蔡敏玲,張 康,張 純,鄧惠敏*,朱子丹*

(1. 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣東省昆蟲發(fā)育生物學(xué)與應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510631;2. 廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510640)

遺傳信息從DNA轉(zhuǎn)移到RNA的過程稱為轉(zhuǎn)錄(transcription)。在真核生物中,最初轉(zhuǎn)錄生成的RNA稱為核內(nèi)不均一RNA(heterogeneous nuclear RNA,hnRNA)。hnRNA是mRNA的未成熟前體,包括各種基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及其成為mRNA前的各中間階段分子。大部分hnRNA在核內(nèi)與各種特異蛋白質(zhì)形成復(fù)合體即核內(nèi)不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNP)。hnRNP家族(hnRNPs)是一類與mRNA生物學(xué)功能密切相關(guān)的RNA結(jié)合蛋白,主要結(jié)構(gòu)包括氨基端(N端)的兩個(gè)RNA結(jié)合區(qū)域(RNA-binding domain,RBD I和RBD II)與羧基端(C端)富含甘氨酸的區(qū)域,其與前體mRNA(pre-mRNA)結(jié)合形成復(fù)合體并參與一系列重要的生命功能如mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝及剪接等過程的調(diào)控(邵羊陽等,2017)。hnRNP具有輔助RNA加工的功能,除至少包含有一個(gè)RNA結(jié)合區(qū)域,其還包含輔助區(qū)域。

RNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域(RNA recognition motif,RRM),也稱RBD或核糖核蛋白結(jié)構(gòu)域(ribonucleoprotein domain,RNP),在真核生物中是含量最豐富的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域之一。RRM RNA結(jié)合蛋白的顯著特征是包含一個(gè)或數(shù)個(gè)明顯的RRM,可參與pre-mRNA剪接、RNA細(xì)胞定位及RNA穩(wěn)定性等多種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程(杜光偉等,1999)。通常RRM中包含2個(gè)高度保守的共有序列,稱為RNP1和RNP2。從RRM的三維結(jié)構(gòu)可以看出,RRM保守氨基酸RNP區(qū)域存在兩個(gè)作用:(1)RNP1和RNP2的帶電和芳香族側(cè)鏈暴露在外側(cè)溶劑中,可通過氫鍵和環(huán)的堆積力直接與RNA結(jié)合;(2)位于RNP1最后位置的芳香族側(cè)鏈指向折疊的結(jié)構(gòu)域內(nèi)部和兩個(gè)α螺旋的高度保守疏水氨基酸形成結(jié)構(gòu)域的疏水核心(Kenan, 1991)。從典型的RRM序列比對(duì)顯示,RNP1位于RRM的β3鏈上,其共有序列為(Lys/Arg)-(Gly)-(Phe/Tyr)-(Gly/Ala)-(Phe/Tyr)-(Val/Ile/Leu)-X-(Phe/Tyr);RNP2則位于RRM的β1鏈上, 共有序列是(Ile/Val/Leu)-(Phe/Tyr)-(Ile/Val/Leu)-X-Asp-Leu(X表示任意氨基酸)(Marisetal., 2005; Katherineetal., 2017)。

家蠶Bombyxmori是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲,也是鱗翅目的模式昆蟲。Squid(SQD)在家蠶中通過RNA的選擇性剪接編碼不同的hnRNP亞型,每個(gè)亞型氨基酸殘基共同的氨基端有兩個(gè)共同的RRM,這些亞型是hnRNP復(fù)合物的主要成分(霍錦霞,2010)。果蠅中的Squid/SQD蛋白hrp40為一類hnRNPs,可作為剪接抑制因子和hrp38共同與poly ADP-ribose(pADPr)結(jié)合,調(diào)控Hsrw-RC的選擇性剪接(Ji and Tulin, 2009)。因此,推測(cè)Squid(SQD)是一種hnRNPs。

對(duì)家蠶剪接因子SQD的研究,有助于闡釋核不均一核糖核蛋白SQD在家蠶甚至昆蟲生命活動(dòng)中的功能作用。本研究制備了BmSQD的多克隆抗體,并對(duì)該蛋白在各發(fā)育時(shí)期與各組織中的表達(dá)與定位進(jìn)行了分析。研究結(jié)果為進(jìn)一步探究SQD在家蠶乃至昆蟲中的功能及其在昆蟲基因選擇性剪接的調(diào)控機(jī)制方面提供了參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑

采用的家蠶品種為P50T大造。蠶卵與桑葉均由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供,幼蟲置于27℃,相對(duì)濕度65%～75%,光周期L∶D=12 h∶12 h條件下飼養(yǎng)至成蟲;原核蛋白表達(dá)載體pET-32a及大腸桿菌DH5α與BL21為本實(shí)驗(yàn)室保存;質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司;克隆試劑盒One step Cloning Kit購自Vazyme公司;逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(RNase free)、dNTP(10 mM)、Recombinant RNase Inhibitor、RNase free Water、Recombinant DNase I(RNase free)及Trizol Isolate抽提試劑盒均購于TaKaRa公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒EastepRqPCR Master Mix購于上海普洛麥格公司;弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自Sigma公司;實(shí)驗(yàn)涉及的引物合成和相關(guān)DNA測(cè)序委托華大基因公司完成。

