蘇 行，劉慧芳，劉澤瑩，樓招歡，張光霽

丹參活性部位丹參二萜醌羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備工藝研究

蘇 行1，劉慧芳2，劉澤瑩2，樓招歡2，張光霽1*

1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江省中醫(yī)“瘀毒”證重點實驗室，浙江 杭州 310053 2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053

優(yōu)化丹參二萜醌（diterpenoid tanshinone，DT）羥丙基-β-環(huán)糊精（hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD）包合物（inclusion complex，IC）（DT&HP-β-CD@IC）制備工藝。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇DT與HP-β-CD的配比、包合溫度、包合時間為考察因素，以DT包封率及包合物載藥量為綜合評價指標(biāo)，利用Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化DT&HP-β-CD@IC制備工藝，并采用紅外光譜法、紫外光譜法、薄層色譜法及掃描電子顯微鏡法對DT&HP-β-CD@IC進行評價。DT&HP-β-CD@IC最佳制備工藝為HP-β-CD質(zhì)量濃度0.1 g/mL，藥物與載體材料配比1∶3，包合時間2 h，包合溫度40 ℃。DT&HP-β-CD@IC的包封率達68.78%，載藥量達5.44%。紫外、紅外光譜和薄層色譜等結(jié)果表明DT&HP-β-CD@IC的形成。DT&HP-β-CD@IC載藥量較高，溶解性有一定的提高。

丹參；活性部位；丹參二萜醌；羥丙基-β-環(huán)糊精；包合物；Box-Behnken響應(yīng)面；二氫丹參酮I；隱丹參酮；丹參酮I；丹參酮IIA

丹參為唇形科丹參屬植物丹參Bunge的干燥根及根莖，具有活血、化瘀、益氣等顯著功效，為臨床常用活血祛瘀藥之一[1]。丹參二萜醌（diterpenoid tanshinone，DT）部位為本課題組前期從丹參中提取獲得的二萜醌類成分，在體內(nèi)外均顯示了良好的抗肺癌作用，該作用與DT促進肺癌細胞凋亡、改善肺癌炎癥微環(huán)境和微循環(huán)障礙有關(guān)[2-4]。但是DT水溶性極小，生物利用度低下，影響其療效和成藥性，臨床使用受到限制。包合物（inclusion compound，IC）是一種分子全部或部分被包藏于另一種分子的空穴結(jié)構(gòu)內(nèi)形成的絡(luò)合物[5]。作為一種新型的藥物制劑技術(shù)，包合物可以提高難溶性藥物的溶解度，增加其生物利用度及藥物溶出度[6]，增加治療效果；并可以增加藥物穩(wěn)定性、減少藥物的不良反應(yīng)和刺激性以及掩蓋藥物的不良臭味等[7]。

羥丙基-β-環(huán)糊精（hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD）屬于包合物（CD）衍生物中的水溶性環(huán)糊精衍生物，是目前應(yīng)用最廣泛的包合材料，具有外側(cè)親水、內(nèi)側(cè)疏水空腔結(jié)構(gòu)，在水中溶解度較大，室溫（25 ℃）可高達0.75 g/mL，其水溶液中質(zhì)量濃度低于0.40 g/mL時，流動性良好，不黏稠[8-9]，在增加藥物溶解度、提高穩(wěn)定性和生物利用度方面發(fā)揮著重要作用[10-11]，本實驗采用不飽和水溶液法制備丹參二萜醌羥丙基-β-環(huán)糊精包合物（DT&HP-β-CD@IC），對DT藥效部位中丹參酮IIA、丹參酮I、隱丹參酮及二氫丹參酮I進行包合，以載藥量為主要考察指標(biāo)，獲得包合物的制備工藝，并對其進行驗證，以期得到一種可以提高DT溶解度，增加其生物利用度，且制備工藝簡便的劑型。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀，美國Agilent有限公司；KQ-500B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Millipore型超純水系統(tǒng)，美國Milli- Q Biocel公司；XS105DU型十萬分之一天平，瑞士Mettler Toledo公司；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋、DGG-9070B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；SHZ-B型水浴恒溫振蕩器，上海百典儀器設(shè)備有限公司；Thermo Sorvall ST-8R型臺式高速冷凍離心機、Nicolet IS50型傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo公司；UV-3600型紫外分光光度計，日本島津公司；Camag型薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)、Camag Linomat 5型半自動點樣儀，瑞士Camag公司。

