賈 建，譚睿陟，王 麗

西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心（瀘州 646000）

單細(xì)胞測序（single-cell sequencing，SCS）是指在單個(gè)細(xì)胞水平上對其攜帶的遺傳信息進(jìn)行測序，可深層次了解同類細(xì)胞不同亞群的分布狀態(tài)、作用過程及協(xié)作機(jī)制等[1-2]。由于單細(xì)胞測序的特殊性，要求單細(xì)胞懸液中有活性的細(xì)胞總數(shù)大于10萬個(gè)，此外單細(xì)胞懸液中細(xì)胞成團(tuán)率、細(xì)胞活性狀態(tài)及細(xì)胞內(nèi)RNA 的完整性也直接決定了研究結(jié)果的準(zhǔn)確性[3-4]，不同組織解離單細(xì)胞所需要的消化酶、消化時(shí)間、溫度和濃度不同[5]。然而腎臟組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，腎臟細(xì)胞線粒體比例高，因此腎臟組織消化程度難以把控，目前尚沒有成熟的腎臟單細(xì)胞懸液制備方法，導(dǎo)致腎臟CD45+單細(xì)胞分離更加困難。胰蛋白酶和Ⅳ型膠原酶是目前研究中的兩種動(dòng)物組織消化的常用試劑，包括小鼠的腦、肝臟組織等[6-7]。本文旨在比較胰蛋白酶和Ⅳ型膠原酶在不同消化條件下對小鼠腎臟組織的消化效果，以確定最佳消化方案，然后對最佳消化方案消化所得腎臟細(xì)胞懸液中的CD45+細(xì)胞進(jìn)行磁珠分離后送單細(xì)胞測序并評估測序結(jié)果，為今后腎臟組織消化或腎臟其它重要細(xì)胞的單細(xì)胞測序前處理提供技術(shù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用雄性6～8 周齡SPF 級C57BL/6小鼠，體重約為18～20 g，共6只，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK（川）2020-030]，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK（川）2020-065]，飼養(yǎng)溫度20～24 ℃，飼養(yǎng)相對濕度50%～60%，12 h 光照12 h黑暗循環(huán)交替。本研究通過西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核同意（審批號：2021DW027）。

1.1.2主要試劑與儀器 抗體生物素化試劑盒（Thermo Fisher Scientific，11060D）、磁珠分選試劑盒（Thermo Fisher Scientific，2232848）、Ⅳ型膠原酶（Worthington Biodchemical Corporation，LS004188）、胰蛋白酶（Beyptime，C0201）、DMEM 培養(yǎng)基（Gibico，812044）、CD45 抗體（Biolegend，103101）、恒溫水浴鍋（HHS-11，中國）、離心機(jī)（Eppendorf，美國）、倒置顯微鏡（Nikon，日本）。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為胰蛋白酶消化組和Ⅳ型膠原酶消化組，每種消化酶作用時(shí)間分別設(shè)置15、30 min和先消化15 min收集上清液后再加入新的消化液繼續(xù)消化15 min（15min+15min組）。

1.2.2取材及前處理 按照50 mg/kg 腹腔注射濃度為10 mg/mL 的戊巴比妥鈉溶液麻醉小鼠，75%酒精消毒小鼠皮膚，心臟采血法抽凈小鼠血液，沿腹腔中線剖開小鼠腹腔，鈍性分離雙腎并去除腎臟包膜，將6只小鼠腎臟取出后，統(tǒng)一在冰上用手術(shù)刀片剁碎至肉泥狀，最后將其平均分成6份待消化處理。

1.2.3腎臟組織消化 將剁碎后的腎臟組織用10 mL PBS 重懸，隨后在50 g 離心力作用下離心5 min 后棄去上清液以除去紅細(xì)胞，隨后將組織用10 mL DMEM 培養(yǎng)基（含5% FBS）重懸，各組分別加入Ⅳ型膠原酶（10μ/mL）和胰蛋白酶（30μ/mL）于37 ℃水浴消化，消化過程中均加入50U脫氧核糖核酸酶Ⅰ以去除死亡細(xì)胞釋放的DNA減少細(xì)胞聚集。消化完成后用70 μm細(xì)胞篩過濾去除未消化完全組織，1200 rpm/min 離心5 min后收集上清液，加入紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞沉淀破除紅細(xì)胞，40 μm細(xì)胞篩過濾去除紅細(xì)胞碎片，1 200 rpm/min 離心5 min 棄去上清，加入1 ml PBS 重懸洗滌細(xì)胞沉淀并重復(fù)兩次。最終將細(xì)胞沉淀重懸收集于500 μl DMEM培養(yǎng)基中。