1.2 生物信息學(xué)分析

使用DNAMAN軟件對(duì)BmSQD的CDS(Coding Sequence)核苷酸序列進(jìn)行氨基酸序列翻譯;利用在線工具Protparam軟件對(duì)BmSQD基本特性進(jìn)行分析;使用ProtScale在線軟件分析蛋白的親/疏水性;采用NetPhos 2.0 Server工具在線預(yù)測(cè)蛋白的磷酸化位點(diǎn);利用SOPMA在線工具對(duì)BmSQD的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析;采用SMART網(wǎng)站分析蛋白的保守結(jié)構(gòu)域;運(yùn)用SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫在線分析BmSQD蛋白的三維結(jié)構(gòu);使用DNAstar軟件中的Megalign工具和MEGA6軟件對(duì)SQD的序列進(jìn)行比對(duì)與保守性分析。

1.3 總RNA提取與cDNA合成

分別選取5齡期(第4、6天)、游走期第1、2天及預(yù)蛹期翅原基,及蛹期第3、5天的蛹翅和游走期第2天(W2)不同組織,包括翅原基、中腸、表皮、絲腺及頭部;胚胎組織按照家蠶成蟲交配產(chǎn)卵后每24 h為一天的時(shí)間及胚胎發(fā)育時(shí)期 2 h(卵受精期)、18 h(原胚期)、30 h(原腸胚期)、72 h(器官形成期)、120 h(反轉(zhuǎn)期)、168 h(點(diǎn)青期)收集材料;將各組織在液氮中速凍后研磨。按照TaKaRa公司Trizol Isolate試劑盒的方法提取各組織的總RNA,再按照M-MLV RNase cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

在NCBI網(wǎng)址(https://www.ncbi.nlm.nih. gov/)搜索下載家蠶Bmsqd的mRNA序列,根據(jù)該基因的ORF序列,利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物,設(shè)計(jì)出Bmsqd-1F和Bmsqd-1R基因克隆引物和熒光定量PCR引物RT-Bmsqd-F和RT-Bmsqd-R;同時(shí)利用DNAMAN軟件分析選取BamH I/SalI為酶切位點(diǎn),設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物Bmsqd-2R和Bmsqd-2F。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物

1.5 家蠶BmSQD的基因克隆及蛋白表達(dá)載體構(gòu)建

以逆轉(zhuǎn)錄的家蠶幼蟲翅原基cDNA為模板,利用上述特異性引物Bmsqd-1F和Bmsqd-1R進(jìn)行PCR擴(kuò)增Bmsqd的開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)區(qū)域。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,32個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后,PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè),利用凝膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收。回收的DNA片段與質(zhì)粒pMD-18T載體進(jìn)行連接反應(yīng),轉(zhuǎn)化后篩選測(cè)序確認(rèn)陽性克隆。以重組的pMD-18T-SQD質(zhì)粒為模板,在上述擴(kuò)增條件下擴(kuò)增帶有酶切位點(diǎn)的DNA。在瓊脂糖凝膠檢測(cè)后同樣用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。用BamH I和SalI雙酶切pET-32a質(zhì)粒,反應(yīng)體系為10 μL,質(zhì)粒2 μg,BamH I酶1 μL,SalI酶1 μL,10×T Buffer 3 μL,反應(yīng)條件為37℃ 3 h,酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)并回收目的DNA片段。將線性化pET-32a載體和帶有酶切位點(diǎn)的DNA片段用同源重組試劑盒進(jìn)行連接,反應(yīng)體系為:線性化載體4 μL,目的DNA片段4 μL,連接酶1 μL,Buffer 2 μL,ddH2O 9 μL,37℃反應(yīng)30 min。連接產(chǎn)物用大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng),涂板后37℃培養(yǎng)16 h,挑取菌落并進(jìn)行PCR反應(yīng)后送公司測(cè)序篩選陽性克隆。

1.6 誘導(dǎo)重組SQD蛋白表達(dá)及純化與抗體制備檢測(cè)

將保存的重組質(zhì)粒菌液接入5 mL含氨芐的LB液體培養(yǎng)基(50 μg/mL),37℃ 220 rpm過夜培養(yǎng),隔天菌液按1∶100(v∶v)的比例接入新的含氨芐LB液體培養(yǎng)基,以同樣的條件擴(kuò)大培養(yǎng);之后加入IPTG(0.1 mM),37℃ 220 rpm繼續(xù)培養(yǎng)4～5 h。將誘導(dǎo)的菌液于4℃ 12 000 rpm離心10 min收集菌體。以不含目的基因的pET-32a菌體為對(duì)照,將菌體進(jìn)行超聲破碎,分別收集沉淀和上清液,用12%凝膠進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。按照Ni-NTA His·BindRResin(NovagenR)試劑盒的方法進(jìn)行蛋白純化,取1 mL Ni2+柱于管中,使用兩倍體積蒸餾水洗2次,兩倍體積1×Charge(50 mM NiSO4)buffer洗3次,兩倍體積1×Binding buffer(0.5 M NaCl,20 mM Tris-HCl,5 mM Imidazole,pH7.9)洗2次,將上清液用0.45 μM規(guī)格的濾膜過濾后加入管中,用10倍體積的1×Binding buffer、6倍體積的1×Washing buffer(0.5 M NaCl,20 mM Tris-HCl,60 mM Imidazole,pH7.9)和6倍體積的1×Elution buffer(0.5 M NaCl,20 mM Tris-HCl,1 M Imidazole,pH7.9)分別洗脫柱子,離心收集純化蛋白上清。用SDS-PAGE檢查蛋白純化效果。

