唐坤鵬，呂嘉琪，文 壇，張春青，馬夢娜，任華山，閆麗萍

（山西中醫(yī)藥大學，山西 晉中 030619）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）作為一種腸道慢性非特異性炎癥性疾?。?］。其病程較長，病勢纏綿難愈，常表現(xiàn)為急性發(fā)作期與慢性緩解期交替進行。近年來，在我國的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增長趨勢，且多見于青少年［2］。目前，普遍認為其發(fā)病與腸道炎癥、穩(wěn)態(tài)平衡破壞、免疫反應失調(diào)和上皮屏障受損等因素密切相關［3，4］。研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol3 kinase ，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路可通過對于炎癥介質(zhì)及炎性細胞的調(diào)控，介導由免疫異常所致的炎癥反應，在緩解結(jié)腸炎癥中起到重要作用。

大量研究證實，電針可通過多環(huán)節(jié)、多靶點對IBD 臨床癥狀及腸道炎癥進行有效的控制，且具有低副作用、低復發(fā)、長期療效好等優(yōu)勢，已經(jīng)逐漸成為補充或替代藥物治療的重要輔助手段［5］。天樞、大腸俞、足三里、上巨虛4 穴是針灸治療IBD 使用頻率較高的特定穴，對于IBD 皆具有良好的的治療作用［6］。本課題組前期實驗研究發(fā)現(xiàn)［7，8］，電針以上4穴對于急/慢結(jié)腸炎大鼠血清IL-6 及髓過氧化物酶（MPO）含量的調(diào)節(jié)具有相對差異，但對其具體作用機制尚未闡明。因此，本實驗基于對PI3K/Akt/mTOR 信號通路中相關蛋白含量及炎性因子的檢測，進一步探討電針刺激此4 組特定穴對腸道慢性炎癥的效應差異及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

清潔級6 周齡SD 大鼠60 只，雌性各半，體重（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司［許可證號：SCXK（京）2016-0006］，分籠飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學科研實驗中心清潔級動物房，溫度為（24±2）℃，相對濕度為50%～60%，光照周期模擬晝夜循環(huán)12/12 h。自由攝食飲水，適應性喂養(yǎng)一周后將SD 大鼠隨機分為正常組、模型組、天樞組、大腸俞組、足三里組、上巨虛組，每組10 只大鼠。本實驗方案經(jīng)山西中醫(yī)藥大學倫理委員會同意并批準（倫理編號：2018DW181）。

1.2 主要試劑與儀器

Sigma 完全弗氏佐劑（CFA，F(xiàn)5881），超敏ECL發(fā)光液（北京索萊寶科技有限公司，貨號MA0186-1），trizol（美國 Ambion 公司，190906）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa 公司，RR047A），BCA 蛋白濃度測定試劑盒、PCR 試劑盒（上海Beyotime 公司，P0012S，D7281S）；PMSF 蛋白酶抑制劑，SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液5×（武漢Bosterbio，批號分別為AR1179，AR1112），大鼠IL-17，IL-23，IL-10ELISA 試劑盒（武漢BOSTER 工程有限公司，批號分別為EK0431，EK0866，EK0417），PI3K 抗體，磷酸化（p）-PI3K，Akt 抗體；p-Akt 抗體，mTOR抗體，p-mTOR 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司，批號分別為 4292S，4228S，4691S，4060S，2983S，5536S）；羊抗兔IgG-HRP，β-action 鼠抗（北京博奧生物技術(shù)有限公司），彩色PAGE 快速凝膠試劑盒（愛必信生物科技有限公司，貨號abs9367，abs9365）。

華佗牌SDZ-Ⅱ型電子針療儀，一次性無菌針灸針（北京中研太和），高速冷凍離心機（曦瑪離心機有限公司），酶標儀（美國BioTek，型號ELX808），T100TMThermal Cycler 型實時熒光定量PCR 儀，Tanon5200 化學發(fā)光成像儀（美國Bio Tek 公司），DYY-6C 型電泳儀（北京六一）。

