譚 瑩, 胡越航, 錢云霞, 郭安南

互花米草定植的養(yǎng)殖尾水處理人工濕地中古菌群落的組成與分布

譚 瑩1, 胡越航1, 錢云霞1, 郭安南2,3*

（1.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院, 浙江 寧波 315832; 2.寧波大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院, 浙江 寧波 315832; 3.浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 寧波 315832）

為探究凡納濱對蝦養(yǎng)殖尾水處理過程中互花米草濕地的凈化效果和沉積物古菌群落的組成與分布, 基于16S rRNA基因的高通量測序技術(shù), 從沉積物環(huán)境因子、古菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性、環(huán)境因子與古菌群落間的相互關(guān)系進(jìn)行分析. 結(jié)果表明: 互花米草人工濕地深層沉積物的古菌群落多樣性顯著高于表層和根際沉積物; 門水平上, 互花米草人工濕地優(yōu)勢古菌為泉古菌門、廣古菌門和奇古菌門; 綱水平上, 優(yōu)勢古菌為深古菌綱、甲烷微菌綱和熱源體綱; 目水平上, 互花米草人工濕地中含3種氨氧化古菌和7種產(chǎn)甲烷古菌. 非度量多維尺度分析(NMDS)表明, 互花米草根際沉積物與深層沉積物古菌群落差異顯著(<0.05), 與表層更為相似. 冗余分析(RDA)及Mantel檢驗(yàn)表明, 影響古菌群落的主要環(huán)境因子包括pH、銨氮(NH4+-N)、總有機(jī)碳(TOC)和總磷(TP). 相關(guān)性熱圖表明奇古菌門和其中的亞硝基菌綱與環(huán)境因子的相關(guān)性最強(qiáng). 氨氧化古菌群落與pH、NH4+-N、總氮(TN)和TP呈顯著相關(guān)(<0.01), 產(chǎn)甲烷古菌與環(huán)境因子則無顯著相關(guān)性. 人工種植互花米草能夠有效改善濕地環(huán)境, 可為養(yǎng)殖尾水的濕地凈化提供理論和實(shí)踐依據(jù).

古菌群落; 互花米草; 沉積物; 海水養(yǎng)殖尾水

隨著人們對魚蝦需求的逐漸加大和捕撈業(yè)的日漸枯竭, 高密度、集約化的凡納濱對蝦()養(yǎng)殖規(guī)模逐步擴(kuò)大[1-2], 養(yǎng)殖尾水也隨之增加, 而養(yǎng)殖尾水的有效處理、達(dá)標(biāo)排放是近海養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展必須解決的問題之一. 人工濕地利用植物和濕地土對污染物進(jìn)行有效的吸附和降解是海水養(yǎng)殖尾水生態(tài)處理的一種重要方式. 互花米草(Loisel)作為濱海濕地中常見的多年生直立草本植物, 具有耐鹽、耐淤和耐淹的特性, 還能有效減少沿海潮汐侵蝕、消浪促淤[3], 桿葉也可作為餌料或肥料[4], 常被用于海水養(yǎng)殖尾水人工濕地中. 互花米草通過根系分泌物等化感物質(zhì)影響土壤的理化性質(zhì), 進(jìn)而影響微生物的群落結(jié)構(gòu)[5]. 與光灘相比, 互花米草的入侵顯著提高了中國東部濱海濕地土壤細(xì)菌豐度和多樣性, 而土壤細(xì)菌豐度和群落組成主要受pH等理化性質(zhì)的影響[6]; 在河口濕地中互花米草的入侵改變了濕地土壤細(xì)菌的優(yōu)勢菌屬[7]; 黃河口中互花米草的種植改變了沉積物的理化性質(zhì), 有機(jī)碳的含量隨種植年限的增加而增加, 革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的比例顯著增加[8]. 近年來, 隨著研究的不斷深入, 關(guān)于互花米草對濕地沉積物細(xì)菌群落影響的研究越來越廣泛, 但在互花米草對濕地沉積物古菌群落的影響方面尚鮮見報道.

古菌廣泛分布于土壤、海洋、淡水和河口等生境中, 能夠像細(xì)菌一樣利用有機(jī)或無機(jī)電子供體和受體進(jìn)行各類能量代謝, 具有產(chǎn)甲烷、氧化氨或降解有機(jī)物等不同的生理生化功能, 參與碳、氮和硫等元素的生物化學(xué)循環(huán)等. 目前, 關(guān)于古菌在高濃度有機(jī)碳和氮的廢水處理系統(tǒng)的功能研究逐漸增多. 例如, 近年來厭氧消化在處理畜禽糞便和城市廢水等高濃度廢水中得到了廣泛應(yīng)用, 其中的產(chǎn)甲烷古菌則是有機(jī)質(zhì)厭氧消化作用的直接貢獻(xiàn)者[9]. 產(chǎn)甲烷古菌是一類嚴(yán)格厭氧且系統(tǒng)發(fā)育差異極大的古菌[10], 主要分布于濕地[11]、稻田[12]等厭氧環(huán)境中, 它能利用環(huán)境中的有機(jī)質(zhì)為底物, 通過乙酸型、氫型、甲基型、氧甲基型[13]和烷基型[14]多種途徑產(chǎn)生甲烷, 在碳生物地球化學(xué)循環(huán)、可再生能源的利用和全球氣候變暖方面有著突出貢獻(xiàn)[15]. 氨氧化古菌(Ammonia-Oxidizing Archaea, AOA)在自然環(huán)境中的數(shù)量比氨氧化細(xì)菌更高, 最大差別可達(dá)8000倍[16], 是地球上最豐富的氨氧化微生物. 氨氧化古菌具有極高的底物氨親和力和高效的自養(yǎng)固碳途徑, 能夠參與硝化作用氧化環(huán)境中的銨氮轉(zhuǎn)化為植物更易吸收的硝酸鹽, 此過程在緩解養(yǎng)殖廢水氮素污染中具有重要意義[17].

