王天寶,邱園妹,孫巧玲,楊長生,Aqai Kalan Hassanyar,黃景南,李志國,蘇松坤

(福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院),福州 350002)

蜜蜂是一種真社會性昆蟲,它們的神經(jīng)生理指標可以被記錄,相關(guān)行為可以直接觀察,被認為是研究學(xué)習(xí)與記憶的良好模式生物(Giurfaetal., 2012; Lafonetal., 2021)。研究表明,蜜蜂能夠在實驗室條件下的3D虛擬現(xiàn)實(virtual reality, VR)環(huán)境中學(xué)會根據(jù)顏色差異區(qū)分獎勵和懲罰的刺激(Lafonetal., 2021)。在氣味學(xué)習(xí)訓(xùn)練中,蜜蜂能夠?qū)馕杜c糖水獎勵聯(lián)系起來,表現(xiàn)出很強的聯(lián)想學(xué)習(xí)能力,這在蜜蜂外出覓食中發(fā)揮著重要作用(Giurfa, 2007)。

miRNA是一種長度大約為21～22 nt的非編碼RNA,是一類在轉(zhuǎn)錄后水平對mRNA進行負調(diào)控的關(guān)鍵調(diào)控因子(Bartel, 2018)。與mRNA一樣,miRNA的表達模式在空間和時間上都是特定的,每個miRNA可以靶向數(shù)十到數(shù)百個mRNA,并可能因此調(diào)節(jié)多個基因網(wǎng)絡(luò)(Friedmanetal., 2009; Bartel, 2018)。因此,在miRNA表達相對較小的情況下,就可以實現(xiàn)復(fù)雜行為的基因調(diào)控。

越來越多的證據(jù)表明,miRNA參與了昆蟲的神經(jīng)調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn),miR-132和miR-125影響小鼠大腦的神經(jīng)可塑性和記憶(Edbaueretal., 2010)。Rajasethupy等人在海兔中發(fā)現(xiàn)170個miRNA,并在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用(Rajasethupathyetal., 2009)。Busto等人通過RNA干擾技術(shù),發(fā)現(xiàn)miRNA在果蠅嗅覺學(xué)習(xí)與記憶上發(fā)揮重要作用(Bustoetal., 2015)。據(jù)報道,miRNA參與了蜜蜂的學(xué)習(xí)與記憶過程。研究發(fā)現(xiàn),miR-276和miR-1000在蜜蜂腦部高表達,并通過原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)其富集在蘑菇體的keyon細胞中,有研究報道,蘑菇體是昆蟲大腦的一個高級整合中心,蘑菇體外源性神經(jīng)元(Mushroom body extrinsic neurons,MB Ens)可能參與調(diào)控蜜蜂的行為(Haehneletal., 2010; Fillaetal., 2015; Paffhausenetal., 2020),從而推測miR-276和miR-1000參與調(diào)控了蜜蜂的神經(jīng)功能(Sayaka Hori, 2011)。此外,Cristino等人通過嗅覺學(xué)習(xí)實驗發(fā)現(xiàn)miR-932的抑制會損害長期記憶的形成,miR-932通過靶向肌動蛋白,調(diào)控蜜蜂的記憶(Cristinoetal., 2014)。Qin等人通過迷宮訓(xùn)練實驗,也發(fā)現(xiàn)miRNA可能在蜜蜂的學(xué)習(xí)和記憶過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Qinetal., 2014)。這些研究表明,蜜蜂學(xué)習(xí)行為的變化會伴隨著腦部miRNA的表達變化,miRNA在一定程度上參與了蜜蜂的學(xué)習(xí)與記憶過程。雖然研究人員對miRNA研究較多,但對于其如何調(diào)控蜜蜂學(xué)習(xí)行為的確切機制仍知之甚少。

在本實驗室團隊之前的研究中,通過利用small RNA-seq(sRNA-seq)技術(shù)對12日齡學(xué)會與學(xué)不會的西方蜜蜂Apismellifera個體腦部進行高通量測序,篩選出14個差異表達miRNA,其中ame-miR-124-3p在學(xué)會的蜜蜂組中表達上調(diào),根據(jù)以往文獻報道ame-miR-124-3p可能是西方蜜蜂學(xué)習(xí)的關(guān)鍵調(diào)控因子(Qinetal., 2014; Michelyetal., 2017),但ame-miR-124-3p對西方蜜蜂氣味學(xué)習(xí)的作用沒有得到直接的實驗驗證,其分子機制尚不明確。為了繼續(xù)研究ame-miR-124-3p在調(diào)控蜜蜂氣味學(xué)習(xí)的作用,在本試驗中發(fā)現(xiàn),ame-miR-124-3p的表達抑制降低了蜜蜂的學(xué)習(xí)比例,ame-miR-124-3p的過表達則能增強蜜蜂的氣味學(xué)習(xí)能力,這表明ame-miR-124-3p在調(diào)控蜜蜂氣味學(xué)習(xí)中起著重要作用。