新西蘭雄兔穩(wěn)定飼養(yǎng)4 d,禁食24 h后于耳緣動(dòng)脈抽取3～5 mL血液,37℃放置2 h后4℃沉淀過夜,次日12 000 rpm離心,取上清作為對(duì)照組,-80℃保存。將純化后的重組蛋白與Sigma弗氏不完全佐劑等體積混合,確保蛋白量為2 mg,蛋白與佐劑混合后震蕩過夜,使抗原充分乳化,次日在兔子的腹部和四肢腋下等部位進(jìn)行皮下注射;7 d后將純化后的重組蛋白與Sigma弗氏完全佐劑等體積混合,確保蛋白量為2 mg,蛋白與佐劑混合后震蕩過夜,使抗原充分乳化,次日在兔子的腹部和四肢腋下等部位進(jìn)行皮下注射;7 d后,再次免疫注射2次;4次免疫后收集血液制備抗體血清,之后Western blot檢測(cè)抗體效價(jià)。

1.7 Western blotting

分別選取5齡期(第1、3和5天)、游走期第1與2天翅原基及蛹期第0天和3天的蛹翅和游走期第1天(W1)不同組織,包括卵巢、中腸、脂肪體、精巢;胚胎組織按照家蠶成蟲交配產(chǎn)卵后每24 h為一天的時(shí)間,于第3～7天收集材料;將各組織在預(yù)冷的PBS中研磨,取總蛋白用于Western blotting實(shí)驗(yàn)。

配制12% SDS-PAGE分離膠及5%濃縮膠,之后進(jìn)行樣品蛋白凝膠電泳。把配制好的蛋白膠置于電泳槽,按順序上樣,上樣量為20～60 μg。先用80V低電壓電泳濃縮蛋白,30 min后采用100 V電壓進(jìn)行蛋白分離,時(shí)間為1～2 h。電泳結(jié)束后,利用電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將SDS-PAGE凝膠的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上,用3% BSA in TBST浸泡置于4℃封閉過夜,以1∶1 000稀釋比例的BmSQD或Bmβ-tublin抗體(鼎國生物,中國)于37℃孵育2 h,去除抗體之后用TBST洗脫液洗膜3次,每次10 min去除未結(jié)合的抗體。接著加入1∶10 000稀釋比例的堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG酶標(biāo)抗體(威佳,中國),在37℃孵育1 h,去除二抗后,用TBST洗脫液洗膜4次,每次5 min,再用TBS洗脫液洗膜3次,每次10 min。最后用337.5 μg/mL四唑硝基藍(lán)(NBT)和175 μg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽(BCIP)混合液或ECL試劑盒進(jìn)行顯色。

1.8 免疫組化定位

將5齡第5天家蠶幼蟲的翅原基放置于固定液中,在4℃中慢速旋轉(zhuǎn)過夜。在室溫下加入3% BSA封閉1～2 h,再用PBT(0.1% Triton×100 in PBS)洗3次,每次5 min(以下皆是);接著用BmSQD抗體(1∶400)孵育2 h,PBT洗3次;之后用二抗(1∶400)(鼎國生物,中國)孵育1～2 h,PBT洗3次;4′,6-二脒基-2-苯基吲哚DAPI(4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)(鼎國生物,中國)孵育30 min,PBT洗2次;樣品于共聚焦掃描顯微鏡(奧林巴斯FV3000)下觀察拍照。

將家蠶胚胎發(fā)育72 h的蠶卵經(jīng)過軟化固定后用石蠟包埋做切片,再經(jīng)過二甲苯和乙醇對(duì)切片脫蠟,PBS清洗3次,每次5 min(以下皆是);3%甲醇-H2O2溶液浸泡3 min消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,PBS清洗1次;每個(gè)切片滴加 150 μL 10 μg/mL Proteinase K PBS溶液并用封口膜覆蓋,37℃,20 min,PBS清洗1次;冷的Gly/PBS (2 mg/mL)溶液在冰上清洗10 min,PBS清洗1次;滴加3% BSA/PBS于37℃封閉1 h;加BmSQD抗體(1∶500),37℃孵育2 h,PBS清洗3次;加入熒光標(biāo)記的二抗(1∶500)和DAPI,避光,37℃孵育30 min,PBS清洗3次;之后用激光共聚焦掃描顯微鏡(OLYMPUS,日本)觀察拍照。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用稀釋至100 μL的cDNA樣品定量檢測(cè)目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率是否符合定量PCR標(biāo)準(zhǔn),之后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)檢測(cè),采用20 μL體系:10 μL qPCR Master Mix(2×),上、下游引物(RT-Bmsqd-F和RT-Bmsqd-R)各0.4 μL,2 μL DNA模板,7.2 μL ddH2O。PCR標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增程序:95℃變性2 min,40個(gè)循環(huán),循環(huán)條件為95℃ 15 s,60℃ 40 s。每個(gè)樣品設(shè)置3組生物學(xué)重復(fù)。數(shù)據(jù)的分析和作圖采用GraphPad Prism軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 BmSQD理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)特性分析