為研究處理海水養(yǎng)殖尾水的人工濕地沉積物中古菌群落的組成與分布, 本文通過高通量測序分析不同位點(diǎn)沉積物的古菌群落組成、多樣性及其與環(huán)境因子的相互關(guān)系, 進(jìn)一步分析與C、N循環(huán)相關(guān)的氨氧化古菌和產(chǎn)甲烷古菌的群落變化, 闡明古菌在人工濕地中的作用, 為人工濕地處理養(yǎng)殖尾水提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域選擇及沉積物采集

互花米草人工濕地位于浙江寧波象山藍(lán)尚海洋科技有限公司的凡納濱對蝦養(yǎng)殖場(N29.72° E121.86°), 對蝦養(yǎng)殖平均產(chǎn)量7375kg?hm-2, 其養(yǎng)殖尾水排出至尾水沉淀池, 固液分離后一部分制成有機(jī)肥應(yīng)用于農(nóng)業(yè), 另一部分經(jīng)濾食性貝類吸收后流入互花米草人工濕地[18]. 根據(jù)養(yǎng)殖尾水的流經(jīng)途徑, 將人工濕地分為流入?yún)^(qū)(E)、中間區(qū)(M)和流出區(qū)(O) 3個區(qū)域, 每個區(qū)域采集沉積物表層(S)、互花米草根際(R)和人工濕地深層(D) 3個位點(diǎn), 每個位點(diǎn)設(shè)置3個平行. 表層沉積物為水土交界面下2cm內(nèi)的土層; 根際沉積物是用無菌水浸洗互花米草根表后形成的泥漿再離心(3000r·min-1, 5 min)得到; 深層沉積物為水土交界面以下40cm的無根區(qū). 樣品收集后保存于-80℃超低溫冰箱, 直至分析.

1.2 沉積物理化指標(biāo)測定

沉積物含水率(moisture)用干重法測定; 水土比5:1混合, 充分震蕩后, 使用pH計(上海精科)測得上清液pH值作為沉積物的pH值; 硝態(tài)氮(NO3-- N)和銨態(tài)氮(NH4+-N)采用2mol·L-1KCl浸提后分別用酚二磺酸比色法和靛酚藍(lán)比色法進(jìn)行測定[19]; 沉積物土樣總氮(TN)和總磷(TP)含量用酸消解法(Smart Chem 200 Discrete Analyzer)進(jìn)行測定; 總有機(jī)碳(TOC)含量采用重鉻酸鉀氧化法進(jìn)行測定.

1.3 DNA提取, PCR擴(kuò)增及高通量測序

稱取0.5g濕重沉積物, 用FastDNA土樣試劑盒(MP Biomedicals, OH, USA)提取DNA, 提取步驟參考說明書. 用16S rRNA基因V3-V4區(qū)通用引物341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R (5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 產(chǎn)物用Takara凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化, NanoDrop測定含量和純度, 等量混合后使用高通量測序(Illumina, USA)平臺進(jìn)行測序.

1.4 Illumina數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)利用QIIME流程進(jìn)行分析, 過濾和拼接低質(zhì)量序列、去嵌合體等質(zhì)控. 流程概括為剪接掉3個以上的連續(xù)且質(zhì)控分小于20的堿基, 保留大于300bp的長序列, 然后用UCHIME去除嵌合體, 用UCLUST在97%的相似性水平聚類為分類操作單元(OTUs).

1.5 統(tǒng)計分析

基于Illumina OTU表, 利用R語言(version 3.6.3)計算每個樣品的α-多樣性指數(shù), 包括香農(nóng)多樣性(Shannon diversity)、Chao1指數(shù); 篩選門水平(相對豐度>1%)、綱水平(相對豐度>1.5%)的古菌群落, 利用Origin (version 2018)繪制堆疊柱狀圖; 差異分析除在表中特殊標(biāo)注外, 均利用單因素方差分析(One-way ANOVA)完成; 篩選目水平中的產(chǎn)甲烷古菌和氨氧化古菌繪制堆積柱形圖; 使用“vegan”包繪制非度量多維尺度分析(NMDS), 比較不同位點(diǎn)沉積物古菌群落差異; 使用“pheatmap”包繪制相關(guān)性熱圖(Heatmap), 分析各優(yōu)勢菌門和優(yōu)勢菌綱與環(huán)境因子的相關(guān)性; 對古菌群落和沉積物環(huán)境因子進(jìn)行冗余分析(RDA)和Mantel檢驗(yàn).

