體風味的形成有著重要的影響，不同地區(qū)、季節(jié)高溫堆積發(fā)酵過程中微生物的結(jié)構存在著明顯差異。本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術系統(tǒng)全面研究武陵醬香型白酒1—7 輪次高溫堆積酒醅樣品中細菌群落結(jié)構的分布特征和多樣性，有助于科學認識醬香白酒不同產(chǎn)區(qū)的獨特性以及不同釀造環(huán)境對白酒釀造的影響機制，為醬香型白酒高溫堆積發(fā)酵調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：取自湖北武陵酒有限公司（28.14°N，106.18°E）堆積發(fā)酵酒醅，采樣時間為2020 年9 月—2021 年7 月。堆積酒醅樣品從堆積1 d 開始至堆積結(jié)束（堆放的頂溫達到50 ℃）每天取樣。具體采樣方案如圖1 所示，每天分別從A（頂部）、B（中心）、C（中心層表面）、D（底層）、E（底層表面）同一位置進行取樣，取樣后將每一輪同一天A—E點采集的5 個樣品等質(zhì)量混合后置于無菌自封袋中，-80 ℃保存?zhèn)溆?。將同一輪次所采集的樣品等質(zhì)量混合均勻后作為該輪次高溫堆積樣品，最終，1—7 輪次共獲得7 個混合的樣品。

圖1 高溫堆積酒醅樣品采樣點

圖3 基于UniFrac 非加權的堆積酒醅樣品UPGMA 聚類

試劑及耗材：DNA 提取試劑盒，美國Omega BioTek 公司；AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒，美國AXYGEA 公司；rTaq DAN 聚合酶試劑盒，北京全式金生物技術有限公司；DNA marker，北京全式金生物技術有限公司；引物合成，生工生物工程（上海）股份有限公司。

儀器設備：ABI Gene AmpR 9700 型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀，美國ABI 公司；DYY-8C 型高壓電泳儀，北京六一儀器廠；JS-680C 凝膠成像儀，上海培清科技有限公司；Illumina MiSeq 測序平臺，上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司；QuantiFlourTM-ST 藍色熒光定量系統(tǒng)，美國Promega 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品DNA 提取及16S rDNA 測序分析

采用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit（D5625-01）進行樣品提取。完成基因組DNA 抽提后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA，用NanoDrop2000 進行濃度的檢測。使用細菌的16S rDNA 通用引物對樣品提取的DNA 進行PCR 擴增，16S rDNA V4，可變區(qū)引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAG‐CAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTA‐AT-3），每個樣本3 個重復，將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合后用2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒切膠回收PCR 產(chǎn)物，Tris-HCl 洗脫；2 %瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR 產(chǎn)物用QuantiFlourTM-ST 藍色熒光定量系統(tǒng)進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。再利用Illumina MiSeq 進行測序分析。

1.2.2 高通量測序

采用Illumina 高通量測序技術，基于Illumina MiSeq 測序平臺，分別對細菌V3—V4 高變區(qū)序列進行測序分析（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.2.3 數(shù)據(jù)及圖像處理

采用Microsoft Office Excel 2016 進行數(shù)據(jù)計算和分析?；贗llumina MiSeq 測序平臺，利用R 語言、Origin 作圖軟件、QIIME 軟件、SIMCA 14.1 繪制稀釋曲線、樣本層級聚類樹和豐度圖等。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序統(tǒng)計結(jié)果和多樣性指數(shù)分析

利用Illumina Miseq 高通量測序平臺對不同輪次高溫堆積酒醅樣本進行測序分析，由表1 可知，8個樣品中共得到細菌有效序列641505 條，平均每個樣本91644 條，樣品測序的覆蓋率均大于0.988，保證了測序數(shù)據(jù)質(zhì)量科學可靠。由圖2 稀釋性曲線可知，隨著采樣序列數(shù)的增加，樣品覆蓋度增加，當測序序列數(shù)＞45000 時，樣品OTU 稀釋曲線趨于平坦，說明各樣本的測序數(shù)據(jù)量合理，測序深度足夠，與實際生物信息相符合，可覆蓋樣本中絕大多數(shù)細菌多樣性信息。進一步說明本次測序結(jié)果質(zhì)量較高，科學可靠，本實驗測序結(jié)果可有效滿足后續(xù)對醬香型白酒高溫堆積酒醅樣品中微生物群落結(jié)構的研究。