1.2.4形態(tài)學(xué)觀察 各組分別取消化完成的細(xì)胞懸液10 uL 涂于載玻片上，在Nikon 倒置光學(xué)顯微鏡下采集圖片，觀察組織消化后所得細(xì)胞混懸液狀態(tài)，比較組織消化完全度、單細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞成團(tuán)情況和細(xì)胞狀態(tài)。

1.2.5消化效果比較 取各組消化完成后的腎臟單細(xì)胞懸液稀釋10倍，后取稀釋后的細(xì)胞懸液9 μL與1μL 0.4%濃度的臺盼藍(lán)溶液混勻，再取1 μL混合液加到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)4 個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)和臺盼藍(lán)著色細(xì)胞數(shù)，各組單細(xì)胞總數(shù)目=（4 個(gè)大方格細(xì)胞數(shù)之和/4）×104×細(xì)胞原液量（mL）×10；細(xì)胞活力=4 個(gè)大方格臺盼藍(lán)著色細(xì)胞總數(shù)/4 個(gè)大方格細(xì)胞總數(shù)；細(xì)胞成團(tuán)率=4個(gè)大方格成團(tuán)細(xì)胞總數(shù)/4個(gè)大方格細(xì)胞總數(shù)。比較各組細(xì)胞計(jì)數(shù)差異性。

1.2.6CD45+單細(xì)胞分選 根據(jù)腎臟消化效果比較結(jié)果，選擇消化所得細(xì)胞存活率高、細(xì)胞總數(shù)多和成團(tuán)率低的消化方案進(jìn)行消化，并對腎臟細(xì)胞懸液中的CD45+細(xì)胞進(jìn)行分離。提前參照DSB-X?Biotin Protein Labeling Kit 使用說明將CD45+抗體生物素化，再根據(jù)Dynabeads?FlowComp?Flexi 試劑盒將生物素化后的抗體與磁珠結(jié)合，然后將消化所得腎臟細(xì)胞懸液與結(jié)合了CD45+抗體的磁珠共同孵育30 min 使腎臟CD45+細(xì)胞與磁珠結(jié)合，最后在磁力作用下可將結(jié)合了磁珠的CD45+細(xì)胞分離。分離完成后500 rpm/min 離心1 min收集上清液以去除較大細(xì)胞團(tuán)。

1.2.7分離后的CD45+細(xì)胞計(jì)數(shù)、活力及成團(tuán)率測定選擇消化效果最好的消化方案所得腎臟細(xì)胞懸液CD45+單細(xì)胞懸液9 uL與1 μL 0.4%濃度的臺盼藍(lán)溶液混勻，再取1 μL混合液加到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)4 個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)、成團(tuán)細(xì)胞數(shù)以及臺盼藍(lán)著色細(xì)胞數(shù)。

1.2.8單細(xì)胞測序結(jié)果質(zhì)控 根據(jù)單細(xì)胞測序結(jié)果分析各組細(xì)胞線粒體基因表達(dá)量，CD45+細(xì)胞陽性率以及各種免疫細(xì)胞亞群分群情況評價(jià)細(xì)胞狀態(tài)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞狀態(tài)觀察

隨消化時(shí)間的增加，腎臟組織消化程度越明顯，在消化時(shí)間達(dá)30 min時(shí)，所有組織均已被消化完全，溶液呈懸濁液狀。光鏡下，相同消化時(shí)間內(nèi)胰蛋白酶消化能力明顯弱于Ⅳ型膠原酶，并且消化過程中產(chǎn)生大量細(xì)胞碎片，不利于后續(xù)分選及測序。Ⅳ型膠原酶消化能有效減少細(xì)胞碎片的產(chǎn)生，并且優(yōu)化后的15 min+15 min消化法與30 min直接消化法相比所得細(xì)胞數(shù)量多、產(chǎn)生的細(xì)胞碎片少、細(xì)胞形態(tài)更完整（見圖1）。

圖1 不同消化條件消化所得腎臟細(xì)胞懸液（×100）Figure 1 The suspension of kidney cells was digested under different digestive conditions（×100）