1.2 藥品與試劑

丹參飲片，批號20050101，產(chǎn)地山東，浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片有限公司，飲片經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司錢敏副主任中藥師鑒定為唇形科丹參屬植物丹參Bunge的干燥根和根莖；對照品丹參酮IIA（批號B20257）、丹參酮I（批號B20256）、隱丹參酮（批號B21586）、二氫丹參酮I對照品（批號B20357），質(zhì)量分數(shù)均≥98%，上海源葉生物科技有限公司；分析純乙酸、甲醇，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；分析純95%乙醇，華東醫(yī)藥股份有限公司；色譜級乙腈、甲醇，德國默克股份有限公司；HP-β-CD，批號S11011，上海源葉生物科技有限公司；溴化鉀，批號P116270，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DT樣品，實驗室自制；硅膠G板，批號20180122，青島海洋化工有限公司制造。

2 方法與結(jié)果

2.1 DT的制備

稱取山東產(chǎn)地丹參藥材250 g，加入到3000 mL圓底燒瓶中，加2500 mL 95%乙醇，浸泡1.0 h，60 ℃提取2次，每次1 h，合并所得提取液，提取液抽濾，濾液濃縮到一定體積，按照1∶1的比例加入石油醚[12]萃取5次，回收石油醚，稱量固形物質(zhì)量1.725 g，經(jīng)過石油醚萃取后DT部位的平均得率為0.69%，平均質(zhì)量分數(shù)為20.03%。

2.2 DT&HP-β-CD@IC的制備

選用不飽和水溶液法[13]制備DT&HP-β-CD@ IC。稱取1 g HP-β-CD溶于10 mL水中配制成0.1 g/mL的HP-β-CD不飽和水溶液，常溫下置于超聲儀中充分超聲溶解，稱取25 mg DT溶于少量甲醇中，緩慢滴加至HP-β-CD不飽和水溶液中，30 ℃下超聲1 h，使藥物分子被充分包合，然后用石油醚洗滌3次除去未被包合的藥物分子，洗滌后的溶液水浴蒸干，即得DT&HP-β-CD@IC粉末。

2.3 DT成分含量測定方法的建立

2.3.1 色譜條件 色譜柱為 XB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.2%乙酸水溶液（57∶43）；檢測波長270 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；體積流量1.0 mL/min；理論塔板數(shù)按二氫丹參酮I計算不低于10 000。

2.3.2 對照品溶液的制備 取丹參酮IIA對照品7.41 mg、丹參酮I對照品2.80 mg、隱丹參酮對照品3.63 mg、二氫丹參酮I對照品1.92 mg，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容。精密移取各對照品溶液5 mL于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，制得含丹參酮IIA148.2 μg/mL，丹參酮I 56.0 μg/mL，隱丹參酮72.6 μg/mL，二氫丹參酮I 38.4 μg/mL的混合對照品儲備溶液。

2.3.3 DT&HP-β-CD@IC供試品溶液的制備 精密稱取DT&HP-β-CD@IC 5 mg，少量甲醇超聲溶解，再定溶于1 mL量瓶中，得到DT&HP-β-CD@IC供試品溶液。

2.3.4 HP-β-CD空白對照溶液的制備 精密稱取空白HP-β-CD適量，按照“2.3.3”項下方法制備HP-β-CD空白供試品溶液。

2.3.5 分析方法專屬性 取DT混合對照品儲備溶液、HP-β-CD空白對照溶液、DT&HP-β-CD@IC供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，所得色譜圖如圖1所示，可知，樣品中輔料不會干擾目標(biāo)成分的測定，表明該分析方法專屬性良好。