表1 高溫堆積酒醅樣品高通量測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果

Alpha 多樣性可以反映微生物群落的豐富度和多樣性[18]。選取Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)對7 個輪次高溫堆積酒醅樣品的Alpha 多樣性進行分析，Shannon 指數(shù)用來估算樣品中微生物的多樣性，Shannon 值越大，說明群落多樣性越高；Chao1 指數(shù)是用Chao1 指數(shù)算法估計群落中含OTU 數(shù)目，在生態(tài)學中常用來估計物種總數(shù)，Chao1 值越大代表物種總數(shù)越多，表明群落的豐富度越高。由表1 可知，除4 輪次外，隨著輪次的增加，Shannon 指數(shù)整體呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，說明隨著輪次的增加細菌多樣性先增加后下降。Chao1 指數(shù)表明隨著輪次增加，物種的總數(shù)先上升后下降，且6—7 輪次物種總數(shù)遠低于前5 輪次的物種總數(shù)。

2.2 細菌群落結(jié)構組成差異

使用非加權組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA)對樣品進行聚類，綜合序列同源性、OTU 的豐度和組成，了解武陵醬香型白酒不同輪次高溫堆積酒醅樣品細菌群落結(jié)構差異。圖3 為1—7 輪次高溫堆積酒醅樣品的聚類結(jié)果，由圖3 可知，各輪次高溫堆積酒醅細菌群落結(jié)構組成具有明顯差異。7 個輪次高溫堆積酒醅樣品聚類分成兩支，1 輪次與6 輪次、7 輪次聚為一支；3 輪次、5 輪次、4 輪次和2 輪次聚為一支，說明1 輪次、6 輪次和7 輪次與3 輪次、5 輪次、4輪次和2 輪次中的細菌群落具有明顯差異。

2.3 細菌群落結(jié)構多樣性

2.3.1 門水平群落結(jié)構組成

通過USEARCH 將標簽分組成具有97 %相似性的可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），將每個OTU 與數(shù)據(jù)庫進行比對，選取置信度閾值，即相似度在97 %以上的序列進行物種分類，得到每個OTU 的分類水平，即門、綱、目、科、屬分類水平。

基于門水平細菌菌群結(jié)構見圖4。如圖4 所示，7 個輪次的高溫堆積酒醅樣品中共檢測出39 個門，一輪次30 個，二輪次12 個，3 輪次13 個，4 輪次12 個，5 輪次18 個，6 輪次17 個，7 輪次18 個。在各輪次堆積樣品中，變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）為各個輪次共有的優(yōu)勢細菌門（相對豐度≥1 %）。變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）在不同輪次高溫堆積酒醅樣品中相對豐度占89.51 %以上，變形菌門（Proteobacte‐ria）隨著輪次的增加相對豐度占比逐漸升高，在第3 輪次時其相對豐度已達到50.91%以上，并在后面幾個輪次中穩(wěn)定在85.36 %～72.37 %，成為主導的優(yōu)勢菌門。厚壁菌門（Firmicutes）隨著輪次增加相對豐度占比呈整體下降趨勢，1—3 輪次中相對豐度較高在38.60 %以上，4—6 輪次時相對豐度穩(wěn)定在10.07 %～16.01 %，7 輪次相對豐度又有明顯的增加，達到24.41%。研究資料表明，厚壁菌門和變形菌門是濃香型[19-21]、醬香型[17]、清香型[22]和芝麻香型[21]白酒釀造過程中的主要細菌門。黎瑤依[23]采用高通量測序分析方法對茅臺地區(qū)醬酒高溫堆積酒醅進行分析，認為放線菌門和厚壁菌門為主要的細菌門。由此可見，本研究結(jié)論與其他研究者的結(jié)論具有一致性。