2 結(jié)果與分析

2.1 不同位點(diǎn)沉積物理化性質(zhì)

理化分析結(jié)果(表1)顯示, 各位點(diǎn)沉積物pH均呈弱堿性, 根際沉積物的平均pH值(8.0)高于表層(pH=7.53)和深層(pH=7.35), 但組間差異不顯著(>0.05). 沉積物中NH4+-N、TN和TP的含量均為表層>根際>深層, 且尾水流入?yún)^(qū)表層的含量顯著高于中間區(qū)域和尾水流出區(qū)域表層的含量(<0.05); 根際沉積物中NO3--N的含量高于表層和深層, 但整體含量較低, 且各位點(diǎn)無顯著差異(>0.05). 根際沉積物TOC含量顯著高于其他位點(diǎn)(<0.01).

表1 獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析各位點(diǎn)沉積物環(huán)境因子的差異

注： 數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,=3; 字母不同為組間差異顯著(<0.05); 下表同.

2.2 不同位點(diǎn)沉積物古菌群落組成和多樣性變化

基于沉積物古菌OTUs進(jìn)行Alpha多樣性分析(表2), 從尾水流入?yún)^(qū)到流出區(qū)古菌的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均呈增加趨勢. 流入?yún)^(qū)深層沉積物古菌的Alpha多樣性顯著高于表層和根際沉積物(<0.05), 而在流出區(qū)則表現(xiàn)為根際最高.

表2 沉積物古菌群落多樣性指數(shù)

由圖1(a)可見, 互花米草人工濕地沉積物中存在古菌的7個門類, 包括泉古菌門(Crenarchaeota)、廣古菌門(Euryarchaeota)、奇古菌門(Thaumarcha- eota)、納古菌門(Nanoarchaeaeota)、阿斯加德古菌門(Asgardaeota)、Hadesarchaeaeota和Diapherotrites. 其中, 泉古菌門和廣古菌門是各位點(diǎn)的優(yōu)勢菌群, 共占80%左右. 泉古菌門在各位點(diǎn)的相對豐度占比均在40%以上, 根際沉積物泉古菌門的相對豐度略低于表層和深層沉積物, 但差異并不顯著(>0.05), 而奇古菌門恰好相反(<0.05). 在各區(qū)域位點(diǎn)中廣古菌門的相對豐度沒有顯著差異(>0.05).

在綱水平對古菌群落組成進(jìn)一步分析, 由圖1(b)可見, 主要包括深古菌綱(Bathyarchaeia)、甲烷微菌綱(Methanomicrobia)、熱原體綱(Thermoplas- mata)、亞硝基菌綱(Nitrososphaeria)、烏斯古菌綱(Woesearchaeia)、洛基古菌綱(Lokiarchaeia)和奧丁古菌綱(Odinarchaeia)等. 深古菌綱作為各位點(diǎn)的優(yōu)勢菌綱, 平均相對豐度占總豐度的47%. 甲烷微菌綱、熱原體綱也占有相當(dāng)大的比例, 但組間差異并不顯著(0.05). 亞硝基菌綱在根際沉積物中的相對豐度顯著高于表層和深層沉積物(<0.05).

2.3 不同區(qū)域沉積物古菌群落結(jié)構(gòu)的變化

對各區(qū)域位點(diǎn)沉積物古菌群落進(jìn)行非度量多維尺度(NMDS)分析. 由圖2可見, 古菌群落按不同區(qū)域聚類分布, 不同區(qū)域沉積物古菌群落存在顯著差異(<0.05,2=0.23151). 相較于深層沉積物, 表層和根際沉積物的群落結(jié)構(gòu)相似性更高.

SE: 流入?yún)^(qū)表層沉積物(Surface seidiment of Enter area); RE: 流入?yún)^(qū)根際沉積物(Rhizosphere seidiment of Enter area); DE: 流入?yún)^(qū)深層沉積物(Deep seidiment of Enter area); SM: 中間區(qū)表層沉積物(Surface seidiment of Middle area); RM: 中間區(qū)根際沉積物(Rhizosphere seidiment of Middle area); DM: 中間區(qū)深層沉積物(Deep seidiment of Middle area); SO: 流出區(qū)表層沉積物(Surface seidiment of Outflow area); RO: 流出區(qū)根際沉積物(Rhizosphere seidiment of Outflow area); DO: 流出區(qū)深層沉積物(Deep seidiment of Outflow area); 圖2、圖3和圖5相同.

圖2 非度量多維尺度分析沉積物古菌群落分布

2.4 沉積物古菌群落與環(huán)境因子的相互關(guān)系

對沉積物中的環(huán)境因子和古菌群落進(jìn)行冗余分析. 由圖3可見, 表層沉積物和根際沉積物受環(huán)境因子的影響較大, TP和NH4+-N與表層沉積物呈顯著正相關(guān)(<0.05), TOC和pH與根際沉積物呈顯著正相關(guān)(<0.05). 深層沉積物受養(yǎng)殖尾水的影響較小, 與各環(huán)境因子均無顯著相關(guān)性.