1-二氫丹參酮I 2-隱丹參酮 3-丹參酮I 4-丹參酮IIA

2.3.6 線性關(guān)系考察 分別精密量取混合對照品儲備溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置5 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，得到系列對照品溶液。按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進行線性回歸，得回歸方程：丹參酮IIA＝55.069＋30.373，＝0.999 9，線性范圍14.82～148.20 μg/mL；丹參酮I＝33.372－0.015 1，＝0.999 8，線性范圍5.60～56.00 μg/mL；隱丹參酮＝46.110＋2.452 7，＝0.999 9，線性范圍7.26～72.60 μg/mL；二氫丹參酮I＝33.606＋3.216 4，＝0.999 8，線性范圍3.84～38.40 μg/mL。結(jié)果表明，4個成分具有良好的線性關(guān)系。

2.3.7 精密度試驗 取適量“2.3.3”項下DT&HP-β-CD@IC供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，連續(xù)進樣6次，計算日內(nèi)精密度，結(jié)果丹參酮IIA、丹參酮I、隱丹參酮、二氫丹參酮I峰面積的RSD分別為0.27%、0.40%、0.34%、2.38%，說明儀器精密度良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗 取適量“2.3.3”項下DT&HP-β-CD@IC供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣，依法測定，記錄峰面積，計算丹參酮IIA、丹參酮I、隱丹參酮、二氫丹參酮I峰面積的RSD分別為1.30%、1.39%、1.44%、2.66%，表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.9 重復(fù)性試驗 按“2.3.3”項下方法平行制備DT&HP-β-CD@IC供試品溶液6份，按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，測得丹參酮IIA、丹參酮I、隱丹參酮、二氫丹參酮I的質(zhì)量分數(shù)分別為1.71、11.99、0.16、0.55 mg/g，RSD分別為2.48%、2.40%、3.88%、2.28%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.10 加樣回收率試驗 取已測定DT含量的DT&HP-β-CD@IC粉末6份，分別加入1∶1 DT含量的混合對照品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，進樣量為10 μL，計算加樣回收率，結(jié)果丹參酮IIA、丹參酮I、隱丹參酮、二氫丹參酮I的平均加樣回收率分別為95.6%、95.4%、95.3%、102.7%，RSD分別為3.11%、2.11%、1.37%、3.39%。

2.4 DT&HP-β-CD@IC制備工藝考察

2.4.1 DT&HP-β-CD@IC包封率、載藥量的測定 采用超聲法[14]測定包合物的包封率和載藥量。

包封率＝包合物中指標(biāo)成分的質(zhì)量/指標(biāo)成分的實際投入量

載藥量＝包合物中指標(biāo)成分的質(zhì)量/包合物質(zhì)量

包合物得率＝包合物的質(zhì)量/(HP-β-CD的質(zhì)量＋指標(biāo)成分的實際投入量)

2.4.2 DT&HP-β-CD@IC制備工藝單因素考察 采用不飽和水溶液法制備DT&HP-β-CD@IC，分別以DT與HP-β-CD的配比、包合時間、包合溫度為影響因素，對DT&HP-β-CD@IC包封率和載藥量進行考察，包合物包封率與后期制作成本密切相關(guān)，載藥量能提高DT的溶解度，因此，本實驗選擇包合物的包封率和載藥量2個指標(biāo)進行綜合考量。

（1）DT與HP-β-CD配比考察：控制藥物DT與載體材料HP-β-CD的配比分別為1∶25、1∶20、1∶15、1∶10、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1，稱取不同質(zhì)量DT加適量甲醇溶解，緩慢滴入到10 mL質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的HP-β-CD不飽和水溶液中，30 ℃下超聲1 h包合，控制其他因素，按照“2.2”項下制備工藝進行制備，考察包封率、載藥量以及包合物得率隨DT與HP-β-CD配比變化的情況，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，載藥量隨著DT與HP-β-CD配比的增加而先增加后降低，包封率和包合物得率與二者配比呈反比，因此，在選擇時要綜合選擇包封率和載藥量都較大的情況。

