武師良，王昱彤，黨婉怡，韓 迪，王占紅，張曉鷹，楊秋鳳，豆興堂，張立斌，張樹義，尚嵩洋*，鄒麗娜，趙艷嬌，張慶治，方 坤

(1.遼寧省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地建設工程中心，遼寧沈陽 110032；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學動物科學與醫(yī)學學院，遼寧沈陽 110866；3.遼寧省農(nóng)產(chǎn)品出口服務中心，遼寧大連 116000；4.建平縣動物疫病預防控制中心，遼寧朝陽 122400）

驢(Equus asinus），屬奇蹄目、馬科、馬屬，形似馬，多為灰褐色、頭大、耳長、胸部稍窄、四肢瘦弱、軀干長于四肢，呈小長方型；頸項部皮薄肉厚，蹄小堅實；體質健壯，抵抗能力很強。中國馴養(yǎng)驢最早記錄出現(xiàn)在距今約4000 年的銅器時代，隨后進行雜交，因數(shù)量稀少，被定為稀有物種[1-2]。早期養(yǎng)驢主要目的為使役，隨著現(xiàn)代化社會的發(fā)展和農(nóng)業(yè)機械化的普及，自20世紀80 年代起驢的役用價值逐漸減退。驢皮、驢肉等本具有較高產(chǎn)業(yè)價值，但近年來會受到市場及行業(yè)發(fā)展水平的影響，商業(yè)水平較低，導致我國驢的存欄量呈下降趨勢，一些品種面臨滅絕風險[3-5]。

遼寧西部的朝陽市建平縣、阜新市阜新蒙古族自治縣(以下簡稱阜蒙縣）等地區(qū)具有較長的養(yǎng)驢歷史，是我國主要驢養(yǎng)殖地區(qū)，養(yǎng)殖的驢俗稱“遼西驢”，品種多為眼周、嘴部和腹部白色被毛且其余部分為黑褐色被毛的三粉驢，少數(shù)為眼周、嘴部和腹部白色被毛且其余部分為棕灰色被毛體型較小的灰驢[6]?！斑|西驢” 在當?shù)亟?jīng)過多年的繁殖具備一定品種特征，經(jīng)過科學選育有望發(fā)展成為地方改良品種。目前，我國正在開展第三次畜禽遺傳資源普查工作。遼西地區(qū)雖有多年的養(yǎng)驢歷史，但卻未對其養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性進行過評估。微衛(wèi)星標記又稱SSR 分子標記(Simple Sequence Repeat，SSR），是以2～6bp 堿基重復為特征的DNA 序列，廣泛存在于基因組非編碼區(qū)[7]，具有分布廣泛、特異性強、保守性、高度多態(tài)性，高效性等特點，常用于分析不同物種的遺傳多樣性[8,9]。因此，本研究應用13 個SSR分子標記對三個遼西驢群體進行遺傳多樣性分析，以期為遼西驢進一步選育和其種質資源開發(fā)提供助力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗樣本采自建平縣和阜蒙縣，樣本采集時間為2021 年11 月—2022 年3 月，其中建平縣兩個地點分別采集三粉驢50 頭和灰驢17 頭，共兩個群體；阜蒙采集三粉驢32 頭(表1）。實驗使用EDTA 抗凝負壓采血管采集頸靜脈血2mL 或采集含毛囊的頸部鬃毛保存于95%乙醇的離心管中，低溫帶回實驗室用于后續(xù)試驗。

1.2 試劑與儀器

血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒購自天根生化科技有限公司 (北京）提取DNA；Easy Taq MasterMix 擴增酶購自北京全式金生物。儀器：超微量分光光度計(Thermo Fisher Scientific，NanoDrop 2000）、PCR 擴 增儀 (Applied Biosystems，ProFlex PCR systems）、電泳儀 (北京六一生物科技有限公司，DYY-7C）、凝膠成像儀 (北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，ChampGel 5000plus）

1.3 試驗方法

1.3.1 基因組DNA 提取

取200 μL 血液或從鬃毛樣品中取下約20 顆毛囊，根據(jù)試劑盒說明書提取基因組DNA，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗DNA 條帶是否清晰，同時使用超微量分光光度計檢測樣品DNA 的OD值及濃度。將合格樣品分裝于-20℃冰箱保存，用于后續(xù)實驗。