1.3 模型制備

采用免疫復合致敏法［9］制備慢性結(jié)腸炎大鼠模型，取家兔結(jié)腸黏膜加入適量0.9%氯化鈉溶液制成勻漿液，經(jīng)離心后取上清液存放于-80℃冰箱中。造模時，將抗原上清液體與CFA 同等比例混合制備為抗原乳化液并分別在大鼠足跖（第3 天）、足趾（第10 天）、背部皮下（第17 天）、腹股溝（第24 天）、腹腔內(nèi)（第31 天）注射抗原乳化液8 mg，至大鼠血清中抗兔結(jié)腸抗體達到一定效價時，將模型組與各腧穴治療組大鼠禁食不禁水24 h 后采用2%戊巴比妥鈉（3 mL/kg）行腹腔麻醉，用軟導管將2%福爾馬林液灌腸并留置60 min，用生理鹽水沖洗后用抗原液不加CFA 再次灌腸并留置2 h，隨后用生理鹽水再次沖洗，完成造模。每組隨機抽取1 只大鼠進行結(jié)腸標本病理學檢查，以驗證造模是否成功［10］。正常組皆用生理鹽水替代造模試劑并按上述方法平行操作。

1.4 干預方法

穴位定位參照《實驗針灸學》［11］，電針雙側(cè)“天樞（ST25）”、“大腸俞（BL25）”、“足三里（ST36）”、“上巨虛（ST37）”腧穴，各腧穴治療組均使用規(guī)格為0.18×25 mm 毫針直刺5 mm，同側(cè)穴位連接同對電極，頻率為2 Hz/50 Hz，強度2 mA，以大鼠肌肉或針柄微顫為宜，20 min/次，每日1 次，于造模成功后開始治療，干預10 d?？瞻捉M、模型組只給與同等時間以相同方式進行固定。

1.5 取材及指標檢測

所有大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉（3 mL/kg）行腹腔深度麻醉后，充分暴露腹腔進行腹主動脈采血，經(jīng)離心后置于-20℃冰箱留存以備ELISA 檢測；經(jīng)頸椎脫臼法處死大鼠后截取結(jié)腸組織，經(jīng)生理鹽水沖洗干凈后，一部分放入組織固定液常溫下保存以待病理組織學觀察，一部分經(jīng)液氮速凍后即置于-80℃冰箱保存，以備PCR 及Western blot 檢測。

1.5.1 HE 染色觀察大鼠結(jié)腸黏膜損傷及組織病理形態(tài) 結(jié)腸組織依次經(jīng)4%組織固定液固定、脫水、透明、石蠟浸潤包埋后，切制成厚度為4 μm 的石蠟切片，再經(jīng)60 ℃溫箱烘烤，脫蠟，染色，漂洗，脫水后經(jīng)中性樹脂封片。40 倍光鏡下觀察結(jié)腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.5.2 ELISA 法檢測大鼠血清中IL-23、IL-17、IL-10 水平 將離心后的大鼠血液上清經(jīng)解凍后，嚴格按照ELISA 試劑盒說明書的步驟對慢性結(jié)腸炎大鼠血清中相關炎性因子進行含量檢測。實驗完畢后將酶標儀調(diào)至450 nm 波長，測量各孔吸光度值，做出標準曲線，計算各樣品濃度。

1.5.3 Real-time PCR 檢測結(jié)腸組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA 表達 使用TRIzol 試劑提取結(jié)腸總RNA，將RNA 反轉(zhuǎn)成cDNA，隨后進行PCR 擴增。反應程序：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃34 s，72 ℃30 s，共40 個循環(huán)，反應結(jié)束后采集溶解曲線統(tǒng)計Ct 值。各引物由通用生物技術(shù)有限公司設計合成，引物序列列于表1 中。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.5.4 Western blot 檢測結(jié)腸組織中PI3K/p-PI3k、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 蛋白表達 將預先凍存的結(jié)腸組織剪取100 mg 于液氮中研磨，依據(jù)重量按比例依次加入RIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑置于冰中低溫均漿，待蛋白充分裂解后離心提取蛋白上清液，使用BCA 法對樣本進行蛋白定量，確定上樣量后煮沸蛋白使其變性冷卻后置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。依?jù)所測蛋白量的大小進行配膠、上樣，繼而在電泳液、電解液中電泳與轉(zhuǎn)膜，經(jīng)洗膜、封閉、再次洗膜后，加入一抗PI3K，p-PI3k，p-Akt，Akt，p-mTOR，mTOR 及β-actin（1∶1 000，1∶500，1∶2 000，1∶1 000，1∶1 000，1∶1 000，1∶1 000）于4 ℃孵育過夜。次日在二抗溶液（1∶5 000）中室溫孵育2 h，洗膜后在條帶上滴入ECL 發(fā)光液顯色曝光，運用ImageJ 軟件進行分析，按目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值計算相對數(shù)值。