1 材料與方法

1.1 供試蜜蜂

西方蜜蜂來自福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)實驗蜂場(福建,福州)。從3群健康蜂群中提取3張成熟子脾,置于3個干凈的限王產(chǎn)卵框中,并放在恒溫培養(yǎng)箱(溫度34℃,相對濕度70%)中培養(yǎng)。每天用不同顏色的油漆筆標記剛出房的蜜蜂工蜂,記為1日齡,每天標記的蜜蜂大概在400～500頭,將標記好的蜜蜂放入原蜂群。

1.2 干擾序列設(shè)計

根據(jù)ame-miR-124-3p的成熟體序列,委托上海吉瑪制藥有限公司(GenePharma)設(shè)計合成ame-miR-124-3p的抑制劑(ame-miR-124-3p inhibitor)、ame-miR-124-3p抑制劑的無意義序列(ame-miR-124-3p inhibitor-NC)、ame-miR-124-3p的模擬物(ame-miR-124-3p mimics)和ame-miR-124-3p模擬物的無意義序列(ame-miR-124-3p mimics-NC)(表1)。

表1 干擾序列及相關(guān)信息

1.3 蜜蜂的固定與合成序列的飼喂

待到蜜蜂11日齡時,用軟鑷子抓取并放入透氣的玻璃瓶中,放置冰上凍暈,用膠帶將蜜蜂快速固定于特制的銅管中,使其吻部可自由活動而露出的頭部不可隨意轉(zhuǎn)動。將固定好的蜜蜂喂食10 μL含每種合成試劑6.6 μg的50%蔗糖溶液(Liuetal., 2017),所有的蜜蜂在處理后都用50%蔗糖溶液喂飽,置于黑暗培養(yǎng)箱中(28℃,相對濕度70%),24 h后進行氣味聯(lián)想性學(xué)習(xí)訓(xùn)練(Matsumotoetal., 2012)。

1.4 氣味聯(lián)想學(xué)習(xí)訓(xùn)練

氣味聯(lián)想性學(xué)習(xí)實驗的訓(xùn)練方式參照Matsumoto等創(chuàng)建的PER標準方法(Matsumotoetal., 2012)。實驗前用30%糖水觸碰蜜蜂觸角,只有表現(xiàn)出伸吻反應(yīng)的蜜蜂才被用于實驗。訓(xùn)練時采用A、B(A,1-壬醇;B,正己醇)兩種不同的氣味,A氣味為條件刺激(Conditional Stimuli,CS),糖水獎勵為非條件刺激(Unconditional Stimuli,US),A氣味與糖水獎勵配對訓(xùn)練(CS+),B氣味作為對照氣味,不與糖水獎勵相配對(CS-)。為了排除順序?qū)嶒灥母蓴_,每組一半的蜜蜂按照ABBAAB的順序,另一半的蜜蜂按照BAABBA的順序,對每頭蜜蜂分別進行3次聯(lián)想性學(xué)習(xí)和非聯(lián)想性學(xué)習(xí)。聯(lián)想性學(xué)習(xí)的訓(xùn)練時間是42 s。先將蜜蜂靜置10 s,再單獨通入5 s的空氣;隨后通入4 s的A氣味給予條件刺激,同時使用30%糖水觸碰觸角,使其伸吻,持續(xù)時間為2 s;而后讓蜜蜂取食糖水1 s,最后再通空氣20 s。非聯(lián)想性學(xué)習(xí)訓(xùn)練是通B氣味時不給予糖水獎勵,每次聯(lián)想性學(xué)習(xí)和非聯(lián)想性學(xué)習(xí)訓(xùn)練的時間間隔為10 min。實驗重復(fù)進行5次,每組至少有50頭蜜蜂接受氣味學(xué)習(xí)訓(xùn)練。本研究認為只有在蜜蜂觸角接觸到氣味時,蜜蜂立即伸吻并表現(xiàn)出強烈攝食動作才算學(xué)會CS關(guān)聯(lián)US,記為“1”,未表現(xiàn)出伸吻反應(yīng)則記為“0”,通過蜜蜂對氣味的伸吻反應(yīng)率來評估3次實驗中蜜蜂的學(xué)習(xí)情況。訓(xùn)練結(jié)束后立即用液氮將蜜蜂凍斃,獲取蜜蜂頭部并儲存于-80℃超低溫冰箱,用于后續(xù)腦部解剖。