2.2 不同消化方法所得細(xì)胞差異性比較

各組消化所得單細(xì)胞數(shù)量見圖2 所示：不論胰蛋白酶還是Ⅳ型膠原酶組，消化時(shí)間為30 min 所得單細(xì)胞數(shù)量均明顯高于15 min，消化更為完全，Ⅳ型膠原酶在各時(shí)間段消化所得單細(xì)胞數(shù)均高于胰蛋白酶，而15 min+15 min的消化方式相對直接消化30 min所得細(xì)胞總數(shù)顯著增加（P＜0.001），所得死亡細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05），并且單細(xì)胞懸液中成團(tuán)細(xì)胞數(shù)顯著降低（P＜0.01），為后續(xù)CD45+細(xì)胞的進(jìn)一步分選提供了足夠的細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量保障。

圖2 不同消化方式所得細(xì)胞狀態(tài)比較Figure 2 Comparison of cell states obtained by different digestion methods

2.3 CD45+單細(xì)胞分離

經(jīng)磁珠分選后所得CD45+單細(xì)胞懸液細(xì)胞形態(tài)完整，但混有很多體積較大細(xì)胞碎片和細(xì)胞團(tuán)（見圖3A），通過300 rpm/min離心1 min棄沉淀取上清液能夠有效去除較大的組織碎片和成團(tuán)細(xì)胞（見圖3B），可防止測序過程中對儀器設(shè)備造成損害，和提高測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，最終所得單細(xì)胞懸液各項(xiàng)指標(biāo)均符合單細(xì)胞測序標(biāo)準(zhǔn)（見表1）。

表1 磁珠分選細(xì)胞后細(xì)胞狀態(tài)Table 1 Cell status after magnetic beads sorting

圖3 CD45+單細(xì)胞懸液細(xì)胞狀態(tài)Figure 3 Cell state of CD45+single cell

2.4 單細(xì)胞測序結(jié)果

線粒體基因表達(dá)量通常反應(yīng)了細(xì)胞狀態(tài)的好壞，由單細(xì)胞測序報(bào)告我們發(fā)現(xiàn)各組測序所用細(xì)胞的線粒體基因表達(dá)量大部分處于5%左右（見圖4A）。將各組用于測序細(xì)胞共計(jì)85 924 個(gè)統(tǒng)一納入分析，結(jié)果顯示CD45+細(xì)胞為81 254 個(gè)，陽性率為94.56%（見圖4B，綠色即為CD+細(xì)胞），并且其中的T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等重要免疫細(xì)胞均能夠根據(jù)細(xì)胞的種類分為明顯的亞群，對后續(xù)單細(xì)胞結(jié)果分析有利（見圖4C）。

圖4 CD45+單細(xì)胞懸液細(xì)胞狀態(tài)Figure 4 Cell state of CD45+single cell

3 討論

近年來腎臟疾病已成為全球公共衛(wèi)生問題，越來越受到研究者的關(guān)注，通過單細(xì)胞測序技術(shù)對其進(jìn)行研究能夠讓我們更深層次了解腎臟中同類細(xì)胞不同亞群的分布及狀態(tài)，作用過程及協(xié)作機(jī)制等，對挖掘新的研究思路和尋找新的藥物作用靶點(diǎn)起到積極的作用[8-10]。FUJ[11]等構(gòu)建糖尿病小鼠模型開展單細(xì)胞測序，比較模型組與正常組巨噬細(xì)胞細(xì)胞表型變化的差異性發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細(xì)胞比例明顯增加，揭示了M1型巨噬細(xì)胞在糖尿病炎癥反應(yīng)過程中起重要作用，此外研究者們還在急性腎損傷和纖維化、狼瘡腎炎和腎臟腫瘤反應(yīng)等方面開展單細(xì)胞測序，均揭示了重要的研究價(jià)值[12-15]。腎臟疾病發(fā)生過程中大多伴隨著炎癥反應(yīng)的發(fā)生，通過單細(xì)胞測序研究CD45+細(xì)胞在疾病中遺傳信息的變化情況有助于更深入了解其發(fā)病機(jī)理和開發(fā)新的藥物治療作用靶點(diǎn)[16-20]。單細(xì)胞懸液制備情況的好壞直接影響單細(xì)胞測序結(jié)果，由于腎臟結(jié)構(gòu)復(fù)雜，消化存在一定難度，并且腎臟組織內(nèi)所含細(xì)胞種類繁多，導(dǎo)致CD45+陽性細(xì)胞分離更為困難，目前尚無用于單細(xì)胞測序的腎臟單細(xì)胞懸液制備方法的報(bào)道，更無有效的腎臟CD45+細(xì)胞分離方法，因此在目前腎臟單細(xì)胞測序需求日益增加的情況下，摸索腎臟單細(xì)胞懸液制備方法尤為重要。