1.6 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)使用 SPSS26.0 統(tǒng)計軟件分析，以均數(shù)±標準差（±s）表示。所有數(shù)據(jù)均進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗。組間比較采用單因素方差分析繼以 LSD-t 法進行兩兩比較。P＜0.05 差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠造模后一般狀況

造模前各組大鼠各項體征均正常并無明顯差異且毛色光潔亮麗，反應敏捷，精神狀態(tài)良好。在造模過程中大鼠體重下降較為緩和，逐漸出現(xiàn)懶動毛豎，糞便稀溏等癥狀，嗜睡及扎堆現(xiàn)象比較嚴重，造模結(jié)束后各造模組大鼠出現(xiàn)肛周污穢及部分大鼠出現(xiàn)肉眼血便及黑便等現(xiàn)象。經(jīng)電針干預后各腧穴組與模型組相比各項癥狀均有所改善，如黑便及血便減少或消失，飲食及體重增加顯著等。

2.2 各組大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)學比較

組織學切片顯示，空白組大鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)完整，無任何炎癥、壞死或組織損傷跡象；模型組大鼠結(jié)腸黏膜在造模成功后大量的炎性細胞浸潤至黏膜下層、肌層，黏膜各層界限不清晰，腸腺壞死、萎縮；經(jīng)電針治療后各腧穴治療組結(jié)腸黏膜損傷較模型組各項炎性反應均減輕，黏膜上皮損傷有所修復，其中上巨虛組較其余腧穴治療組結(jié)腸黏膜炎癥損傷更為減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織鏡下觀察（HE，×40）Fig 1 Colon tissue observation under microscope in each group of rats （HE，× 40）

2.3 各組大鼠血清中IL-23、IL-17 及IL-10 水平的比較

與正常組相比，模型組大鼠血清IL-23，IL-17 水平均明顯升高，IL-10 水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組相比，天樞、大腸俞、足三里、上巨虛組大鼠血清IL-23，IL-17 水平均明顯降低，IL-10 水平明顯升高（P＜0.01）；其中，上巨虛組與天樞、大腸俞、足三里組相比，大鼠血清中IL-23，IL-17 水平顯著降低（P＜0.05），IL-10 水平顯著升高（P＜0.01）；天樞組、大腸俞組、足三里之間相比較，大鼠血清中IL-23，IL-17，IL-10 上升或下降水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清中IL-23，IL-17 及IL-10 水平比較（pg/mL，±s，n=9）Tab 2 Comparison of IL-23，IL-17，and IL-10 levels in serum of rats in each group（pg/mL，±s，n=9）

表2 各組大鼠血清中IL-23，IL-17 及IL-10 水平比較（pg/mL，±s，n=9）Tab 2 Comparison of IL-23，IL-17，and IL-10 levels in serum of rats in each group（pg/mL，±s，n=9）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與上巨虛組比較，△P＜0.05,△△P＜0.01。

IL-10 99.34±2.57 65.38±2.83**77.72±7.43##△△79.43±3.23##△△78.80±3.76##△△89.88±3.13##69.78＜0.000 1組別正常組模型組天樞組大腸俞組足三里組上巨虛組FP IL-23 34.14±4.16 102.40±8.88**69.48±6.14##△70.61±15.31##△71.01±9.70##△55.68±8.82##49.85＜0.000 1 IL-17 10.50±0.63 39.57±1.22**17.48±1.69##△24.42±1.45##△23.04±1.46##△17.17±0.85##60.776＜0.000 1

2.4 各組大鼠結(jié)腸組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA 表達的比較

與正常組相比，模型組結(jié)腸組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA 表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，各腧穴電針干預組結(jié)腸組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA 表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；其中，上巨虛組與天樞、大腸俞、足三里組相比，結(jié)腸組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA 表達明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）；天樞組、大腸俞組、足三里組間相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠結(jié)腸組織PI3K，Akt，mTOR mRNA 相對表達量比較（±s，n=9）Tab 3 Comparison of relative expression levels of PI3K，Akt，mTOR mRNA in colon tissue of rats in each group（±s，n=9）