1.5 qRT-PCR檢測相對表達量

低溫下解剖蜜蜂腦部,放入RNA-Free EP管中,每管3頭,每組設(shè)置12個生物學(xué)重復(fù)。利用miRNA Design軟件(Vazyme公司,中國)設(shè)計特異性的Stem-loop引物、上游引物和通用的反向引物,選擇R為通用引物(表2),U6作為內(nèi)參基因(Liuetal., 2019)。委托上海生工生物工程有限公司合成引物。通過磁珠法,利用LabServ Universal RNA kit分別提取處理組和對照組總RNA,按miRNA 1stStrand cDNA Synthesis Kit (by stem-loop)(MR101-01/02)(Vazyme公司,中國)說明書進行總RNA的莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為10 μL,5×g DNA Wiper Mix:1 μL,總RNA:v μL,Stem-loop primer(2 μM):1 μL,10 × RT Mix:1 μL,Hiscript II Enzyme Mix:1 μL,RNase Free ddH2O:6-v μL;反轉(zhuǎn)錄條件為:25℃ 5 min,50℃ 15 min,85℃ 5 min,得到的cDNA作為模板進行qPCR。qPCR反應(yīng)體系為10 μL:SYBR Green Dye 5 μL,特異性上游引物0.2 μL,通用下游引物0.2 μL,cDNA模板1 μL,RNA-Free H2O 3.6 μL。反應(yīng)條件為:95℃ 5 min,95℃ 10 s,60℃ 30 s,共40個循環(huán),熔解曲線反應(yīng)條件為:95℃ 15 s,60℃ 1 min。最后用2-ΔCT的值來計算相對表達量(Ishiguro, 1992)。

表2 用于熒光實時定量 PCR的引物序列

1.6 統(tǒng)計分析

利用SPSS 16.0軟件對PER和qPCR數(shù)據(jù)進行t檢驗,GraphPad Prism 5.0軟件進行結(jié)果的繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ame-miR-124-3p抑制與過表達對氣味學(xué)習(xí)的影響

ame-miR-124-3p的抑制組與ame-miR-124-3p抑制的對照組的有效樣本數(shù)分別為54頭和62頭,與ame-miR-124 inhibitor-NC組(80.47%)相比,飼喂ame-miR-124 inhibitor組的蜜蜂經(jīng)過3次訓(xùn)練后學(xué)習(xí)比例(63.17%)顯著下降(t=3.081,P<0.05)(圖1),這表明ame-miR-124-3p的抑制能夠減弱蜜蜂的氣味學(xué)習(xí)行為。ame-miR-124-3p的過表達組與ame-miR-124-3p過表達的對照組的有效樣本數(shù)分別為62頭和65頭,與ame-miR-124-3p過表達對照組(67.73%)相比,飼喂ame-miR-124-3p過表達組的蜜蜂學(xué)習(xí)比例(84.39%)顯著上升(t=2.771,P<0.05)(圖2),說明ame-miR-124-3p過表達能夠增強蜜蜂的氣味學(xué)習(xí)行為,這表明ame-miR-124-3p可能參與氣味學(xué)習(xí)的正向調(diào)控。

圖1 ame-miR-124-3p抑制對西方蜜蜂氣味學(xué)習(xí)的影響Fig.1 Effect of inhibition of ame-miR-124-3p on odor learning in Apis mellifera注:*表示在第3次學(xué)習(xí)試驗中ame-miR-124抑制組與ame-miR-124抑制對照組中的伸吻反應(yīng)率經(jīng)t檢驗顯著性差異(P<0.05)。Note: Single asterisk indicated that proboscis extension response rates were significantly different by t-test between ame-miR-124-3p inhibitor and ame-miR-124-3p inhibitor-NC from the 3rd learning experiments.