圖3 沉積物古菌群落與環(huán)境因子的冗余分析

為了更深入地探究沉積物古菌群落與環(huán)境因子之間的相互關(guān)系, 對環(huán)境因子進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理, 由Mantel檢驗(yàn)(Mantel test, 置換次數(shù)=999)分析表明, 古菌群落主要受pH、NH4+-N、TOC和TP等環(huán)境因子的影響(<0.05) (表3), 這與圖4的分析結(jié)果相一致.

表3 古菌群落與環(huán)境因子相關(guān)性

基于相關(guān)性熱圖(Heatmap)分析環(huán)境因子對優(yōu)勢古菌門和優(yōu)勢古菌綱的影響(圖4). TOC作為評價環(huán)境中營養(yǎng)指標(biāo)的重要參數(shù), 其與泉古菌門、阿斯加德古菌門、深古菌綱和洛基古菌綱呈較顯著的負(fù)相關(guān); 廣古菌門與NH4+-N和NO3--N呈較顯著的負(fù)相關(guān), 廣古菌門中的熱原體綱也與NH4+-N呈較顯著的負(fù)相關(guān); 奇古菌門和亞硝基菌綱都與pH、TOC和NO3--N呈顯著的正相關(guān), 與奇古菌門不同的是亞硝基菌綱還與TP呈較顯著的正相關(guān).

(1)Crenarchaeota; (2)Euryarchaeota; (3)Thaumarchaeota; (4)Nanoarcha- eaeota; (5)Asgardaeota; (6)Bathyarchaeia; (7)Methanomicrobia; (8)Thermo- plasmata; (9)Nitrososphaeria; (10)Woesearchaeia; (11)Lokiarchaeia; *: P< 0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001.

2.5 氨氧化古菌和產(chǎn)甲烷古菌群落組成及其與環(huán)境因子的相互關(guān)系

為了分析濕地沉積物中參與C、N循環(huán)的功能古菌, 篩選出不同位點(diǎn)沉積物中的氨氧化古菌(AOA), 發(fā)現(xiàn)此濕地沉積物中氨氧化古菌存在于亞硝化侏儒菌目(Nitrosopumilales)、亞硝化球菌目(Nitrososphaerales)和亞硝化桿菌目(Nitrosotaleales) 3個目中. 其中, 亞硝化侏儒菌目為優(yōu)勢氨氧化古菌, 亞硝化球菌目和亞硝化桿菌目則只出現(xiàn)于個別樣品中. 從流入?yún)^(qū)至流出區(qū)的水平方向可見, 各組間亞硝化侏儒菌目的相對豐度差異并不顯著(> 0.05); 從表層到深層的垂直方向可見, 亞硝化侏儒菌目的相對豐度呈R>S>D的趨勢, 其中, RM顯著高于SM和DM(<0.05)(圖5(a)).

目水平下分析不同位點(diǎn)沉積物產(chǎn)甲烷古菌的組成(圖5(b)), 主要包括甲烷八疊球菌目(Methano- sarcinales)、甲烷微菌目(Methanomicrobiales)、馬賽球菌目(Methanomassiliicoccales)、甲烷胞菌目(Me- thanocellales)、甲烷桿菌目(Methanobacteriales)、熱原體目(Thermoplasmatales)和Methanofastidiosales. 其中, 甲烷八疊球菌目和甲烷微菌目為優(yōu)勢產(chǎn)甲烷古菌. 本濕地產(chǎn)甲烷古菌的組成較為豐富, 但各產(chǎn)甲烷古菌在不同區(qū)域和不同位點(diǎn)差異均不顯著(>0.05).

圖5 各位點(diǎn)氨氧化古菌(a)和產(chǎn)甲烷古菌(b)在目水平的相對豐度

基于Pearson相關(guān)性分析了氨氧化古菌和產(chǎn)甲烷古菌與環(huán)境因子的相互關(guān)系. Mantel檢驗(yàn)(Mantel test, 置換次數(shù)=999)分析表明, 氨氧化古菌群落結(jié)構(gòu)與pH、NH4+-N、TN和TP呈顯著正相關(guān)(< 0.01) (表4), 可見產(chǎn)甲烷古菌群落結(jié)構(gòu)與各環(huán)境因子均無顯著相關(guān)性.