表1 DT與HP-β-CD配比考察結(jié)果(, n = 3)

（2）DT與HP-β-CD包合時間考察：控制DT與HP-β-CD的包合時間分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h，稱取25 mg DT溶于少量甲醇中，緩慢滴入到10 mL質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的HP-β-CD不飽和水溶液中，30 ℃下超聲不同時間包合，控制其他因素，按照“2.2”項下制備工藝進行制備，考察包封率、載藥量以及包合物得率隨包合時間變化的情況，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，當(dāng)包含時間在1.0、2.0、3.0 h時載藥量最大，考慮到后期的加工成本問題，選擇包合物得率最高的2.0 h較為合適。

（3）DT與HP-β-CD包合溫度考察：控制DT與HP-β-CD的包合溫度分別為30、35、40、45、50 ℃，稱取25 mg DT溶于少量甲醇中，緩慢滴入到10 mL質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的HP-β-CD不飽和水溶液中，不同溫度下超聲1 h包合，控制其他因素，按照“2.2”項下制備工藝進行制備，考察包封率、載藥量以及包合物得率隨包合溫度變化的情況，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，隨著包合溫度的增加，包封率、載藥量以及包合物得率呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，當(dāng)包合溫度為35 ℃時包合物的載藥量和包封率最大。

2.4.3 Box-Behken響應(yīng)面法優(yōu)化DT&HP-β-CD@IC的制備工藝

（1）實驗設(shè)計與結(jié)果：在上述單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 12.0軟件對DT&HP-β-CD@IC進行工藝優(yōu)化。控制制備工藝中HP-β-CD的質(zhì)量濃度為0.1 g/mL，采用Box-Behken響應(yīng)面設(shè)計，以包合物的包封率和載藥量作為考察指標(biāo)，對制備工藝中藥物DT與載體材料HP-β-CD的配比（1）、包合時間（2）、包合溫度（3）進行優(yōu)化，以期得到DT&HP-β-CD@IC的最佳制備工藝。Box-Behken實驗設(shè)計與結(jié)果見表4。

表2 DT與HP-β-CD包合時間考察結(jié)果(, n = 3)

表3 DT與HP-β-CD包合溫度考察結(jié)果(, n = 3)

表4 Box-Behnken響應(yīng)面組合實驗設(shè)計及結(jié)果

（2）響應(yīng)面模型擬合分析：運用Design-Expert 12.0軟件對表4中的數(shù)據(jù)進行分析，分別對各個考察因素與包封率和載藥量之間的關(guān)系進行方程擬合，包封率和載藥量的方差分析結(jié)果見表5。包封率和載藥量的擬合方程為包封率＝32.71－9.481＋7.082＋0.753－9.0312－12.6913－3.2423＋7.9912－10.0522＋1.2132；載藥量＝ 1.65－1.001＋0.208 82＋0.231 33－0.565 012－0.805 013－0.217 523＋0.838 312－0.729 322＋0.180 832。

表5 包合物中包封率和載藥量的方差分析結(jié)果

由表5中的數(shù)據(jù)可知，包封率和載藥量模型的＜0.05，具有顯著性差異，從而具有統(tǒng)計學(xué)意義。模型中考察指標(biāo)的失擬項＞0.05，不具有顯著性差異，因而無統(tǒng)計學(xué)意義，該模型在預(yù)測過程中無失擬項因素存在，擬合性較好，可以對包合物的包封率和載藥量進行下一步分析與預(yù)測。

由表值可以看出，包封率的影響因素中1、2、13、22項具有顯著性差異，載藥量的影響因素中1、12項具有顯著性差異，說明自變量因素中對包合物包封率和載藥量影響較為顯著的是HP-β-CD與DT配比以及包合時間這2個因素。