2.2 qRT-PCR驗證氣味學(xué)習(xí)后蜜蜂腦部ame-miR-124的相對表達水平

與ame-miR-124-3p抑制劑的無意義序列組相比,飼喂ame-miR-124抑制劑組蜜蜂腦部ame-miR-124相對表達量水平顯著降低(t=2.655,P<0.05)而與ame-miR-124-3p模擬物的無意義序列組相比,ame-miR-124-3p模擬物組蜜蜂腦部的ame-miR-124-3p相對表達量水平顯著升高(t=2.114,P<0.05)(圖3),這揭示了ame-miR-124-3p在調(diào)控蜜蜂的氣味學(xué)習(xí)中起著重要作用。

圖2 ame-miR-124-3p過表達對西方蜜蜂氣味學(xué)習(xí)的影響Fig.2 Effect of overexpression of ame-miR-124-3p on odor learning in Apis mellifera注:*表示在第3次學(xué)習(xí)試驗中ame-miR-124-3p過表達組與ame-miR-124-3p過表達對照組的伸吻反應(yīng)率經(jīng)t檢驗呈顯著性差異(P<0.05)。Note: Single asterisk indicated that proboscis extension response rates were significantly different by t-test between ame-miR-124-3p mimics and ame-miR-124-3p mimics-NC from the 3rd learning experiments.

圖3 ame-miR-124-3p的相對表達量Fig.3 Relative expression levels of ame-miR-124-3p注:*表示經(jīng)t檢驗呈顯著性差異(P<0.05)。Note: Single asterisk indicated that proboscis extension response rates were significantly different by t-test.

3 結(jié)論與討論

學(xué)習(xí)是動物在自然界中賴以生存的重要能力,相對于大型動物,蜜蜂大腦體積小,包含的神經(jīng)元數(shù)量少,但蜜蜂同樣有復(fù)雜的社會行為(Lafonetal., 2021)。因此,利用蜜蜂作為模型動物由淺入深的研究學(xué)習(xí)機制極其重要。研究報道顯示,12日齡的蜜蜂已經(jīng)具有穩(wěn)定且較好的氣味學(xué)習(xí)能力(Laloietal., 2001; 邱園妹等,2020)。在本試驗中只選取11日齡的蜜蜂作為實驗對象,排除了日齡對實驗的干擾。氣味學(xué)習(xí)過程中提供兩種較容易區(qū)分的氣味(1-壬醇和正己醇),可減小蜜蜂對特定氣味的喜好所產(chǎn)生的偏差(Rayetal., 1997; Michelyetal., 2017)。

目前,許多研究都在探索蜜蜂的氣味學(xué)習(xí)分子機制。Wang等人將氣味學(xué)習(xí)訓(xùn)練后的蜜蜂大腦與未經(jīng)過氣味學(xué)習(xí)訓(xùn)練的蜜蜂大腦進行基因表達譜(Digital gene expression,DGE)測序發(fā)現(xiàn) 259個差異表達基因,這為探究蜜蜂的氣味學(xué)習(xí)與記憶的機制提供了重要線索(Wangetal., 2013)。Farooqui等人發(fā)現(xiàn)章魚胺介導(dǎo)觸角葉早期加工階段嗅覺記憶組成部分的鞏固(Farooquietal., 2003)。另外,Cristino等人研究發(fā)現(xiàn)miR-932的抑制能夠損害氣味學(xué)習(xí)后長期記憶的形成,mir-932靶基因的驗證發(fā)現(xiàn),miR-932與肌動蛋白相互作用,這表明miR-932可能能靶向肌動蛋白來調(diào)控蜜蜂的記憶形成(Cristinoetal., 2014),為miRNA參與蜜蜂學(xué)習(xí)與記憶提供了直接證據(jù)。此外,Michely等人在蜜蜂氣味聯(lián)想學(xué)習(xí)訓(xùn)練前4 h注射miR-124抑制劑,發(fā)現(xiàn)蜜蜂在3次氣味聯(lián)想學(xué)習(xí)后2 h的短期記憶和24 h的長期記憶顯著降低,這說明miR-124在條件反射誘導(dǎo)的瞬變記憶的早期階段起著重要作用(Michelyetal., 2017)。Cristino等人和Michely等人的研究雖然很好地闡述了miRNA與蜜蜂記憶的關(guān)系,但未揭示miRNA對蜜蜂氣味學(xué)習(xí)能力的影響。