表3 各組大鼠結(jié)腸組織PI3K，Akt，mTOR mRNA 相對表達量比較（±s，n=9）Tab 3 Comparison of relative expression levels of PI3K，Akt，mTOR mRNA in colon tissue of rats in each group（±s，n=9）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05,##P＜0.01；與上巨虛組比較，△P＜0.05,△△P＜0.01。

mTOR mRNA 0.86±0.33 2.49±0.14**1.58±0.26##△1.67±0.10##△1.64±0.18##△1.00±0.14##23.73＜0.000 1組別正常組模型組天樞組大腸俞組足三里組上巨虛組FP PI3K mRNA 1.02±0.26 5.41±0.53**3.39±0.51##△3.94±0.36#△△4.10±0.67#△△2.13±0.12##36.14＜0.000 1 Akt mRNA 1.01±0.17 2.54±0.04**1.55±0.10##△1.69±0.18##△△1.71±0.07##△△1.07±0.32##31.21＜0.000 1

2.5 各組大鼠結(jié)腸組織中p-PI3k/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 蛋白相對表達量的比較

與正常組相比，模型組結(jié)腸組織中p-PI3k、p-Akt、p-mTOR 蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，各腧穴電針干預組大鼠結(jié)腸組織中p-PI3k、p-Akt、p-mTOR 蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.01）；其中，上巨虛組與天樞、大腸俞、足三里組相比，結(jié)腸組織中p-PI3k、p-Akt、p-mTOR蛋白相對表達量明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）；天樞組、大腸俞組、足三里組間相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖2，表4。

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織中p-PI3k，PI3K，p-Akt，Akt，p-mTOR，mTOR 蛋白表達Fig 2 Expression of p-PI3k，PI3K，p-Akt，Akt，p-mTOR，mTOR proteins in colon tissue of rats in each group

表4 各組大鼠結(jié)腸組織中p-PI3k/PI3K，p-Akt/Akt，p-mTOR/mTOR 蛋白相對表達量的比較（±s，n=9）Tab 4 Comparison of relative expression levels of p-PI3k/PI3K，p-Akt/Akt，and p-mTOR/mTOR proteins in colon tissues of rats in each group（±s，n=9）

表4 各組大鼠結(jié)腸組織中p-PI3k/PI3K，p-Akt/Akt，p-mTOR/mTOR 蛋白相對表達量的比較（±s，n=9）Tab 4 Comparison of relative expression levels of p-PI3k/PI3K，p-Akt/Akt，and p-mTOR/mTOR proteins in colon tissues of rats in each group（±s，n=9）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與上巨虛組比較，△P＜0.05,△△P＜0.01。

組別正常組模型組天樞組大腸俞組足三里組上巨虛組FP p-PI3K/PI3K 0.39±0.05 1.66±0.14**0.81±0.07##△0.96±0.24##△△0.92±0.11##△△0.46±0.05##37.77＜0.000 1 p-Akt/Akt 0.11±0.03 1.95±0.46**0.89±0.10##△1.11±0.24##△△0.80±0.09##△0.18±0.05##28.44＜0.000 1 p-mTOR/mTOR 0.27±0.03 1.31±0.23**0.70±0.09##△0.78±0.10##△0.82±0.05##△△0.38±0.06##54.836 0.000

3 討論

中醫(yī)古籍文獻中并無炎癥性腸病的專屬病名，依據(jù)其相關癥狀表現(xiàn)歸屬中醫(yī)“腸澼”、“泄瀉”、“痢疾”、“便血”等病范疇［12］。中醫(yī)學認為本病屬于內(nèi)外合因，本虛標實之證［13］。本因素體脾胃虛弱，運化功能失調(diào)，復感濕熱之邪侵犯腸腑，氣血壅滯，脂膜血絡受損合而發(fā)?。?4］。其病位在大腸，但與脾胃密切相關，病變?nèi)站美奂案文I。故而在治療上多以補脾健胃，通調(diào)腸腑，疏通氣血為主。本實驗所選天樞穴作為大腸募穴，處于腹部最為接近大腸，與處于背部督脈的大腸俞均是大腸經(jīng)氣匯聚之處，具有疏通陽明氣血，激發(fā)大腸經(jīng)氣之效；足三里、上巨虛穴處于下肢皆屬于足陽明胃經(jīng)，分別為胃經(jīng)合穴及大腸經(jīng)下合穴，具有調(diào)補脾胃，通腑降氣之效。對于腹瀉、腹脹、痢下赤白膿血等胃腸疾病皆有改善作用。本實驗研究結(jié)果顯示，造模后大鼠體重下降，糞便稀溏并夾雜膿血便，肛周普遍出現(xiàn)污穢，懶動喜于扎堆；病理切片見出血、潰瘍及大量炎性細胞浸潤，腺體消失，黏膜消失，提示模型制備成功。各腧穴組經(jīng)電針干預后一般狀態(tài)皆有所改善；病理切片顯示炎性細胞減少，黏膜各層均有不同程度的修復，其中上巨虛組較其余腧穴組炎癥減輕更為顯著，腺體排列整齊接近正常組。

