王 聰,葉小梅,奚永蘭,杜 靜,孔祥平,王 莉,韓 挺,朱 飛,張應(yīng)鵬

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院畜牧研究所,循環(huán)農(nóng)業(yè)研究中心,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點實驗室,南京 210014)

黑水虻是一種新型資源環(huán)境昆蟲,其幼蟲階段可以取食餐廚垃圾、蔬菜殘體和畜禽糞便等各種有機廢棄物(Chenetal., 2019; Mazzaetal., 2020)。研究表明黑水虻幼蟲對于畜禽糞便、奶牛糞和豬糞的減量率可以達到50%～65%(Dieneretal., 2009; Luoetal., 2019; Matosetal., 2021)。黑水虻幼蟲處理有機廢棄物過程中,可以降低臭氣的排放以及抑制有害微生物生長,比如大腸桿菌Escherichiacoli和沙門氏菌salmonella等(Liuetal., 2017; Schiavoneetal., 2019)。并且幼蟲可以在富含重金屬條件下正常完成生命周期(Lietal., 2018)。同時,黑水虻幼蟲粗蛋白含量為43%～47%,粗脂肪含量為30%～34%,可以廣泛應(yīng)用于家禽、水產(chǎn)飼料的生產(chǎn)(Barragan-Fonsecaetal., 2019; Kawasakietal., 2019)。

國內(nèi)外已經(jīng)對黑水虻幼蟲處理廢棄物過程中的基本生理生化特征進行大量的研究。蛋白酶、脂肪酶以及淀粉酶等消化酶在幼蟲處理廢棄物過程中發(fā)揮重要作用(Bonellietal., 2019; Guerreiroetal., 2020)。但消化酶活性和廢棄物類型導(dǎo)致黑水虻幼蟲對廢棄物的轉(zhuǎn)化率、減量率和其生長性能仍存在差異(Beskinetal., 2018; Giannettoetal., 2020; Nikkhahetal., 2021)。因此,本研究目的是通過測定黑水虻幼蟲不同生長時期養(yǎng)分組成情況和消化酶活性,探索其生長過程中養(yǎng)分需求以及和消化酶活性變化之間的規(guī)律,為工廠化黑水虻養(yǎng)殖提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實驗用蟲養(yǎng)殖

黑水虻新鮮蟲卵孵化于恒溫恒濕箱中(溫度28℃、相對濕度70%),并用65%含水率的麥麩飼養(yǎng)至第5天作為實驗用蟲。

1.2 實驗材料獲取

餐廚垃圾從江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)院食堂獲取,充分粉碎混勻,含水率為75%。前期養(yǎng)分測定結(jié)果:餐廚垃圾的粗蛋白含量為28.34%,粗脂肪含量為36.79%,總糖為23.72%。

1.3 實驗設(shè)計

每個處理組挑選200頭5日齡的黑水虻幼蟲置于飼養(yǎng)盒內(nèi)[長(20 cm)×寬(10 cm)×高(6 cm)],根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果,每個飼養(yǎng)盒內(nèi)均勻放入200 g的餐廚垃圾供黑水虻幼蟲自由取食。每日隨機挑選3組,將所有幼蟲與物料進行分離,并用無菌水洗凈,濾紙吸干水分后于-70℃保存用于后續(xù)指標測定,共30個處理組。當(dāng)90%的幼蟲變成預(yù)蛹時,實驗停止。本次實驗的環(huán)境溫度為30℃,相對濕度為70%。

1.4 養(yǎng)分指標測定

主要測定實驗樣品中粗脂肪、粗蛋白與總糖的含量。粗蛋白的測定方法為采取凱氏定氮法(GB 5009.5-2010),粗脂肪測定方法為索氏提取法(GB/T 5009.6-2003),總糖測定方法參照(GB 5009.7-2016)。