表4 氨氧化古菌和產(chǎn)甲烷古菌與環(huán)境因子相關(guān)性

3 討論

3.1 人工濕地對沉積物理化性質(zhì)的影響

研究表明, 凡納濱對蝦養(yǎng)殖尾水中氨氮、總氮和總磷質(zhì)量濃度分別高達(dá)1.8、1.6和1.7 mg?L-1 [20], 而人工濕地凈化養(yǎng)殖尾水是當(dāng)前主要的處理方式之一[18]. 在本文中, 從流入?yún)^(qū)到流出區(qū), NH4+-N、TP和TN含量均呈降低趨勢. 用定植不同植物的濕地處理市政污水和海水養(yǎng)殖尾水, 越靠近出水口, TP、TN和NH4+-N的含量越低[21], 而營養(yǎng)鹽含量的降低是濕地凈化作用的最直接體現(xiàn). 另一方面, 植物作為人工濕地的重要組成部分, 是連接水體和沉積物的關(guān)鍵通道[22]. 互花米草可通過根系分泌物將光合固定產(chǎn)生的碳轉(zhuǎn)移到根際沉積物中[23], 因此, 根際沉積物中TOC的含量顯著高于表層和深層沉積物(<0.05). 濕地植物還可以通過根系釋放氧氣、TOC等有機(jī)質(zhì)和酶, 進(jìn)一步促進(jìn)根際特定微生物的生長[24]. 此外, 濕地植物不僅能直接吸收尾水中的營養(yǎng)元素[25], 還可與微生物構(gòu)成根際微環(huán)境, 共代謝強(qiáng)化去除尾水中的高濃度營養(yǎng)鹽[26].

3.2 沉積物古菌群落組成、分布及其與理化性質(zhì)的相互關(guān)系

本研究結(jié)果表明, 在互花米草濕地沉積物中泉古菌門、廣古菌門和奇古菌門為優(yōu)勢古菌門類(圖1(a)), 這與之前在其他濕地中檢測到的優(yōu)勢古菌基本一致[27-28]. 泉古菌門通常是海洋環(huán)境中占比最高的古菌門[29], 深古菌綱作為泉古菌門的一個分支, 已被確立為一個古菌門類[30], 其在各位點(diǎn)的相對豐度均達(dá)40%以上(圖1(b)). 深古菌是全球碳循環(huán)的重要驅(qū)動者之一, 參與甲烷代謝循環(huán)、產(chǎn)乙酸等多種功能[31]. 本濕地中廣古菌門在各位點(diǎn)的相對豐度沒有顯著差異, 均在30%～40%之間(圖1(a)), 產(chǎn)甲烷古菌基本隸屬本門的甲烷微菌綱和熱源體綱, 其中甲烷微菌綱的甲烷八疊球菌目和甲烷微菌目為優(yōu)勢目. 甲烷八疊球菌目是一類嚴(yán)格厭氧的產(chǎn)甲烷古菌, 可利用多種有機(jī)或無機(jī)化合物為底物產(chǎn)生甲烷, 能夠耐受不同的逆境因子, 環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)[32], 因而有研究者將甲烷八疊球菌固定化用于處理高濃度有機(jī)廢水[33]. 本濕地中產(chǎn)甲烷古菌群落結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定, 與各環(huán)境因子之間均無顯著相關(guān)性, 但其相對豐度占比較高(圖5(b)). 產(chǎn)甲烷古菌的生長繁殖只能利用以碳等有機(jī)物為基質(zhì)的產(chǎn)甲烷代謝獲取能量[34], 可見, 產(chǎn)甲烷代謝過程既能降低沉積物中的高濃度營養(yǎng)鹽, 還有助于沉積物中的甲烷向空氣釋放. 奇古菌門是近年來從泉古菌門中劃分出來的一類中溫泉古菌, 包含大量的氨氧化古菌[35]. 有研究者基于宏基因組分析發(fā)現(xiàn)某些奇古菌的DNA片段含有氨單加氧酶基因[36], 表明它們參與了氨氧化過程. 互花米草濕地氨氧化古菌較少, 而亞硝化侏儒菌目是本濕地中唯一的優(yōu)勢氨氧化古菌類群. 在深層沉積物中亞硝化侏儒菌目的相對豐度最低, 可能是受深層低氧氣含量的限制. 有研究表明, 低氧環(huán)境會抑制亞硝化侏儒菌目的生長, 但其自身能夠產(chǎn)生少量氧氣進(jìn)行氨氧化代謝[37]. 亞硝化侏儒菌目是海水及海洋沉積物的優(yōu)勢氨氧化古菌, 是第一類成功分離培養(yǎng)的氨氧化古菌, 其存在表明該環(huán)境氮代謝活躍[38]. 有大量研究指出pH和NH4+-N是影響氨氧化古菌的重要因素[39-40]. 由圖5(a)可見, 氨氧化古菌的相對豐度分布規(guī)律與pH趨勢相一致. 有研究者對全球范圍內(nèi)的土壤微生物研究發(fā)現(xiàn), 在酸性(pH<5)、中性(5≤pH<7)和堿性(pH>7)土壤中存在不同生態(tài)類型的氨氧化古菌[41], 但多數(shù)氨氧化古菌更適應(yīng)在中性或弱堿性條件下生長[42-43]; 在pH 6～8的土壤中, 氨氧化古菌相對豐度隨pH的增加而增加[41]. 互花米草濕地為弱堿性, 根際的平均pH值(8.0)高于表層平均pH值(7.55)和深層平均pH值(7.35), Mantel檢驗(yàn)分析表明氨氧化古菌與pH呈顯著正相關(guān)(表4), 與文獻(xiàn)結(jié)果類似. 也有研究者指出, 在酸性茶園土壤中的氨氧化古菌與pH值呈顯著負(fù)相關(guān)[44], 這可能是適應(yīng)酸性環(huán)境的氨氧化古菌隨著pH的增加而生長受到抑制. 由于高氨養(yǎng)殖尾水的直排, 導(dǎo)致本濕地表層平均NH4+-N值(129.22mg?kg-1)顯著高于根際平均NH4+-N值(58.09mg?kg-1)和深層平均NH4+-N值(8.12mg?kg-1) (表1), Mantel檢驗(yàn)分析氨氧化古菌群落與NH4+-N呈顯著正相關(guān). 銨氮作為氨氧化過程的底物和氨氧化微生物的能量來源, 顯著影響著氨氧化古菌群落. Verhamme等[45]將土壤分別置于低、中和高氨環(huán)境下培養(yǎng)一個月, 發(fā)現(xiàn)氨氧化古菌在各銨氮條件下均能生長. 更有研究者在NH4+-N質(zhì)量濃度高達(dá)100mg·L-1的污水處理廠中檢測出氨氧化古菌[46], 在NH4+-N質(zhì)量濃度低于5μg·L-1的遠(yuǎn)洋中依然能夠檢測出氨氧化古菌[47]. 氨氧化古菌具有較豐富多樣性, 能在較廣的NH4+-N濃度范圍內(nèi)生長[47]. 相反, 氨氧化古菌也會通過影響沉積物中的環(huán)境因子進(jìn)一步凈化濕地環(huán)境. 氨氧化古菌的生長需要吸收部分氮素作為能量來源, 也能參與硝化作用, 將銨氮轉(zhuǎn)化為硝氮, 供給植物吸收利用. 由于植物吸收有限, 其多余硝酸鹽可通過厭氧呼吸(例如脫氮和氨氧化)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為氮?dú)? 以降低沉積物中的高濃度氨對水生生物的毒性[48]. 本研究中, 根際氨氧化古菌的相對豐度最高, 參與硝化過程的群落也會更多, 這也可能是導(dǎo)致本濕地根際NH4+-N較低, 而NO3--N含量最高的原因之一. 總之, 人工濕地的有效除氮機(jī)制需要以植物和微生物為主導(dǎo).