本研究通過miRNA的抑制和過表達發(fā)現(xiàn)了ame-miR-124-3p在調(diào)控蜜蜂氣味學(xué)習(xí)能力中起著重要作用。ame-miR-124-3p被抑制后,蜜蜂的氣味學(xué)習(xí)能力降低(圖1),蜜蜂腦部ame-miR-124-3p的相對表達量顯著降低(圖3);而ame-miR-124-3p的過表達則會增強蜜蜂的氣味學(xué)習(xí)能力(圖2),這表明ame-miR-124-3P可能是調(diào)控蜜蜂學(xué)習(xí)能力的重要因子,這與Michely等人的研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了緊密的關(guān)聯(lián)。以往的研究表明,miR-124在果蠅的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(Starketal., 2005),也在雞脊髓神經(jīng)前體細胞中高度表達(Caoetal., 2007);miR-124是小鼠大腦含量最豐富的miRNA,占所有miRNA在大腦表達的25%～48%(Lagos-Quintanaetal., 2017)。用miR-124轉(zhuǎn)染小鼠神經(jīng)干細胞發(fā)現(xiàn),miR-124能夠誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞、刺激神經(jīng)元的分化(Silberetal., 2017)。Cheng等人在小鼠腦室下區(qū)(Subventricular zone,SVZ)的活體實驗發(fā)現(xiàn),miR-124使SRY-box表達下調(diào),從而抑制前體分裂并刺激分化(Chengetal., 2009)。Rajasethupathy等人通過分析miRNA在海兔不同組織中產(chǎn)生的克隆數(shù)量,確定每個miRNA的豐度和組織分布,他們發(fā)現(xiàn)含量最豐富的是miR-124(Rajasethupathyetal., 2009)。這些發(fā)現(xiàn)說明在果蠅、雞、小鼠和海兔中,miR-124都是神經(jīng)發(fā)生的重要調(diào)控因子。此外,Qin等人利用SRNA-seq技術(shù),發(fā)現(xiàn)經(jīng)過視覺學(xué)習(xí)后的蜜蜂個體腦部miRNA表達量出現(xiàn)變化,并檢測出40個差異表達的已知miRNA,其中包含miR-124,這表明視覺學(xué)習(xí)的蜜蜂會在條件化之后直接誘導(dǎo)不同miRNA水平的變化,特定的miRNA可能通過調(diào)控學(xué)習(xí),從而促進蜜蜂記憶的形成(Qinetal., 2014)。這些研究結(jié)果表明miR-124在各種物種中相對保守,并可能參與動物的神經(jīng)調(diào)控。

miRNA在突觸發(fā)育的不同階段發(fā)揮著廣泛的作用,包括樹突形成、突觸形成和突觸成熟(Schratt, 2009)。此前有報道稱miR-932位于蜜蜂神經(jīng)連接蛋白2(Neuroligin 2, Nlg 2)基因的內(nèi)含子2中(Biswasetal., 2008),并且已被證明參與脊椎動物和無脊椎動物的谷氨酸和γ-氨基丁酸能突觸的發(fā)育(Biswasetal., 2008; Chenetal., 2012)。神經(jīng)可塑性是指由于經(jīng)驗原因引起的大腦的結(jié)構(gòu)改變。大腦由神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞構(gòu)成,這些細胞互相連接,通過加強或削弱這些連接,大腦的結(jié)構(gòu)可以發(fā)生改變。氣味學(xué)習(xí)是一種會導(dǎo)致大腦功能和結(jié)構(gòu)改變的一種行為(Haehnel, 2010; Paffhausenetal., 2020),miRNA可能是通過影響神經(jīng)可塑性了來影響蜜蜂的氣味學(xué)習(xí)能力。突出可塑性是蜜蜂學(xué)習(xí)與記憶的基礎(chǔ),研究表明,突出可塑性的長期保持有賴于蛋白質(zhì)的合成(Zoghbi, 2003)。因此,在無脊椎動物模式生物中,miRNA與突觸可塑性、學(xué)習(xí)和記憶的調(diào)控有關(guān)。以上表明,miR-124可能是通過影響蜜蜂神經(jīng)可塑性進而調(diào)控氣味學(xué)習(xí)能力,最終影響其早期記憶,miRNA與神經(jīng)可塑性之間的聯(lián)系需要進一步探索。

綜上,抑制ame-miR-124-3p的表達能夠降低蜜蜂氣味學(xué)習(xí)的能力,ame-miR-124-3p過表達則能增強蜜蜂的氣味學(xué)習(xí)能力,這表明ame-miR-124-3p在調(diào)控蜜蜂氣味學(xué)習(xí)能力中起著重要作用。本實驗結(jié)果有助于從分子水平上了解蜜蜂氣味學(xué)習(xí)行為和大腦功能之間的聯(lián)系。