1.5 消化酶活性測定

每個處理挑選生長一致黑水虻幼蟲10頭,用無菌水將蟲體表面洗凈,濾紙擦干。迅速在冰盒中取出黑水虻幼蟲腸道,加入預(yù)冷的200 mM磷酸鹽緩沖液,用電動研磨棒在冰上充分勻漿。將勻漿等量分裝于1.5 mL離心管中,于高速離心機上4℃,10 000 r/min,離心30 min,移液槍吸取上清液為粗酶液,分裝用于酶活性測定。

蛋白酶測定:用福林-酚試劑法測定酪氨酸的生成。酶活力定義:在一定條件下,1 min酶解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為一個酶活力單位,用U/mL表示。

淀粉酶測定:采用碘-淀粉比色法。酶活力定義:在一定條件下,在紫外分光光度計660 nm處測量吸光值,1 mL酶粗液每分鐘分解產(chǎn)生酪氨酸對應(yīng)吸光值增大0.001,定義為1個淀粉酶活力單位,用U/mL表示。

（3）了解各水域錨舶船及小船航行習(xí)慣，熟悉港區(qū)各水域淺灘、礁石、礙航物及岸線情況，以便惡劣天氣來臨時心中有數(shù)。在惡劣天氣來臨時，盡量避免通過通航密度大的水域或在通航密度大的水域停留。

脂肪酶測定:使用0.01 M對硝基苯棕櫚酸酯并用分光光度計在610 nm處測量并與對硝基苯酚標準曲線進行比較(Winkler &Stuckmann, 1979)。脂肪酶活性用U/mL進行表示。

1.6 計算與數(shù)據(jù)分析

本研究中使用的公式如下:廢棄物減量率(%)=(W1-W2/W1)×100,其中W1為初始餐廚垃圾重量(DM),W2為殘渣重量(DM);生物轉(zhuǎn)化率(%)=總幼蟲生物量(DM)/攝入食物的重量(DM)×100。

用Microsoft Excel 2016進行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)之間差異性分析用軟件SPSS 24.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)進行處理。結(jié)果通過單因素方差分析(ANOVA)進行分析,使用Tukey’s HSD進行事后檢驗,以比較不同處理方法之間的顯著性(P)。如P<0.05認為處理間存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長階段黑水虻幼蟲的養(yǎng)分組成含量變化規(guī)律

不同生長階段的黑水虻幼蟲體內(nèi)的粗蛋白、粗脂肪以及總糖含量均呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。黑水虻幼蟲初始粗蛋白含量約為53.15%,逐漸下降至36.54%(表1)。老熟幼蟲以及預(yù)蛹階段,蟲體粗蛋白含量約為40%(表1)。粗脂肪含量隨著幼蟲齡期增加而增長,其幼蟲體內(nèi)粗脂肪含量從7.66%上升至30.58%。黑水虻幼蟲總糖含量呈現(xiàn)的變化規(guī)律與粗蛋白變化規(guī)律相反,即先上升再下降?？赡芤驗樯L后期,黑水虻幼蟲需要分解自身大量的糖原從而滿足后期變態(tài)發(fā)育的營養(yǎng)需求。

表1 黑水虻幼蟲不同生長階段養(yǎng)分組成含量

2.2 黑水虻幼蟲餐廚垃圾轉(zhuǎn)化效率

餐廚垃圾經(jīng)過黑水虻幼蟲處理后,殘渣中粗蛋白、粗脂肪與總糖含量分別為31.03%、13.15%和12.78%(表2)。黑水虻幼蟲對于原料中養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化率較低。蛋白質(zhì)、油脂以及糖類的轉(zhuǎn)化率分別為38.41%、29.63%和24.48%(表2)。幼蟲對餐廚垃圾中養(yǎng)分利用率低的原因是可能轉(zhuǎn)化過程中可釋放出氨氣,導(dǎo)致N元素流失,影響微生物的生理活動。通過黑水虻轉(zhuǎn)化餐廚垃圾過程中物料的測定,幼蟲對餐廚垃圾減量率為78.13%,而生物轉(zhuǎn)化率僅為23.09%(表3)。