1.3.2 PCR 擴增

本試驗以3 個群體99 頭驢的基因組DNA 為模板，選取國際動物遺傳學會(International Social of Animal Genetic，ISAG）推薦的13 個SSR分子標 記：AHT4，ASB23，HSM2，HMS3，HMS6，HMS7，HMS18，HTG7，HTG10，TKY297，TKY312，TK337，TKY343，通過本試驗室構建的多重PCR 擴增體系獲得3 個遼西驢群體在各個位點上的分型結果[10,11]。

PCR 反應體系如下：PCR 反應體系15 μL，包括1 μL DNA 模板(20～100ng/μL），7.5 μL 2×EasyTaq MasterMix 擴增酶，按最佳劑量添加各位點引物，剩余部分用雙蒸水補足。PCR 程序：95℃預變性3min；95 ℃變性30s，58.5℃退火30s，72℃延伸40s，30 個循環(huán)；最后72℃延伸5min。

1.3.3 毛細管電泳

PCR 擴增產(chǎn)物置于4℃，避光保存，送至生工生物工程(上海）有限公司進行毛細管電泳檢測。樣品采用3730xl DNA 分析儀進行毛細管電泳檢測，使用GeneMapper V4.0 軟件分析各個微衛(wèi)星標記的分型結果。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

等位基因數(shù)(Number of alleles，Na）、有效等位基因數(shù)(Effective number of allele，Ne）、觀測雜合度 (Observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度(Expected heterozygosity，He）、多態(tài)信息含 量 (Polymorphism information content，PIC）使用Genepop V4.2 軟件分析；哈迪溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）使用Cervus V3.0.7 軟件分析；使用PopGene V3.2 軟件計算這4 個群體間Nei's 的遺傳距離，并通過Mega V 7.0.26 軟件利用遺傳距離數(shù)據(jù)建立NJ 聚類樹。

2 結果

2.1 SSR 分子標記多態(tài)性分析

在3 個遼西驢群體的99 個個體中共檢測到93 個等位基因，13 個SSR 分子標記的等位基因數(shù)(Na）范圍是4～11 個，平均為7.1538 個；等位基因數(shù)最多的位點是AHT4 (11 個），最少的位點是HMS6，HMS7 和TKY343 (4 個）；觀測雜合度 (Ho）和期望雜合度 (He）分別為0.2020～0.8384 和0.2210～0.8121，其中位 點AHT4 的Ho 和He 最高分別為0.8384 和0.8121；多態(tài)信息含量(PIC）為0.2080～0.7810，平均值為0.6036，其中高多態(tài)性位點 (PIC≥0.50）有10 個，分別為AHT4、ASB23、HMS2、HMS3、HMS18、HTG7、HTG10、TKY297、TKY312、TKY343；中度多態(tài)性位點 (0.25≤PIC＜0.50）有2 個分別為HMS6 和TKY337；低多態(tài)性位點(PIC＜0.25）有一個為HMS7 (見表2）。13 個位點中只有位點HMS7 偏離哈迪溫伯格平衡(＜0.05）。

表2 13 個微衛(wèi)星位點遺傳多樣性參數(shù)

2.2 群體遺傳多樣性分析

由表3 可知，3 個群體的平均等位基因數(shù)為5.3077～6.6920，平均值為5.9230，建平灰驢平均等位基因數(shù)最低(5.3077），建平三粉驢平均等位基因數(shù)最高(6.6920）；觀測雜合度平均值為0.6331，建平三粉驢最高(0.6585），建平灰驢最低(0.6063）；3 個群體的期望雜合度平均值為0.6474，建平三粉驢最高(0.6508），阜蒙三粉驢最低(0.6424）；多態(tài)信息含量平均值為0.5917，建平三粉驢最高(0.6026），建平灰驢群體最低

表3 3 個群體的遺傳多樣性水平

(0.5849）。

2.3 遺傳距離

由表4 可知，3 個群體的遺傳距離和遺傳相似度分別為0.0254～0.0457 和0.9554～0.9749，兩個三粉驢群體的遺傳距離最小(0.0254）遺傳相似度最高(0.9749）；阜蒙三粉驢和建平灰驢的遺傳距離最大 (0.0457），遺傳相似度最低(0.9554）。根據(jù)Nei's 遺傳距離構建3 個群體的NJ 聚類樹。如圖1 所示，3 個群體分為兩支，建平灰驢獨立為一支，建平三粉驢群體與阜蒙三粉驢聚為一支。