圖4 不同輪次主要細菌菌群落結(jié)構（門水平）

2.3.2 屬水平群落結(jié)構組成

基于屬水平細菌菌群結(jié)構見圖5，如圖5 所示，7 輪次高溫堆積酒醅樣品中共檢測出756 個屬，1—7 輪次依次檢出293 個、108 個、167 個、170 個、291個、180 個和249 個屬，說明7 個輪次高溫堆積酒醅樣品中的主要細菌群落具有一定的差異。1 輪次高溫堆積發(fā)酵酒醅中的優(yōu)勢菌屬（＞1 %）有4 個，分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、小球菌（Pediococcus）、克羅彭施泰特氏菌屬（Kroppenstedtia）和醋桿菌（Acetobacter），總相對豐度為89.20 %；2 輪次有3 個，為乳桿菌屬（Lactobacillus）、醋桿菌（Acetobacter）和unclassified f__Bacteria，總相對豐度為98.32 %；3 輪次有4 個屬，為醋桿菌（Acetobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、unclassified f__Bacteria和勞爾氏菌屬（Ralstonia），總相對豐度為97.04 %；4 輪次有8 個屬，包括醋桿菌（Acetobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、unclassified_Lachnospiraceae、un‐classified f__Bacteria、克羅彭施泰特氏菌屬（Kroppenstedtia）、Muribaculaceae、Alistipes和Lachnospiraceae_NK4A136，總相對豐度為95.64 %；5 輪次有8個屬，包括醋桿菌（Acetobacter）、unclassified f__Bacteria、乳桿菌屬（Lactobacillus）、羅氏菌屬(Roseburia)、琥珀酸弧菌屬（Succinivibrio）、擬桿菌屬（Bacteroides）、Chloroplast和克羅彭施泰特氏菌屬（Kroppenstedtia），總相對豐度為85.06 %；6 輪次有6 個屬，包括醋桿菌（Acetobacter）、Massilia、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬（Lactobacillus）、克羅彭施泰特氏菌屬（Kroppenstedtia）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium），總相對豐度為90.86 %；7 輪次有8 個屬，包括醋桿菌（Acetobacter）、羅彭施泰特氏菌屬（Kroppenstedtia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、Ureibacillus、高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)和小球菌屬（Pediococcus），總相對豐度為91.24%。對各輪次優(yōu)勢菌屬進行分析發(fā)現(xiàn)，各輪次中共有的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）和醋桿菌（Acetobacter）。

圖5 不同輪次細菌群落結(jié)構（屬水平）

由于各輪次發(fā)酵酒醅的不斷蒸煮、發(fā)酵、糊化以及外界環(huán)境的改變，武陵醬香型白酒不同輪次高溫堆積酒醅樣品細菌群落結(jié)構多樣性明顯，具有一定的差異，但也具有一定的共性特征。在1—7 輪次中除1 輪次和5 輪次外，隨著輪次的增加，高溫堆積酒醅樣品中細菌群落菌屬逐漸增加；從3 輪次開始乳桿菌屬（Lactobacillus）相對豐度占比逐漸減少，醋桿菌屬（Acetobacter）逐漸增加，成為主導優(yōu)勢菌屬。1 輪次樣品的多樣性較高，且大于其他輪次，可能是由于1 輪次高溫堆積酒醅中除添加高溫大曲外，釀造環(huán)境中細菌種屬較高，額外添加的釀造高粱從外界帶入大量的微生物，使酒醅樣品中細菌群落結(jié)構更為豐富。5 輪次的微生物結(jié)構多樣性大于其他輪次，可能因為5 輪次時處盛夏時節(jié)，環(huán)境中溫度和濕度較高，有利于微生物的生長。

2.4 核心微生物群落及功能

參考Wolfe[24]和Hu[25]對核心微生物的定義，將平均相對豐度大于1 %，且至少出現(xiàn)在一個樣品以上的屬被定義為核心微生物屬。研究發(fā)現(xiàn)武陵醬香型白酒各輪次高溫堆積酒醅樣品中細菌平均大于1 %，且出現(xiàn)在1 個樣品以上的核心細菌屬有5個，分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、醋桿菌屬（Acetobacter）、芽孢桿菌屬(Bacillus)、克羅彭施泰特氏菌屬（Kroppenstedtia）和unclassified f__Bacte‐ria，分別占各輪次總豐度的86.75 %、98.36 %、95.044.73 %、89.99 %、77.73 %、80.38 %和83.69 %，相對豐度均大于77.73 %，說明這5 個菌屬一直穩(wěn)定存在于各輪次高溫堆積酒醅樣品中，是主導性菌群結(jié)構，因此將這5 個菌屬認定為武陵醬香型白酒核心微生物群落。