表2 黑水虻幼蟲轉(zhuǎn)化餐廚垃圾養(yǎng)分效率

表3 黑水虻幼蟲處理餐廚垃圾的生產(chǎn)性能

2.3 黑水虻不同生長階段消化酶活性變化的規(guī)律與相關(guān)性分析

對不同生長階段黑水虻幼蟲的消化酶活性進行測定。蛋白酶、淀粉酶以及脂肪酶均呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。第0～6天,黑水虻幼蟲體內(nèi)蛋白酶活性迅速上升至活性高峰(202.36 U/mL)。隨著黑水虻幼蟲齡期增加,其體內(nèi)蛋白活性逐漸降低(圖1)。黑水虻幼蟲在生長前期需要分解大量蛋白質(zhì)滿足自身生長發(fā)育的需求。隨著齡期增加,黑水虻通過分解糖類、淀粉類物質(zhì)為后期變態(tài)發(fā)育儲備能量。因此,在第0～5天,幼蟲體內(nèi)淀粉酶活性緩慢增加,而當(dāng)?shù)?～8天,淀粉酶活性迅速上升至605.21 U/mL(圖2)。黑水虻幼蟲脂肪酶活性在處理餐廚垃圾過程的前期保持增長趨勢(圖3)。而隨著齡期增加,黑水虻幼蟲停止取食,導(dǎo)致脂肪酶、淀粉酶活性后期開始降低。

通過對黑水虻幼蟲體內(nèi)養(yǎng)分組成與消化酶活性變化規(guī)律的相關(guān)性分析(圖4～圖6),黑水虻體內(nèi)蛋白含量與蛋白酶沒有明顯相關(guān)性,因為幼蟲可通過分解其它物質(zhì)而合成蛋白。而幼蟲總糖含量、粗脂肪含量分別與淀粉酶,脂肪酶均存在相關(guān)性。

圖1 黑水虻蛋白酶活性與處理餐廚垃圾時間的關(guān)系Fig.1 Relationship between the protease activity of BSFL and the time to dispose of kitchen waste

圖2 黑水虻淀粉酶活性與處理餐廚垃圾時間的關(guān)系Fig.2 Relationship between the amylase activity of BSFL and the time to dispose of kitchen waste

圖3 黑水虻脂肪酶活性與處理餐廚垃圾時間的關(guān)系Fig.3 Relationship between the lipase activity of BSFL and the time to dispose of kitchen waste

圖4 黑水虻蛋白酶與粗蛋白含量變化相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of protease and crude protein content of BSFL

圖5 黑水虻淀粉酶與總糖含量變化相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis of amylase and total sugar content of BSFL

圖6 黑水虻脂肪酶與粗脂肪含量變化相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis of lipase and crude fat content of BSFL

3 結(jié)論與討論

黑水虻幼蟲是一種雜食性昆蟲,可以處理餐廚垃圾、畜禽糞便等有機廢棄物,因此利用黑水虻處理有機廢棄物是一種新型綠色處理方式(Boreletal., 2021)。研究表明,中腸是黑水虻消化吸收的主要場所,其中主要的消化酶為蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等(Chenetal., 2010; Schiavoneetal., 2019)。研究表明消化酶活性變化的規(guī)律是昆蟲對于不同營養(yǎng)需求的直接反應(yīng)(Leeetal., 2014)。目前對黑水虻體內(nèi)消化酶變化規(guī)律與其養(yǎng)分需求之間的聯(lián)系的研究較少(Chenetal., 2010; Oonincxetal., 2015)。因此,本研究主要通過幼蟲飼喂實驗,明確黑水虻幼蟲養(yǎng)分組成與消化酶活性變化的關(guān)系。