家蠶Bmsqd(Accession number: NW_00458 1760.1)cDNA全長(zhǎng)5 636 bp,ORF為975 bp,其編碼的BmSQD蛋白由324個(gè)氨基酸組成,分子質(zhì)量約34.671 kDa,等電點(diǎn)pI為8.37,在氨基端(N端)存在2個(gè)保守的RRM結(jié)構(gòu)域,在羧基端(C端)含有2個(gè)富含甘氨酸(G)的低復(fù)雜度區(qū)域(Low Complexity Region,LCR)(圖1)。RRM結(jié)構(gòu)域能夠識(shí)別結(jié)合RNA特定序列,且通常含有RRM結(jié)構(gòu)域的RNA結(jié)合蛋白參與前體RNA的剪接(杜光偉等,1999)。hnRNPs的主要結(jié)構(gòu)包括N端的兩個(gè)RNA結(jié)合區(qū)域(RBD I和RBD II,RRM1和RRM2)及C端的富含甘氨酸區(qū)域(邵羊陽等,2017)。由此,推測(cè)BmSQD是一類具有識(shí)別結(jié)合特定基因RNA序列并參與剪接調(diào)控的hnRNPs。

圖1 BmSQD CDS的核苷酸與氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and amino acid sequences of BmSQD CDS注:左邊數(shù)字表示核苷酸序列,右邊數(shù)字表示氨基酸序列;總氨基酸數(shù),324;分子質(zhì)量,34.671 kDa;終止密碼子以*標(biāo)記,BmSQD的RRM結(jié)構(gòu)域用紅色字體標(biāo)示,RRM1位于44-116 aa,RRM2位于124-196 aa;低復(fù)雜度區(qū)域用綠色斜體標(biāo)示。Note: Numbers on the left indicated nucleotide sequences, and numbers on the right indicated amino acid sequences. Total amino acid count, 324; Molecular weight, 34.671 kDa; Termination codon was marked with *, and the RRM domains of BmSQD were marked in red, RRM1 was located at 44-116 aa, and RRM2 was located at 124-196 aa. Low Complexity Regions were marked in green italics.

使用NetPhos 2.0 Server在線預(yù)測(cè)蛋白的磷酸化位點(diǎn),在BmSQD的氨基酸序列中,磷酸化位點(diǎn)主要在于酪氨酸和蘇氨酸,其次是絲氨酸,其中酪氨酸的磷酸化位點(diǎn)最多,且集中在序列后半部分,暗示BmSQD蛋白可能需要這些氨基酸位點(diǎn)的磷酸化以行使功能(圖2)。

圖2 BmSQD的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.2 Phosphorylation site prediction of BmSQD

進(jìn)一步利用SOPMA在線工具對(duì)BmSQD的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析。結(jié)果顯示,在BmSQD的二級(jí)結(jié)構(gòu)中,α螺旋占13.58%,β折疊占8.33%,延伸鏈結(jié)構(gòu)(Extended strand)占21.6%,比例最多為無規(guī)則卷曲(Random coli)高達(dá)56.48%(圖3)。其中α螺旋和β折疊氨基酸序列通過自身盤繞折疊構(gòu)成發(fā)揮RNA結(jié)合功能的RRM結(jié)構(gòu)區(qū)域,而延伸鏈結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲形成α螺旋和β折疊的多肽片段,構(gòu)成蛋白主體部分,是蛋白功能實(shí)施和構(gòu)象的重要區(qū)域。

圖3 BmSQD的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Secondary structure prediction of BmSQD

采用SMART網(wǎng)站分析蛋白的保守結(jié)構(gòu)域,BmSQD具有兩個(gè)保守的RRM結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)低復(fù)雜度區(qū)域,暗示BmSQD具有結(jié)合RNA的能力(圖4)。

圖4 BmSQD保守結(jié)構(gòu)域圖示Fig.4 Schema of the conserved domain of BmSQD

使用SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫在線分析蛋白的三維結(jié)構(gòu),預(yù)測(cè)的BmSQD三維結(jié)構(gòu)主要是兩個(gè)RRM結(jié)構(gòu)域組成的骨架結(jié)構(gòu),從而行使結(jié)合RNA和發(fā)揮相應(yīng)作用的功能(圖5)。