為進一步解析武陵醬香型白酒高溫堆積過程中各輪次的核心微生物情況，對上述核心微生物在各輪次分布進行了分析。乳桿菌屬（Lactobacillus）在1—3 輪次為優(yōu)勢菌屬，該菌屬在1 輪次相對豐度最高為83.16 %，2 輪次開始逐漸下降，到3 輪次時相對豐度降至36.47 %，4—7 輪次相對豐度較為穩(wěn)定，保持在2.55 %～3.81 %之間。結(jié)果與王歡等[17]在醬香型白酒機械化釀造7 輪次高溫堆積酒醅中細菌群落結(jié)構研究較為一致。相關研究表明，乳桿菌屬（Lactobacillus）在多種香型白酒發(fā)酵過程都被檢出過，是中國白酒發(fā)酵過程中的主要功能細菌屬，其在白酒釀造過程中主要參與調(diào)控，可維持微生物間結(jié)構平衡，同時在發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機酸類物質(zhì)，為白酒中風味物質(zhì)的合成提供前體物，影響酒體風格的形成[26]。醋桿菌屬（Acetobacter）在3—7 輪次為優(yōu)勢菌屬，該菌屬在1輪次相對豐度為1.02 %，2 輪次時上升至27.29 %，隨后逐漸上升，4 輪次時達到最大值為84.79 %，5輪、6 輪、7 輪次后逐漸下降，但相對豐度變化不大，在66.36 %～73.72 %。該菌屬是白酒釀造過程中重要的微生物，能夠在白酒發(fā)酵過程中將乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸，為白酒中風味物質(zhì)的合成提供前體物質(zhì)[23]。王歡等[16]對醬香型白酒3 輪、4 輪、5 輪次堆積發(fā)酵酒醅樣品的研究發(fā)現(xiàn)醋桿菌屬（Acetobacter）為3 輪、4 輪、5 輪次堆積發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌屬。

芽孢桿菌屬（Bacillus）在1—7 輪次中相對豐度較低，研究發(fā)現(xiàn)，該菌屬是清香型、醬香型白酒發(fā)酵過程的共有優(yōu)勢細菌屬[27]，能夠代謝產(chǎn)生乙偶姻及4-甲基吡嗪等白酒中重要的風味物質(zhì)，對白酒的風味物質(zhì)有重要貢獻[28]?？肆_彭施泰特氏菌屬（Kroppenstedtia）為1 輪、4 輪、5 輪、6 輪、7 輪次的優(yōu)勢菌屬，研究表明，其為醬香型白酒[29]和芝麻香型白酒[30]大曲中優(yōu)勢菌屬，但其在白酒釀造過程中的主要功能及作用目前尚不明確。

3 結(jié)論

本研究采用Illumina MiSeq 高通量測序技術對武陵醬香型白酒1—7 輪次高溫堆積酒醅樣品細菌群落結(jié)構特征進行分析，7 個輪次中共檢出39 個門和756 個屬。門水平上，各輪次共有的優(yōu)勢菌門（相對豐度≥1 %）為變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）；屬水平上，武陵醬香型白酒7個輪次高溫堆積酒醅樣品中細菌群落結(jié)構具有多樣性特點，同時有一致性和差異性；細菌平均相對豐度大于1 %，且出現(xiàn)在1 個樣品以上的核心細菌屬有5 個，分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、醋桿菌屬（Acetobacter）、芽孢桿菌屬(Bacillus)、克羅彭施泰特氏菌屬（Kroppenstedtia）和unclassified f__Bac‐teria；各輪次共有的優(yōu)勢菌屬（相對豐度≥1%）為乳桿菌屬（Lactobacillus）和醋桿菌（Acetobacter）。本研究結(jié)果揭示了武陵醬香型白酒1—7 輪次高溫堆積酒醅樣品中細菌群落結(jié)構與特征，為醬香型白酒高溫堆積釀造過程中群落結(jié)構變化規(guī)律解析及精準調(diào)控提供了理論依據(jù)。