4 結(jié)論

本研究分析了互花米草人工濕地尾水處理過程中沉積物的古菌群落組成, 比較了不同區(qū)域及不同位點(diǎn)沉積物的古菌群落結(jié)構(gòu), 結(jié)合測定的理化性質(zhì)分析了沉積物古菌群落與環(huán)境因子之間的關(guān)系, 主要研究結(jié)論如下:

(1)互花米草人工濕地能夠有效地脫氮除磷, 增加沉積物有機(jī)碳含量, 在尾水凈化過程中發(fā)揮重要作用.

(2)所研究濕地中的優(yōu)勢古菌為泉古菌門、廣古菌門和奇古菌門. 亞硝化侏儒菌目為沉積物中主要的氨氧化古菌, 其相對豐度呈根際>表層>深層的變化趨勢. pH和NH4+-N是影響氨氧化古菌生長的主要環(huán)境因子, 氨氧化古菌也能參與銨氮轉(zhuǎn)化凈化濕地環(huán)境. 產(chǎn)甲烷古菌群落組成穩(wěn)定, 主要通過自身吸收碳源降低濕地中的高濃度營養(yǎng)鹽.

[1] Yu Q R, Fu Z Q, Huang M X, et al. Growth, physiological, biochemical, and molecular responses of Pacific white shrimpfed different levels of dietary selenium[J]. Aquaculture, 2021, 535(4): 736393.

[2] Cheng Y M, Ge C R, Li W, et al. The intestinal bacterial community and functional potential ofin the coastal areas of China[J]. Micro- organisms, 2021, 9(9):1793.

[3] Zuo P, Zhao S H, Liu C A, et al. Distribution ofsppalong China’s coast[J]. Ecological Engineering, 2012, 40:160-166.

[4] Chung C H, Zhuo R Z, Xu G W. Creation ofplantations for reclaiming Dongtai, China, tidal flats and offshore sands[J]. Ecological Engineering, 2004, 23(3): 135-150.

[5] Callaway R M, Thelen G C, Rodriguez A, et al. Soil biota and exotic plant invasion[J]. Nature, 2004, 427(6976): 731-733.

[6] Yang W, Jeelani N, Zhu Z H, et al. Alterations in soil bacterial community in relation toLoiselinvasion chronosequence in the eastern Chinese coastal wetlands[J]. Applied Soil Ecology, 2019, 135:38- 43.

[7] Zheng J, Li J J, Lan Y Q, et al. Effects ofinvasion on Kandelia candel rhizospheric bacterial community as determined by high-throughput sequencing analysis[J]. Journal of Soils and Sediments, 2019, 19(1):332-344.

[8] Zhang G L, Bai J, Jia J, et al. Shifts of soil microbial community composition along a short-term invasion chronosequence ofin a Chinese Estuary[J]. Science of the Total Environment, 2019, 657:222-233.

[9] Demirel B, Scherer P. The roles of acetotrophic and hydrogenotrophic methanogens during anaerobic conversion of biomass to methane: A review[J]. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology, 2008, 7(2):173-190.