圖5 BmSQD的三維模式預(yù)測(cè)Fig.5 3D model prediction of BmSQD

2.2 SQD保守性分析

為探究昆蟲中SQD的功能是否保守,對(duì)不同昆蟲目如鱗翅目、膜翅目、鞘翅目、雙翅目、半翅目中不同物種的SQD進(jìn)行聚類分析和氨基酸序列比對(duì)。結(jié)果顯示,各類目中的SQD是可匯聚溯源的(圖6-A),且從氨基酸序列比對(duì)看出,SQD的兩個(gè)RRM結(jié)構(gòu)域是高度相似保守的(圖6-B)。進(jìn)一步對(duì)不同昆蟲SQD的RRM1和RRM2結(jié)構(gòu)域氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)RRM結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)總體匹配度高,且都存在兩個(gè)高度保守的氨基酸區(qū)域RNP1和RNP2,分別位于RRM中的β3和β1區(qū)域(圖7)。這些結(jié)果表明,SQD蛋白尤其是其RRM結(jié)構(gòu)域在昆蟲進(jìn)化中是高度保守的,暗示SQD在昆蟲中與RNA結(jié)合并行使剪接調(diào)節(jié)功能的高度保守性。

2.3 誘導(dǎo)重組SQD蛋白表達(dá)及純化與抗體制備檢測(cè)

將含有重組蛋白表達(dá)的菌體經(jīng)過超聲破碎后檢測(cè)重組蛋白的可溶性,結(jié)果顯示,重組BmSQD在上清液中,這表明重組蛋白是可溶的(圖8-A);利用鎳柱進(jìn)行純化,獲得了純化的重組蛋白(圖8-B)。利用純化蛋白進(jìn)行抗體制備后獲得了相應(yīng)的多克隆抗體。Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示,BmSQD蛋白的多克隆抗體能較好地識(shí)別重組蛋白,而免疫前血清未能識(shí)別重組蛋白(圖8-C),這表明制備的BmSQD多克隆抗體特異性較好,可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 家蠶BmSQD的mRNA和蛋白表達(dá)水平

Bmsqd在家蠶幼蟲期的翅原基和蛹期的翅中均有表達(dá),通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以分析其mRNA水平的表達(dá)情況;經(jīng)過數(shù)據(jù)處理分析發(fā)現(xiàn),在蛹期第3天(P3)Bmsqd表達(dá)量與其它時(shí)期比較具有顯著差異,較之前顯著升高,在蛹期第5天(P5)達(dá)到峰值(圖9-A)。在對(duì)家蠶胚胎不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量分析可以看出,Bmsqd的mRNA表達(dá)量在胚胎組織的第1天即受精后的24 h最高,在第2天后表達(dá)降低,在第4天表達(dá)量又逐漸增加,第5天表達(dá)量上升到一定量后于第6天下降,接著第7、8和9天表達(dá)量都較低(圖9-B)。細(xì)化胚胎分化與發(fā)育時(shí)間,進(jìn)一步分析Bmsqd在卵受精期、原胚期、原腸胚期、器官形成期、反轉(zhuǎn)期、點(diǎn)青期的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,在胚胎發(fā)育受精卵分裂時(shí)期即原胚期,Bmsqd表達(dá)量較高,而后在原腸胚時(shí)期表達(dá)量有所下降,到器官形成期時(shí)表達(dá)量大致不變,但在反轉(zhuǎn)期表達(dá)量大幅上升至原胚期水平,之后在點(diǎn)青期下降至原來下降的水平(圖9-C)。

對(duì)家蠶不同時(shí)期的組織進(jìn)行BmSQD蛋白表達(dá)水平分析,發(fā)現(xiàn)在翅原基或翅發(fā)育的不同時(shí)期,BmSQD均有表達(dá),其中5齡第5天(L5D5)、游走期第1天(W1)、游走期第2天(W2)表達(dá)量較高(圖10-A);由于家蠶胚胎發(fā)育第1、2天的卵黃原蛋白較多,第8、9天黑色素沉積,對(duì)目的蛋白的抗體孵育造成影響,故取胚胎發(fā)育第3天到第7天進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè),從結(jié)果看出,在胚胎發(fā)育第4、5天蛋白表達(dá)量較高(圖10-B),處于器官形成期和胚胎反轉(zhuǎn)期,與mRNA表達(dá)水平相符合。此外,SQD抗體可檢測(cè)到3條目的蛋白條帶(圖10),推測(cè)分子量較大的蛋白條帶可能是磷酸化修飾后的蛋白條帶,這與生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)BmSQD存在絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸等磷酸化位點(diǎn)一致(圖6),分子量較小的兩條蛋白條帶可能是由于SQD不同剪接形式而形成的兩種同源異構(gòu)體蛋白,詳細(xì)情況有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖6 昆蟲不同目物種SQD的聚類分析與氨基酸序列比對(duì)Fig.6 Clustering analysis of SQD and amino acid alignment among different species of different insect orders注:A,SQD的聚類分析;B,SQD氨基酸序列比對(duì)(紅色下劃線為RRM1和RRM2區(qū)域)。Note: A, Clustering analysis of SQD; B, SQD amino acid alignment (RRM1 and RRM2 regionswere underlined in red).