圖1 根據(jù)Nei's 遺傳距離構建的NJ 聚類樹

表4 3 個群體的Nei's 遺傳距離（對角線以下）與遺傳相似度（對角線以上）

3 討論

本研究使用國際動物遺傳學會(ISAG）推薦的13 個SSR 分子標記利用多重PCR 技術對遼寧西部地區(qū)三個驢群體進行遺傳多樣性分析。在應用SSR 分子標記對德州驢、廣靈驢、津南驢等不同品種進行的遺傳多樣性研究時，研究人員多使用每個標記單獨擴增的方法進行檢測，試驗效率相對較低，成本較高[13-18]。而本研究采用了多重PCR 技術，可通過1 次PCR 反應獲得13 個SSR分子標記的分型結果，相比于每個位點單獨擴增的方法顯著提高了試驗效率[11]。

Botstein 等[19]提出用PIC 來衡量位點的多態(tài)性，PIC 值越高位點的多態(tài)性越高。遼西地區(qū)3個群體13 個位點的多態(tài)信息含量為0.2080～0.7810，平均值為0.6036，范圍與Zeng 等[18]應用25 個SSR 分子標記對我國多個驢品種進行遺傳多樣性分析的研究結果相近(PIC 值為0.1489～0.8670）。本研究13 個SSR 標記的PIC 平均值結果略高于劉艷艷等[13]所研究的兩個德州驢群體(PIC 平均值0.47），這可能與檢測的群體以及SSR 分子標記的選擇不同有關。本研究使用的13個SSR 分子標記中有10 個SSR 標記屬于高度多態(tài)性(PIC≥0.50），2 個SSR 標記屬于中度多態(tài)性(0.25≤PIC＜0.50），1 個SSR 標記HMS7 屬于低多態(tài)性(PIC<0.25），高度多態(tài)性位點占比92.31%，因此這些位點可以用于驢群體遺傳多樣性分析。

遺傳雜合度又稱基因多樣度，是用于評估群體遺傳多樣性的重要指標，其值越高表明種群的遺傳多樣性、遺傳變異、穩(wěn)定程度越高[20]。一個群體的雜合度大于0.5，說明該群體遺傳多樣性豐富[21]。本研究所選擇的13 個SSR 分子標記中，11 個位點 雜合度大于0.5 (AHT4，ASB23，HSM2，HMS3，HMS18，HTG7，HTG10，TKY297，TKY312，TK337，TKY343），說明這些位點可以提供較大的信息，利于遼西地區(qū)3 個驢群體的遺傳多樣性分析。本研究中遼西地區(qū)3個群體的期望雜合度為0.6424～0.6508，期望雜合度最高為建平三粉驢，最低為阜蒙三粉驢。Di等[17]2017 年收集5 個中國本土驢群體，He 為0.68～0.73；Zeng 等[18]2020 年收集20 個中國本土驢群體，He 為0.6315～0.6999 均與本研究結果相似，說明遼西地區(qū)三個驢種群平均雜合度較高。

分析遼寧西部地區(qū)3 個群體(建平三粉驢、阜蒙三粉驢、建平灰驢）間的遺傳距離可以發(fā)現(xiàn)，建平三粉驢與阜蒙三粉驢間的遺傳距離最小(0.0254）遺傳相似度最高(0.9749），表明建平三粉驢與阜蒙三粉驢間的遺傳分化很小；建平灰驢與建平三粉驢和阜蒙三粉驢的遺傳距離分別為0.0409 和0.0457，遺傳相似度分別為0.9600 和0.9554，說明建平灰驢與另兩個群體間存在一定的遺傳分化。

4 結論

本研究使用國際動物遺傳學會推薦的13 個用于驢的SSR 分子標記對3 個遼西地區(qū)驢群體進行遺傳多樣性分析，結果表明3 個群體具有很高的遺傳多樣性及遺傳雜合度，建平灰驢與建平三粉驢和阜蒙三粉驢存在一定程度的遺傳分化。本研究的結果可為遼寧西部地區(qū)驢遺傳育種和種質資源保護及開發(fā)提供理論依據(jù)。