李秋紅，夏穎穎，崔強(qiáng), ，孫學(xué)謙, ，李樹，夏尚磊,

1.山東西王糖業(yè)有限公司技術(shù)中心（鄒平 256209）；2.山東省玉米生物加工循環(huán)經(jīng)濟(jì)工程技術(shù)研究中心（鄒平 256209）；3.山東大學(xué)海洋學(xué)院（威海 264209）

玉米低聚肽粉是以玉米蛋白為原料，用酶（蛋白酶）解法生產(chǎn)，以相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000的低聚肽為主要成分的粉末狀產(chǎn)品。玉米低聚肽營養(yǎng)豐富，有易吸收、易溶解、熱穩(wěn)定、天然安全等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品[1]、保健品[2]、工業(yè)制造、煙草制品、化妝品、飼料[3]、醫(yī)藥[4-5]等領(lǐng)域。國外對(duì)肽類的研究較多，早在20世紀(jì)40年代就已出現(xiàn)有關(guān)肽類應(yīng)用的研究報(bào)道[7-9]。在國內(nèi)，玉米低聚肽的研究起步較晚，但是發(fā)展迅速[10-13]。隨著基因組研究工作深入發(fā)展，玉米肽的研制及開發(fā)生產(chǎn)成為各大領(lǐng)域新興產(chǎn)業(yè)的發(fā)展方向。國內(nèi)外玉米低聚肽研究均以烘干后的蛋白粉為原料，經(jīng)過高溫烘干后的蛋白粉用蛋白酶水解后，水解度較低。為提高蛋白水解度并實(shí)現(xiàn)蛋白在玉米淀粉生產(chǎn)線上完成水解的目的，試驗(yàn)以玉米濕蛋白為原料，采用適合生產(chǎn)條件的酸性蛋白酶，對(duì)影響蛋白酶作用的因素進(jìn)行研究優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米濕蛋白（山東西王糖業(yè)有限公司）；酸性蛋白酶（118 000 U/mL，百斯杰生物工程有限公司）；HCl、NaOH（山東宏川化工有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

JOAN 1 mL移液槍（杭州天?；x器）；PHB-3 pH計(jì)（上海三信儀表廠）；WAY-ZT阿貝折光儀（上海精科儀器廠）；BSA224S分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；DK-98-Ⅰ四孔電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；JJ-1定時(shí)電動(dòng)攪拌器（江蘇市中大儀器廠）；J-E離心機(jī)（美國貝克曼）；KDY-04C定氮儀（北京金北德工貿(mào)有限公司）；GX-05A高速萬能粉碎機(jī)（上海隆拓儀器設(shè)備有限公司）；60目（約0.250 mm）不銹鋼篩（新鄉(xiāng)市千振機(jī)械有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 玉米濕蛋白前處理

取淀粉廠過濾板框工段玉米濕蛋白濾餅，用高速萬能粉碎機(jī)粉碎，過0.250 mm（60目）篩，篩下物備用。

1.3.2 水解度（DH）的計(jì)算[14]

式中：N0為反應(yīng)前玉米蛋白液中可溶性蛋白含量，%；N1為酶解后酶解液中可溶性蛋白含量，%；N2為玉米濕蛋白中總蛋白含量，%。蛋白含量用定氮儀檢測。

1.3.3 底物濃度對(duì)DH的影響

玉米濕蛋白和純水按一定比例添加，配制干基底物濃度分別為5%，10%，15%和20%的溶液，pH 3.8（玉米濕蛋白加水后pH，未調(diào)節(jié)），加酶量10%（干基質(zhì)量），反應(yīng)溫度50 ℃，攪拌，反應(yīng)周期24 h。水解結(jié)束后料液以5 000 r/min、15 min離心處理，測定離心上清液蛋白含量。

1.3.4 反應(yīng)pH對(duì)DH的影響

玉米濕蛋白干基質(zhì)量濃度10%，pH分別調(diào)節(jié)為3.5，3.8，4.0和4.5，加酶量10%（干基質(zhì)量），反應(yīng)溫度50 ℃，攪拌，反應(yīng)周期24 h。水解結(jié)束后料液以5 000 r/min、15 min離心處理，測定離心上清液蛋白含量。

1.3.5 蛋白酶加酶量對(duì)DH的影響

玉米濕蛋白干基質(zhì)量濃度10%，pH 3.8，加酶量分別為玉米濕蛋白干基質(zhì)量的3%，5%，8%，10%，12%和15%，反應(yīng)溫度50 ℃，攪拌，反應(yīng)周期24 h。水解結(jié)束后料液以5 000 r/min、15 min離心處理，測定離心上清液蛋白含量。

1.3.6 反應(yīng)溫度對(duì)DH的影響

玉米濕蛋白干基質(zhì)量濃度10%，pH 3.8，加酶量10%，反應(yīng)溫度分別設(shè)置為40，45，50，55，60和65℃，攪拌，反應(yīng)周期24 h。水解結(jié)束后料液以5 000 r/min、15 min離心處理，測定離心上清液蛋白含量。

1.3.7 反應(yīng)周期對(duì)DH的影響

玉米濕蛋白干基質(zhì)量濃度10%，pH 3.8，加酶量10%，反應(yīng)溫度50 ℃，攪拌，反應(yīng)周期分別為6，12，18和24 h。水解結(jié)束后料液按5 000 r/min、15 min離心處理，測定離心上清液蛋白含量。