圖7 部分昆蟲SQD-RRM結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對(duì)分析Fig.7 Alignment and analysis of SQD-RRM domains amino acid sequence in some insects

圖8 BmSQD的SDS-PAGE和Western-blot結(jié)果分析Fig.8 SDS-PAGE and Western-blot analysisof BmSQD注:A,重組蛋白pET-32a-SQD的誘導(dǎo)表達(dá)檢測(cè);M,蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn);1,pET-32a空白對(duì)照;2,pET-32a IPTG誘導(dǎo);3,重組pET-32a-SQD;4,重組pET-32a-SQD IPTG誘導(dǎo);5,重組pET-32a-SQD IPTG誘導(dǎo)上清;6,重組pET-32a-SQD IPTG誘導(dǎo)沉淀;B,經(jīng)過鎳柱純化后的重組蛋白SDS-PAGE圖,箭頭所指為目的條帶;C,Western-blot;(a),免疫前的血清;CK,免疫前的血清作為對(duì)照;(b),重組蛋白多克隆抗體。Note: A, Detection of induced expression of recombinant protein pET-32a-SQD; M, Protein molecular weight standard; 1, pET-32a blank control; 2, IPTG induction of pET-32a; 3, Recombinant pET-32a-SQD; 4, IPTG induction of recombinant pET-32a-SQD; 5, Supernatant of recombinant pET-32a-SQD induced byIPTG ; 6, Precipitation of recombinant pET-32a-SQD induced by IPTG; B, SDS-PAGE diagram of the recombinant protein after purification by nickel column, the arrow indicated the target band; C, Western-blot; (a), Pre-immunization serum; CK, Pre-immunization serum as control; (b), Polyclonal antibody against recombinant protein.

圖9 BmSQD的mRNA表達(dá)水平分析Fig.9 mRNA expression level analysis of BmSQD注:A,Bmsqd在家蠶翅原基或蛹翅中不同時(shí)期的mRNA水平表達(dá);L5D4,5齡第4天;L5D6,5齡第6天;W1,游走期第1天;W2,游走期第2天;PP,預(yù)蛹期;P3,蛹期第3天;P5,蛹期第5天;B,家蠶胚胎不同發(fā)育時(shí)期的Bmsqd mRNA表達(dá)水平;D1～D9,胚胎發(fā)育第1～9天(發(fā)育24 h為1天);C,胚胎發(fā)育各階段的Bmsqd mRNA表達(dá)水平;A～F,卵受精期;原胚期;原腸胚期;器官形成期;反轉(zhuǎn)期;點(diǎn)青期;圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;不同字母表示不同時(shí)期表達(dá)量存在顯著差異(P<0.05)。Note: A, mRNA expression levels of Bmsqd in silkworm wing disc or pupal wing at different stages; L5D4, the 4th day of the 5th instar; L5D6, the 6th day of the 5th instar; W1, the 1st day of wandering period; W2, the 2nd day of wandering period; PP, pre-pupal stage; P3, the 3rd day of pupal stage; P5, the 5th day of pupal stage; B, Bmsqd mRNA expression levels at different day of embryonic development stages; D1～D9, Day 1～9 of embryonic development (24 hours of development count as one day); C, Bmsqd mRNA expression levels at different developmental stages of silkworm embryos; A～F, zygote stage; proembryo stage; progut embryo stage; organ formation stage; reversal stage; and dot green stage; Data in the figure were mean ± standard deviation; Different letters indicated significant differences in expression levels in different periods (P<0.05).

圖10 不同組織BmSQD蛋白表達(dá)量Western blot結(jié)果Fig.10 Western blot results of BmSQD protein expression in different tissues注:A,不同時(shí)期家蠶幼蟲翅原基或蛹翅;L5D1,5齡第1天;L5D3,5齡第3天;L5D5,5齡第5天;W1,游走期第1天;W2,游走期第2天;P0,剛進(jìn)入蛹期;P3,蛹期第3天;B,家蠶各發(fā)育時(shí)期胚胎組織;D3～D7,發(fā)育至第3天～第7天的胚胎組織。Note: A, Wing discs or pupal wing of silkworm larvae at different stages; L5D1, the 1st day of the 5th instar; L5D3, the 3rd day of the 5th instar; L5D5, the 5th day of the 5th instar; W1, day 1 of the wandering stage; W2, day 2 of the wandering stage; P0, just entering the pupal stage; P3, day 3 of the pupal stage; B, Embryonic tissue at various stages of silkworm embryonic development; D3～D7, Tissue from day 3 to day 7.