以上結(jié)果顯示運用該模型可以對實驗結(jié)果進行一定的分析和預(yù)測，用來優(yōu)化DT&HP-β-CD@IC的制備工藝。

（3）響應(yīng)面實驗結(jié)果優(yōu)化與預(yù)測：根據(jù)上述實驗結(jié)果的分析，運用Design-Expert 12.0軟件，對包合物包封率和載藥量的三維響應(yīng)曲面圖進行繪制。包封率和載藥量的三維響應(yīng)曲面圖見圖2。

通過分析圖2可以得出，HP-β-CD與DT配比、包合溫度這2個因素之間的交互作用對DT&HP-β-CD@IC的包封率影響較為顯著。通過該軟件優(yōu)化得到的DT&HP-β-CD@IC最佳制備工藝為藥物與載體材料的配比為1∶3，反應(yīng)時間為2.5 h，反應(yīng)溫度為40 ℃，在此條件下得到包封率預(yù)測值為68.78%、載藥量的預(yù)測值4.80%。

（4）工藝驗證實驗：按最佳制備工藝平行制備3批DT&HP-β-CD@IC，重復(fù)測定其包封率和載藥量，與模型預(yù)測結(jié)果進行相應(yīng)比較，以此來驗證模型的可靠性。包封率和載藥量的測定結(jié)果見表6。結(jié)果顯示，DT&HP-β-CD@IC的包封率和載藥量平均實測值分別為63.49%、5.17%。

圖2 DT&HP-β-CD@IC的包封率和載藥量響應(yīng)曲面圖

2.5 DT&HP-β-CD@IC的表征

2.5.1 外觀 對得到的DT&HP-β-CD@IC粉末進行觀察，為黃棕色粉末，結(jié)果見圖3。

2.5.2 薄層色譜法 取丹參酮IIA對照品溶于甲醇溶液，得到樣品1；丹參酮I對照品溶于甲醇溶液，得到樣品2；隱丹參酮對照品溶于甲醇溶液，得到樣品3；二氫丹參酮I對照品溶于甲醇溶液，得到樣品4；HP-β-CD溶于蒸餾水，得樣品5；稱取DT樣品，溶于適量甲醇溶液，得到樣品6；稱取DT&HP-β-CD@IC溶于適量甲醇溶液，得到樣品7。照薄層色譜法（《中國藥典》2020年版四部通則0502）試驗，吸取上述6種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-醋酸乙酯（5∶1）為展開劑，展開，取出，晾干。由圖4可知，DT&HP-β-CD@IC在與DT相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。且DT與丹參酮IIA、丹參酮I、隱丹參酮、二氫丹參酮I在相同位置顯相同顏色的斑點，HP-β-CD無展開斑點，表明HP-β-CD不改變藥物DT主要成分，包合物形成前后DT的化學(xué)成分沒有發(fā)生變化。

表6 驗證實驗結(jié)果

圖3 DT (a) 和DT&HP-β-CD@IC (b) 外觀

2.5.3 紅外光譜法 取DT、HP-β-CD、DT及HP-β-CD的物理混合物和DT&HP-β-CD@IC各2 mg左右，分別與200 mg左右干燥的KBr粉末在瑪瑙研缽中混勻，充分研細至顆粒直徑小于2 μm，用不銹鋼小勺取適量放入壓片模具內(nèi)，在壓片機上壓成透明薄片。在4000～400 cm?1進行測定，分辨率為4 cm?1，掃描次數(shù)為32次。各物質(zhì)的特征吸收峰見圖5。從圖5-A可以看出，3 385.51 cm?1為HP-β-CD的特征峰，該峰為HP-β-CD中-OH的伸縮振動峰，DT的紅外吸收圖譜見圖5-C，1 671.32 cm?1為丹參酮C＝O伸縮振動峰，為其特征峰，由圖5-A、D可以看出，HP-β-CD和DT&HP-β-CD@IC譜圖上的峰形具有較高的相似度，因此，可以推斷反應(yīng)過程中HP-β-CD的基本骨架結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變，在包合物（圖5-D）中，鄰苯醌中的羰基C＝O在1 670.00 cm?1處的特征吸收峰消失。從圖5-C可以看出，DT和HP-β-CD物理混合物的紅外圖譜為其二者的簡單相加，含有DT和HP-β-CD二者的特征峰。通過上述對比分析可證明DT&HP-β-CD@IC形成。