1.3.8 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，底物濃度、pH、加酶量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)周期選擇不同的水平，見表1，對(duì)玉米濕蛋白的水解條件進(jìn)行優(yōu)化。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L16(45)

2 結(jié)果與討論

2.1 底物濃度對(duì)DH的影響

由圖1可以看出，隨著反應(yīng)底物濃度的增加，蛋白酶對(duì)玉米濕蛋白的水解度降低，可能是因?yàn)橛衩诐竦鞍撞豢扇埽诜磻?yīng)體系中以混懸狀態(tài)存在，隨著底物濃度的增加，體系流動(dòng)性較差，不利于蛋白的分散，酶與底物的接觸概率也逐漸減少，使得相同的反應(yīng)周期內(nèi)，底物濃度越高的體系，酶對(duì)蛋白的水解度越低[15]。雖然底物濃度低有利于提高酶對(duì)蛋白的水解度，但是底物濃度高，單位時(shí)間內(nèi)處理的原料越多，產(chǎn)品收率高，有利于產(chǎn)能的增加，經(jīng)濟(jì)效益就越高。綜合考慮經(jīng)濟(jì)效益和酶的水解效率，最終選定的合適的底物濃度為10%。

圖1 底物濃度對(duì)DH的影響

2.2 反應(yīng)pH對(duì)DH的影響

由圖2可以看出，pH在3.5~3.8范圍內(nèi)，隨著pH的升高，蛋白酶對(duì)蛋白的水解程度增加，pH 3.8左右時(shí)，蛋白酶對(duì)玉米濕蛋白的水解效率最好，水解度可達(dá)50.6%。但是pH高于3.8時(shí)，隨著pH的升高，酶的水解效率降低，說明pH與酶的活性密切相關(guān)。生產(chǎn)過程中的玉米濕蛋白混懸液pH一般在3.5~4.0之間，所以為了完成玉米蛋白的在線分解，使得酶適應(yīng)玉米蛋白生產(chǎn)線，酶解過程采用酸性蛋白酶，過程中可以不用調(diào)節(jié)pH，既可節(jié)約輔料投入成本，又能減少后續(xù)凈化工序的負(fù)擔(dān)。

圖2 pH對(duì)DH的影響

2.3 蛋白酶加酶量對(duì)DH的影響

由圖3可以看出，反應(yīng)底物濃度10%時(shí)，隨著加酶量的增加，單位物料接觸到的蛋白酶越多，對(duì)蛋白的水解速度和效率增加，所以加酶量越高，玉米蛋白的水解程度越高。但是蛋白酶的售價(jià)普遍較高，加酶量增加，意味著酶投入成本增加。綜合考慮酶成本與水解度，最終選定的玉米蛋白水解的加酶量為10%，此時(shí)水解度可達(dá)51.6%。

圖3 加酶量對(duì)DH的影響

2.4 反應(yīng)溫度對(duì)DH的影響

由圖4可以看出，隨著溫度的升高，酶的運(yùn)動(dòng)速度增加，與蛋白接觸的概率增加，玉米蛋白的水解度增加，反應(yīng)溫度50 ℃時(shí)水解度達(dá)到最高53.6%。反應(yīng)溫度45~50 ℃時(shí)水解度變化不大，但是溫度繼續(xù)升高時(shí)，維持溫度所需的能耗增加，并且酸性蛋白酶的酶活失效加快，玉米濕蛋白的水解度反而降低。所以確定玉米蛋白的水解溫度50 ℃為宜。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)DH的影響

2.5 反應(yīng)周期對(duì)DH的影響

由圖5可以看出，反應(yīng)周期越長，蛋白酶對(duì)蛋白分子的作用時(shí)間越長，玉米濕蛋白的水解程度越高，說明酸性蛋白酶對(duì)玉米蛋白的水解效率比較低下，需要靠反應(yīng)時(shí)間的延長增加水解度。但是反應(yīng)周期的延長會(huì)增加相應(yīng)的能耗。綜合考慮節(jié)能降耗和蛋白水解度，最終確定的反應(yīng)周期為24 h。

圖5 反應(yīng)周期對(duì)DH的影響

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可以看出，各個(gè)因素對(duì)水解度的影響從大到小：加酶量＞底物濃度＞反應(yīng)周期＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)pH，最優(yōu)組合為加酶量10%，底物濃度6%，反應(yīng)周期28 h，反應(yīng)pH 3.6，反應(yīng)溫度50 ℃。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.7 正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

驗(yàn)證試驗(yàn)共進(jìn)行3次，以正交試驗(yàn)最優(yōu)組合為反應(yīng)條件，對(duì)玉米濕蛋白進(jìn)行水解反應(yīng)，最終水解度分別為72.29%，72.24%和72.30%，均高于正交試驗(yàn)最高結(jié)果71.12%，說明經(jīng)過試驗(yàn)研究得到的最優(yōu)水解條件結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

以玉米濕蛋白為原料，采用酸性蛋白酶進(jìn)行水解，最優(yōu)的水解條件為加酶量10%，底物濃度6%，反應(yīng)周期28 h，反應(yīng)pH 3.6，反應(yīng)溫度50 ℃。此條件下得到的蛋白水解液干物濃度12.5%，水解液中蛋白含量60.72%，玉米濕蛋白水解度72.30%。水解液脫苦、脫色后[16]，可溶性蛋白提純、冷凍干燥[17-19]，可得到玉米低聚肽產(chǎn)品。