不同種酶對不同組織消化效果不盡相同，常用的組織消化酶有胰蛋白酶、膠原酶、彈力蛋白酶等[21-22]，胰蛋白酶是目前使用最廣泛的消化試劑，通過作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離[23-24]，膠原酶通過水解細(xì)胞間質(zhì)的脯氨酸使細(xì)胞離散，對于細(xì)胞間質(zhì)膠原的消化作用很強(qiáng)，消化能力不受血清蛋白影響[25]。本研究發(fā)現(xiàn)在相同消化時(shí)間內(nèi)Ⅳ型膠原酶對腎臟組織的消化效率優(yōu)于胰蛋白酶，腎臟組織結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，胰蛋白酶單一的消化機(jī)理是其消化能力不如Ⅳ型膠原酶的重要原因，所以選用Ⅳ型膠原酶對腎臟進(jìn)行消化有利于提高所得單細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞狀態(tài)。消化前將剁碎后的腎臟組織用PBS洗滌再低速離心棄掉上清液能除去大量紅細(xì)胞，從而減少細(xì)胞碎片的產(chǎn)生。采用15 min+15 min 的消化方式能夠減少消化酶對已經(jīng)消化下來的細(xì)胞的作用時(shí)間，對細(xì)胞狀態(tài)起保護(hù)作用，并且能夠減少細(xì)胞碎片的產(chǎn)生。在組織消化過程中難免有細(xì)胞死亡，死亡細(xì)胞裂解釋放的DNA 具有較強(qiáng)粘附性，是導(dǎo)致細(xì)胞聚集成團(tuán)的主要原因，通過在消化液中加入脫氧核糖核酸酶Ⅰ后能夠有效減少單細(xì)胞懸液細(xì)胞成團(tuán)現(xiàn)象[26-27]。消化完成后用PBS 重懸洗滌細(xì)胞沉淀兩次能夠有效去除消化產(chǎn)生的組織、細(xì)胞碎片，有助于排除對單細(xì)胞測序結(jié)果的影響。

在組織消化或細(xì)胞分離過程中細(xì)胞常因外界刺激導(dǎo)致出現(xiàn)應(yīng)急反應(yīng)和線粒體基因的大量釋放，線粒體基因表達(dá)量常用于評價(jià)細(xì)胞狀態(tài)好壞的標(biāo)準(zhǔn)，一般線粒體基因表達(dá)量低于20% 的細(xì)胞可視為正常細(xì)胞[28-30]。所以單細(xì)胞懸液的制備要求快速準(zhǔn)確，以避免RNA 降解或細(xì)胞相關(guān)基因活化導(dǎo)致測序結(jié)果出現(xiàn)偏差[31]，盡可能縮短單細(xì)胞懸液制備時(shí)間尤為重要。免疫磁珠分選法是一種通過磁珠從細(xì)胞群中分離目的細(xì)胞的技術(shù)，通過抗體、生物素或親和素與目標(biāo)細(xì)胞上特定的細(xì)胞表面蛋白結(jié)合后在磁力的作用下起到將目標(biāo)細(xì)胞與非目標(biāo)細(xì)胞分離的目的[32-34]，分離完成后通過300 rpm/min 離心1min 棄掉沉淀取上清能夠有效去掉較大的細(xì)胞團(tuán)，能夠有效降低細(xì)胞成團(tuán)率。該方法相對流式分選法操作更為簡單，所需時(shí)間短，并且能夠避免儀器對細(xì)胞造成的損傷。由單細(xì)胞測序結(jié)果可以看出磁珠分離法分離所得CD45+細(xì)胞純度高且細(xì)胞狀態(tài)好，各重要免疫細(xì)胞亞群分布明顯，說明磁珠分離法不僅操作簡單，并且能夠有利于保護(hù)細(xì)胞狀態(tài)，分離所得細(xì)胞適用于單細(xì)胞測序。

4 結(jié)論

在相同消化時(shí)間條件下，Ⅳ型膠原酶相對胰蛋白酶消化所得細(xì)胞懸液中細(xì)胞數(shù)量更多，細(xì)胞存活率更高，更適合應(yīng)用于腎臟組織消化，所得細(xì)胞懸液通過磁珠分離法所得CD45+單細(xì)胞懸液各項(xiàng)指標(biāo)均符合單細(xì)胞測序要求，表明本腎臟單細(xì)胞懸液制備方法適用于單細(xì)胞測序。