[10] Kvenvolden K A. Potential effects of gas hydrate on human welfare[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1999, 96(7): 3420-3426.

[11] Wu D, Zhao C, Bai H, et al. Characteristics and metabolic patterns of soil methanogenic archaea communities in the high-latitude natural forested wetlands of China[J]. Ecology and Evolution, 2021, 11(15):10396-10408.

[12] Pump J, Pratscher J, Conrad R. Colonization of rice roots with methanogenic archaea controls photosynthesis- derived methane emission[J]. Environmental Micro- biology, 2015, 17(7):2254-2260.

[13] Mayumi D, Mochimaru H, Tamaki H, et al. Methane production from coal by a single methanogen[J]. Science, 2016, 354(6309):222-225.

[14] Zhou Z, Zhang C J, Liu P F, et al. Non-syntrophic methanogenic hydrocarbon degradation by an archaeal species[J]. Nature, 2022, 601(7892):257-262.

[15] Spang A, Caceres E F, Ettema T J G. Genomic exploration of the diversity, ecology, and evolution of the archaeal domain of life[J]. Science, 2017, 357(6351): 3883.

[16] Herrmann M, Saunders A M, Schramm A. Effect of lake trophic status and rooted macrophytes on community composition and abundance of ammonia-oxidizing prokaryotes in freshwater sediments[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(10):3127-3136.

[17] Xie J H, Yan J, He H X, et al. Evaluation of the key factors to dominate aerobic ammonia-oxidizing archaea in wastewater treatment plant[J]. International Biodeterio- ration & Biodegradation, 2021, 164:150289.

[18] 張濤, 史會來, 平洪領(lǐng), 等. “浙江省南美白對蝦(海水)集約化養(yǎng)殖尾水處理現(xiàn)狀”調(diào)研報告[J]. 水產(chǎn)養(yǎng)殖, 2020, 41(3):71-73.

[19] 鮑士旦. 土壤農(nóng)化分析[M]. 3版. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2000:49.

[20] Iber B T, Kasan N A. Recent advances in shrimp aquaculture wastewater management[J]. Heliyon, 2021, 7(11):e08283.

[21] Wong Y S, Tam N F Y, Lan C Y. Mangrove wetlands as wastewater treatment facility: A field trial[J]. Hydrobiologia, 1997, 352:49-59.

[22] Liu F, Sun L, Wan J B, et al. Performance of different macrophytes in the decontamination of and electricity generation from swine wastewater via an integrated constructed wetland-microbial fuel cell process[J]. Journal of Environmental Sciences, 2020, 89(3):252-263.

[23] Bais H P, Weir T L, Perry L G, et al. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms[J]. Annual Review of Plant Biology, 2006, 57(1):233-266.

[24] Brix H. Do macrophytes play a role in constructed treatment wetlands?[J]. Water Science and Technology, 1997, 35(5):11-17.

[25] 熊飛, 李文朝, 潘繼征, 等. 人工濕地脫氮除磷的效果與機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 濕地科學(xué), 2005, 3(3):228-234.

[26] 趙倩, 莊林嵐, 盛芹, 等. 潛流人工濕地中基質(zhì)在污水凈化中的作用機(jī)制與選擇原理[J]. 環(huán)境工程, 2021, 39 (9):14-22.

[27] Tripathi B M, Kim M, Lai-Hoe A, et al. pH dominates variation in tropical soil archaeal diversity and community structure[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2013, 86(2):303-311.

[28] Fan L M, Barry K, Shi L L, et al. Archaeal community compositions in tilapia pond systems and their influencing factors[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2018, 34(3):43.

[29] 陳明明, 王少璞, 韋夢, 等. 象山港網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)沉積物的古菌空間分布[J]. 生態(tài)學(xué)報, 2014, 34(14):4099-4106.

[30] 王風(fēng)平, 周悅恒, 張新旭, 等. 深海微生物多樣性[J]. 生物多樣性, 2013, 21(4):445-456.

[31] Pan J, Zhou Z C, Béjà O, et al. Genomic and transcriptomic evidence of light-sensing, porphyrin biosynthesis, Calvin-Benson-Bassham cycle, and urea production in Bathyarchaeota[J]. Microbiome, 2020, 8(1): 1-12.

[32] Zhi S L, Li Q, Yang F X, et al. How methane yield, crucial parameters and microbial communities respond to the stimulating effect of antibiotics during high solid anaerobic digestion[J]. Bioresource Technology, 2019, 283:286-296.

[33] 楊秀山, 李軍, 田沈,等. 固定化甲烷八疊球菌及處理高濃度有機(jī)廢水研究[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2003, 23(2): 282-284.

[34] Thauer R K. Biochemistry of methanogenesis: A tribute to marjory stephenson[J]. Microbiology, 1998, 144(9): 2377-2406.

[35] Brochier-Armanet C, Boussau B, Gribaldo S, et al. Mesophilic crenarchaeota: Proposal for a third archaeal phylum, the Thaumarchaeota[J]. Nature Reviews Microbiology, 2008, 6(3):245-252.