通過對實驗樣品測定,幼蟲粗蛋白在第15天時約占40.73%。本研究結(jié)果與前人研究黑水虻幼蟲飼喂實驗的研究結(jié)果一致,黑水虻幼蟲階段的粗蛋白在34%～42%之間(Dieneretal., 2009; Mazzaetal., 2020)。用豬糞和家禽糞便飼養(yǎng)的黑水虻的蛋白質(zhì)含量分別約為43.2%和41%(Nguyenetal., 2015; Ragossnig &Ragossnig, 2021),利用食品加工的副產(chǎn)物飼養(yǎng)黑水虻幼蟲,可獲得38%～46.3%的粗蛋白(Ritika, 2019; Tanetal., 2021)。蛋白質(zhì)是昆蟲主要營養(yǎng)物質(zhì)之一,飼料中蛋白質(zhì)含量不足會導(dǎo)致昆蟲前期發(fā)育異常。蛋白酶廣泛存在于生物體內(nèi),參與昆蟲主要的生理生化過程,有助于促進對食物的分解和吸收(Santanaetal., 2017)。黑水虻幼蟲處理餐廚垃圾過程中,蛋白酶活性迅速上升,在生長初期時達到高峰,然后逐漸下降。黑水虻在發(fā)育前期通過蛋白酶將蛋白質(zhì)水解成氨基酸,由蟲體吸收,循環(huán)并再次合成蛋白質(zhì),并且蛋白質(zhì)有助于提高幼蟲生長前期的免疫力(Santanaetal., 2017; Zhengetal., 2021)。

本研究結(jié)果顯示淀粉酶呈現(xiàn)先緩慢上升再迅速上升,最后下降的變化規(guī)律。淀粉酶能促進黑水虻幼蟲對能源性物質(zhì)的分解與儲存,并且當(dāng)物料中的蛋白質(zhì)或者氨基酸含量不足時,淀粉可以通過一系列代謝反應(yīng),合成飼料中所缺乏的蛋白質(zhì)或者氨基酸(Guerreiroetal., 2020)。本研究結(jié)果與已報道文獻相似,即黑水虻生長中后期的淀粉酶活性高于生長前期(Santanaetal., 2017)。昆蟲幼蟲在中后期增加淀粉的攝入主要作為變態(tài)發(fā)育期的能量來源,而幼蟲階段對淀粉的攝取也對成蟲的繁殖起著至關(guān)重要的作用(Greggetal., 1990)。

黑水虻體內(nèi)粗脂肪的積累與飼養(yǎng)物料類型有關(guān)系。黑水虻幼蟲取食豬糞后,其粗脂肪含量為28%,利用家禽糞便飼養(yǎng)的幼蟲粗脂肪含量為34.8%(Beskinetal., 2018; Chenetal., 2019),利用食品加工副產(chǎn)物飼養(yǎng)的粗脂肪含量約為42% (Chengetal., 2017)。脂肪作為昆蟲體內(nèi)重要儲能形式之一,也是蟲體細胞膜重要構(gòu)成物質(zhì),以及激素合成的前體物質(zhì)。餐廚垃圾轉(zhuǎn)化過程中,因為物料中油脂含量過高,所以黑水虻幼蟲生長前期脂肪酶保持較高的活性(Giannettoetal., 2020),并且黑水虻幼蟲發(fā)育中后期,脂肪酶將脂質(zhì)分解成脂肪酸,為變態(tài)發(fā)育以及成蟲羽化提供能量基礎(chǔ)(Colmanetal., 2012)。餐廚垃圾轉(zhuǎn)化過程中,黑水虻幼蟲分解過量淀粉物質(zhì)轉(zhuǎn)化為脂肪等物質(zhì)儲存于體內(nèi),為后期變態(tài)發(fā)育提供能量。因此通過對不同生長階段幼蟲養(yǎng)分含量測定,其粗脂肪含量一直保持上升規(guī)律。而黑水虻預(yù)蛹階段,幼蟲停止取食從而導(dǎo)致脂肪酶活性下降。

由于廢物種類不同,黑水虻幼蟲消化有機廢物的生理過程也不同。因此,本研究可以為黑水虻工廠化養(yǎng)殖提供理論指導(dǎo),以及明確15日齡黑水虻幼蟲可以作為水產(chǎn)飼料的最佳收獲時間。