2.5 BmSQD在翅原基和胚胎組織的定位

利用免疫組化分析BmSQD蛋白在家蠶5齡第5天幼蟲翅原基和發(fā)育72 h的胚胎中的組織定位,結(jié)果顯示,BmSQD蛋白在家蠶翅原基和胚胎組織中表達(dá),且BmSQD蛋白與染細(xì)胞核的DAPI信號(hào)重疊在一起(圖11,圖12),這表明BmSQD蛋白定位于組織細(xì)胞的細(xì)胞核中,推測(cè)BmSQD蛋白可進(jìn)入細(xì)胞核中,參與RNA剪接的相關(guān)調(diào)控。

圖11 BmSQD在5齡第5天幼蟲翅原基中的免疫組化定位分析Fig.11 Immunohistochemical localization of BmSQD in the wing disc of larvae at the 5th day of the 5th instar larva注:A～C比例尺,400 μm;D～F比例尺,40 μm;A和D,BmSQD抗體;B和E,DAPI染色;C和F,重疊圖像;D、E、F分別為圖A、B、C中方框的放大圖。Note: A～C scale, 400 μm; D～F scale, 40 μm; A and D, BmSQD antibodies; B and E, DAPI staining; C and F, overlapping images; D, E and F were enlargements of the boxes in Fig.A, B and C, respectively.

圖12 BmSQD在發(fā)育72 h的胚胎中的免疫組化定位分析Fig.12 Immunohistochemical localization of BmSQD in embryos at 72 hafter oviposition注:A～C比例尺,200 μm;D～F比例尺,20 μm;A和D,BmSQD抗體;B和E,DAPI染色;C和F,重疊圖像;D、E、F分別為圖A、B、C中方框的放大圖。Note: A～C scale, 200 μm; D～F scale, 20 μm; A and D, BmSQD antibodies; B and E, DAPI staining; C and F, overlapping images; D, E and F were enlargements of the boxes in Fig. A, B and C, respectively.

3 結(jié)論與討論

BmSQD包含兩個(gè)位于N端且高度保守的RRM結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)位于C端的富含甘氨酸的低復(fù)雜度區(qū)域。對(duì)昆蟲的SQD的序列與結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),相同昆蟲目的SQD可聚為同源的一支且不同目的SQD含有高度保守的RRM結(jié)構(gòu)域,特別是RRM中的RNP1和RNP2區(qū)域(圖6,圖7)。含有一個(gè)或數(shù)個(gè)RRM是RRM RNA結(jié)合蛋白的顯著特征且RRM具備與RNA結(jié)合的能力(杜光偉等,1999)。故BmSQD蛋白屬于一類hnRNPs。有研究表明,hnRNPs的兩個(gè)RRM一般都參與這類蛋白與RNA的結(jié)合,如果hnRNP A1兩個(gè)RRM結(jié)構(gòu)域之間的相互作用被中斷或任一個(gè)RRM的RNA結(jié)合能力喪失均會(huì)削弱其剪接抑制作用(Moursyetal., 2017),BmSQD包含兩個(gè)位于N端且高度保守的RRM結(jié)構(gòu)域,表明其具有作為剪接因子的共同結(jié)構(gòu)域,也具備剪接因子的功能。RNP1和RNP2的帶電和芳香族側(cè)鏈可能通過分子間氫鍵與環(huán)的堆積力直接和RNA結(jié)合,而RNP1也可能通過疏水作用與RNA接觸(Kenan, 1991);因此,RNP特定的氨基酸序列與結(jié)構(gòu)位置是保證RRM具有結(jié)合RNA并發(fā)揮相應(yīng)功能活性的重點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)SQD在昆蟲中高度保守(圖6),其中序列基本一致的RNP區(qū)域是保證SQD在昆蟲進(jìn)化中結(jié)合RNA功能高度保守一致的關(guān)鍵。RRM中高度保守的RNP又是保證該類蛋白與RNA結(jié)合活性所必需的,β1-α1-β2-β3-α2-β4空間順序排列是高度保守的(Marisetal., 2005),BmSQD兩個(gè)RRM都按照β1-α1-β2-β3-α2-β4的順序進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)排列且具有位置序列一致的RNP1和RNP2區(qū)域(圖7);故兩個(gè)RRM且RRM中的RNPs是保證BmSQD與RNA結(jié)合的關(guān)鍵基序,與上述已報(bào)道的研究結(jié)果一致,這些條件都表明BmSQD可能作為重要的剪接因子參與家蠶的胚胎發(fā)育和翅原基變態(tài)發(fā)育過程。