[36] Yang J, Jiang H, Dong H, et al. amoA-encoding archaea and thaumarchaeol in the lakes on the northeastern Qinghai-Tibetan Plateau, China[J]. Frontiers in Micro- biology, 2013, 4:329.

[37] Kraft B, Jehmlich N, Larsen M, et al. Oxygen and nitrogen production by an ammonia-oxidizing archaeon [J]. Science, 2022, 375(6576):97-100.

[38] Stahl D A, de la Torre J R. Physiology and diversity of ammonia-oxidizing archaea[J]. Annual Review of Microbiology, 2012, 66:83-101.

[39] Hu B L, Liu S, Wang W, et al. pH-dominated niche segregation of ammonia-oxidising microorganisms in Chinese agricultural soils[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2014, 9(1):290-299.

[40] Zhang Y, Chen L J, Dai T J, et al. Ammonia manipulates the ammonia-oxidizing archaea and bacteria in the coastal sediment-water microcosms[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 99(15):6481-6491.

[41] Gubry-Rangin C, Hai B, Quince C, et al. Niche specialization of terrestrial archaeal ammonia oxidizers[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, 108(52):21206-21211.

[42] Tourna M, Stieglmeier M, Spang A, et al., an ammonia oxidizing archaeon from soil[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, 108(20):8420-8425.

[43] Kim J G, Jung M Y, Park S J, et al. Cultivation of a highly enriched ammonia-oxidizing archaeon of thaumar- chaeotal group I.1b from an agricultural soil[J]. Environmental Microbiology, 2012, 14(6):1528-1543.

[44] Yao H Y, Gao Y M, Nicol G W, et al. Links between ammonia oxidizer community structure, abundance, and nitrification potential in acidic soils[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(13):4618-4625.

[45] Verhamme D T, Prosser J I, Nicol G W. Ammonia concentration determines differential growth of ammonia- oxidising archaea and bacteria in soil microcosms[J]. Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology, 2011, 5(6):1067-1071.

[46] Park H D, Wells G F, Bae H, et al. Occurrence of ammonia-oxidizing archaea in wastewater treatment plant bioreactors[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72(8):5643-5647.

[47] Treusch A H, Leininger S, Kletzin A, et al. Novel genes for nitrite reductase and Amo-related proteins indicate a role of uncultivated mesophilic crenarchaeota in nitrogen cycling[J]. Environmental Microbiology, 2005, 7(12): 1985-1995.

[48] Al-Ajeel S, Spasov E, Sauder L A, et al. Ammonia- oxidizing archaea and complete ammonia-oxidizingin water treatment systems[J]. Water Research X, 2022, 15:100131.

Composition and distribution of archaea community in constructed wetland for treatment of mariculture wastewater byLoisel

TAN Ying1, HU Yuehang1, QIAN Yunxia1, GUO Annan2,3*

( 1.School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315832, China; 2.College of Food and Pharmaceutical Sciences, Ningbo University, Ningbo 315832, China; 3.Key Laboratory of Animal Protein Food Deep Processing Technology of Zhejiang Province, Ningbo 315832, China )

The constructed wetland, which planted withLoisel, was used to treat the tail water ofculture. In order to elucidate the composition and distribution of archaea community in wetland sediments and the impact of the rhizosphere, the environmental factors, community structure, diversity of archaea, and their relationship were analyzed in the present study. The results showed that the diversity of archaeal community in the deep sediments was significantly higher than that of surface and rhizosphere sediments. At the phylum level, the dominant archaea were Crenarchaeota, Euryarchaeota and Thaumarchaeota. At the class level, the dominant archaea include Bathyarchaeia, Methanomicrobia and Thermoplasmata. Three kinds of ammonia-oxidizing archaea and seven kinds of methanogenic archaea were found in the constructed wetland at the order level. Non-metric multidimensional scaling (NMDS) analysis showed that the archaeal community in the rhizosphere sediments was significantly (<0.05) different from the deep sediments, but similar with the surface layers. Redundancy analysis (RDA) and Mantel test showed that the main environmental factors affecting the archaeal community included pH, ammonium (NH4+), total organic carbon (TOC) and total phosphorus (TP). The ammonia-oxidizing archaea (AOA) were significantly and positively correlated with pH, NH4+, total nitrogen (TN) and TP (<0.01). The above results showed that artificial planting ofLoiselhad changed the archaeal community of wetland sediments and was important for the treatment of mariculture tailwater.

archaea community;Loisel; sediment; mariculture tailwater

X826

A

1001-5132（2023）03-0001-09

2022?08?25.

寧波大學(xué)學(xué)報（理工版）網(wǎng)址: http://journallg.nbu.edu.cn/

浙江省重點(diǎn)研發(fā)計劃項(xiàng)目（2019C02055）; 寧波市公益項(xiàng)目（202002N3002）.

譚瑩（1997－）, 女, 湖北宜昌人, 在讀碩士研究生, 主要研究方向: 微生物生態(tài). E-mail: tanying199702@163.com

通信作者:郭安南（1980－）, 女, 安徽廬江人, 實(shí)驗(yàn)師, 主要研究方向: 微生物學(xué). E-mail: guoannan@nbu.ed

（責(zé)任編輯 章踐立）