現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，IBD 的發(fā)病受到多種因素相互影響，在多種細胞及其分泌的細胞因子的參與下，經(jīng)多種炎癥信號通路的介入導致腸道黏膜免疫屏障功能受損，以結(jié)腸黏膜炎癥和潰瘍的發(fā)生為主要病理表現(xiàn)［15，16］。相關研究表明，通過阻斷 PI3K/Akt/mTOR 信號通路可以抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）的激活，減少相關炎性細胞因子的分泌與表達，從而緩解結(jié)腸黏膜炎性損傷［17-19］。PI3K 是一種可催化膜肌醇脂質(zhì)磷酸化的細胞內(nèi)酶，其所產(chǎn)生的肌醇脂質(zhì)物質(zhì)的第二信使PIP3 可作為具有PH 結(jié)構(gòu)域的AKT 蛋白質(zhì)膜的停泊點，促使AKT 上的蘇氨酸及絲氨酸在磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶1，2 作用下發(fā)生磷酸化，繼而激活下游靶點AKT［20］，活化的AKT 可通過調(diào)節(jié)下游分子mTOR 發(fā)揮抗炎作用［21］，而且活化的mTOR調(diào)節(jié)細胞自噬在腸道炎癥中占據(jù)重要作用［22］。同時，PI3K 還可通過驅(qū)動NF-κB 的活化促進IL-6、IL-23 等細胞因子的表達與分泌［23］。也有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K 信號傳導在Toll 樣受體介導的炎癥中可促進抗炎因子IL-10 的產(chǎn)生［24］。另外，PI3K/Akt/mTOR 信號通路還可通過調(diào)節(jié)CD4+T 細胞，激活Th17 細胞分泌IL-17，導致IBD 的發(fā)生［25］。

本實驗研究結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA 及p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達升高，同時，血清中IL-23、IL-17 水平升高，IL-10 水平降低。與模型組比較，經(jīng)電針干預后各腧穴治療組大鼠血清中IL-23、IL-17 水平降低，IL-10 水平升高，結(jié)腸組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA 及 p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達均有不同程度的降低，提示電針可能是通過抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路活化，調(diào)控促炎因子與抗炎因子的水平從而有效的治療慢性結(jié)腸炎大鼠。進一步比較發(fā)現(xiàn)，上巨虛組對于炎性因子及PI3K/Akt/mTOR 信號通路相關蛋白的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于天樞、大腸俞及足三里組，提示上巨虛穴對于慢性結(jié)腸炎的治療具有相對特異性，也在一定程度上印證了“合治內(nèi)腑”的經(jīng)典理論。另外本研究實驗結(jié)果顯示，天樞組的療效優(yōu)于大腸俞與足三里組，進一步提示“合募配穴”可作為治療炎癥性腸病的基礎配穴，這與既往研究也相一致［26，27］。

綜上所述，電針天樞、大腸俞、足三里、上巨虛穴皆可改善慢性結(jié)腸炎大鼠一般狀況，對于腸道黏膜損傷及腸道炎癥反應均具有不同程度的治療作用，其作用機制可能是通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路激活，進而調(diào)控促炎細胞因子IL-23、IL-17和抗炎細胞因子IL-10，緩解腸道炎癥，調(diào)節(jié)機體免疫所實現(xiàn)的。其中上巨虛穴的效應最佳。

作者貢獻度說明：

唐坤鵬：負責文章的撰寫，動物模型的構(gòu)建、電針干預，指標檢測及數(shù)據(jù)的收集整理與統(tǒng)計分析；呂嘉琪、馬夢娜、任華山：協(xié)助實驗的執(zhí)行并給予指導；文壇、張春青：參與指標檢測及對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與審核；閆麗萍：實驗設計、指導與審校。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。