除N端兩個(gè)高度保守的RRM結(jié)構(gòu)域外,BmSQD的C端還包含兩個(gè)富含甘氨酸的低復(fù)雜度區(qū)域。低復(fù)雜度區(qū)域在蛋白序列中很常見,通常具有低保守性和結(jié)構(gòu)靈活性,在翻譯后修飾調(diào)控的蛋白質(zhì)互作中發(fā)揮作用(Kastanoetal., 2021)。低復(fù)雜度區(qū)域不僅可結(jié)合RNA,還可以與對(duì)RNA起剪接作用的酶直接結(jié)合,例如核異質(zhì)核糖核蛋白G蛋白通過其N端的RRM和C端的Arg-Gly-Gly基序結(jié)合RNA,并且在低復(fù)雜性區(qū)域使用Arg-Gly-Gly基序直接結(jié)合RNA聚合酶II的磷酸化羧基末端結(jié)構(gòu)域(Zhouetal., 2019)。剪接因子hnRNP A通過其RRMs與外顯子剪接沉默子結(jié)合,但C端富含甘氨酸的低復(fù)雜度區(qū)域才是抑制外顯子被剪接的效應(yīng)區(qū)域(Gatto-Konczak, 1999);Western blot的結(jié)果顯示,BmSQD在卵巢、精巢、翅原基和胚胎組織中存在3條蛋白條帶(圖10),推測(cè)較小的兩個(gè)條帶可能是BmSQD的兩種同源異構(gòu)體,較大的蛋白條帶是經(jīng)過磷酸化修飾的SQD(姜錚等,2009);生信分析結(jié)果顯示,BmSQD的低復(fù)雜度區(qū)域所在的250-300 aa包含眾多潛在的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)(圖1,圖2),暗示低復(fù)雜度區(qū)域可能受到磷酸化作用后發(fā)揮功能。因此推測(cè),位于C端富含某類氨基酸且經(jīng)過磷酸化后的低復(fù)雜度區(qū)域可能是hnRNP類剪接因子促進(jìn)或抑制pre-mRNA剪接的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域,即BmSQDC端富含甘氨酸的低復(fù)雜度區(qū)域可能是主要發(fā)揮促進(jìn)或抑制pre-mRNA剪接作用的效應(yīng)區(qū)域。

hnRNPs是一類與mRNA生物學(xué)功能密切相關(guān)的RNA結(jié)合蛋白,它能與pre-mRNA結(jié)合形成復(fù)合體并參與一系列重要的生命功能如mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、剪接等過程的調(diào)控(邵羊陽等,2017)。BmSQD在L5D4和L5D6幼蟲時(shí)期的翅原基中表達(dá)水平也較高(圖9-A),在L5D3和L5D5時(shí)期蛋白水平也較高,推測(cè)在幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育過程中,SQD作為一類hnRNPs參與了重要的生命功能,如通過mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、剪接等過程,調(diào)控幼蟲的正常進(jìn)食行為和常規(guī)發(fā)育過程。其中的hnRNPA1在真核細(xì)胞hnRNP復(fù)合物中含量十分豐富,是最早發(fā)現(xiàn)作用于前體mRNA剪接過程的。在家蠶中,BmhnRNPA1具有兩個(gè)RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,屬于hnRNPs家族,定位于細(xì)胞核內(nèi),表明其可能參與mRNA的選擇性剪接作用(張康,2019)。hnRNPs蛋白家族與人體健康密切相關(guān),參與了多種疾病的發(fā)生過程,如病毒疾病、腫瘤疾病、自身免疫性疾病等,也參與特異基因可變剪切的調(diào)節(jié)(陳堯等,2018)。本研究表明,作為一類hnRNPs蛋白的BmSQD在5齡第5天幼蟲翅原基中定位于細(xì)胞核中(圖11),其也可能存在相應(yīng)的剪接調(diào)控功能,參與調(diào)節(jié)許多生命活動(dòng),對(duì)家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育有至關(guān)重要的作用。

果蠅中,hrp40是由Squid基因編碼的,作為一類hnRNPs,參與了果蠅發(fā)育過程中的選擇性剪接過程的調(diào)控(Marcoetal., 2009);hrp40是卵形成過程中背部腹側(cè)軸形成所必需的,來自Squid純合子親本的卵和胚胎嚴(yán)重背化,完全缺失Squid基因會(huì)導(dǎo)致胚胎致死(Matunisetal., 1994)。更有研究表明RNA結(jié)合蛋白Squid是果蠅卵母細(xì)胞建立前后極性所必需的(Steinhauer and Kalderon, 2005);在果蠅卵發(fā)生過程中,Squid不僅是oskarmRNA有效定位于卵后部的必要條件(Norvelletal., 2005),還介導(dǎo)了果蠅中未定位gurken(grk)mRNA的翻譯抑制,其中g(shù)urken(grk)mRNA與蛋白的正確定位是果蠅卵子和未來胚胎背腹軸建立的必要條件(Clouseetal., 2007)。綜上表明,SQD在果蠅中對(duì)卵子形成和胚胎發(fā)育具有重要意義,基于SQD在昆蟲進(jìn)化上的高度相似保守性,推測(cè)BmSQD在家蠶卵子形成和胚胎發(fā)育方面也具有重要作用。在本研究結(jié)果中,BmSQD在產(chǎn)卵后72 h處于發(fā)育階段的胚胎中有高表達(dá),主要定位在細(xì)胞核內(nèi)(圖12),且SQD在家蠶主要生長(zhǎng)組織均有表達(dá),其中卵巢、精巢、表皮和中腸表達(dá)量較高,暗示BmSQD在家蠶生長(zhǎng)發(fā)育過程中有重要作用;推測(cè)定位在細(xì)胞核中的BmSQD具有進(jìn)入細(xì)胞核并參與RNA轉(zhuǎn)錄剪接調(diào)控的功能,可通過對(duì)卵巢、精巢、表皮、中腸和翅原基等組織器官發(fā)育的剪接調(diào)控進(jìn)而調(diào)控家蠶胚胎發(fā)育和變態(tài)發(fā)育過程。