1-丹參酮IIA 2-丹參酮I 3-隱丹參酮 4-二氫丹參酮I 5-HP-β-CD 6-DT 7-DT&HP-β-CD@IC

A-HP-β-CD B-HP-β-CD和DT物理混合物 C-DT D-DT&HP-β-CD@IC

2.5.4 紫外光譜法 稱取適量HP-β-CD溶于蒸餾水，得供試品1；DT&HP-β-CD@IC適量溶于蒸餾水，得供試品2；稱取適量包合前DT樣品，采用無水乙醇溶解，得供試品3；將DT與HP-β-CD物理混合，加無水乙醇超聲溶解，得供試品4；稱取DT&HP-β-CD@IC適量加無水乙醇超聲溶解，得供試品5。各樣品溶液在200～500 nm（采樣間隔1 nm）進行紫外掃描，供試品1、2以蒸餾水做空白對照，供試品3～5采用無水乙醇做空白對照。各供試品溶液的UV全波長掃描圖譜見圖6。由圖6可知，HP-β-CD與DT&HP-β-CD@IC沒有DT特征吸收峰，表明有新物質(zhì)的形成。包合物所提取的DT、DT和HP-β-CD的物理混合物、包合前的DT三者有著相似的吸收峰，表明DT&HP-β-CD@IC的形成前后DT的主要化學(xué)成分沒有發(fā)生變化。

A-HP-β-CD B-DT與HP-β-CD的物理混合物 C-包合前的DT樣品 D-DT&HP-β-CD@IC中提取的DT E-DT&HP-β-CD@IC

2.5.5 掃描電鏡法 使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡[15]觀察DT&HP-β-CD@IC、HP-β-CD、DT以及HP-β-CD和DT物理混合物的表面形態(tài)，結(jié)果見圖7。由圖7可知，包合前的DT表面有針狀結(jié)構(gòu)，呈不規(guī)則的晶體結(jié)構(gòu)，HP-β-CD呈多孔的球狀結(jié)構(gòu)，DT&HP-β-CD@IC表面發(fā)生變化，不再有DT的針狀結(jié)構(gòu)，以及HP-β-CD的球狀結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生了新的不規(guī)則晶體結(jié)構(gòu)，說明DT&HP-β-CD@IC形成。

2.5.6 溶解度測定 分別精密稱取4份DT&HP-β-CD@IC粉末和DT樣品于15 mL離心管內(nèi)，加入5 mL pH 1.2鹽酸緩沖液、pH 6.8及7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）、純水，置于37 ℃水浴中恒溫震蕩器中（90 r/min），平衡1 d后，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，HPLC測定含量，結(jié)果見表7。DT&HP-β-CD@IC在一定的介質(zhì)中溶解度有一定的增加，而平衡1 d后，檢測到DT在pH 6.8 PBS介質(zhì)中溶解度為（0.074±0.003）mg/mL，未在其他介質(zhì)中檢測到DT成分。

3 討論

中藥和天然植物藥的開發(fā)和利用，對于推進中醫(yī)藥現(xiàn)代化和促進人民健康具有重要意義[16]。但部分中藥存在成分復(fù)雜、水溶性差等問題，給臨床前研究，尤其是體外藥效學(xué)研究帶來困擾。包合物通過將客體疏水分子封裝在包合材料疏水內(nèi)部空腔，利用親水性外表面來增加疏水分子溶解性[17]，常采用飽和水溶液法、超聲法、研磨法、冷凍干燥法以及噴霧干燥法制備[18-19]。Box-Behnken實驗設(shè)計可非線性擬合給出各因素之間的交互作用，設(shè)計簡單、實驗次數(shù)少、預(yù)測值可信度較高，已被廣泛用于藥學(xué)領(lǐng)域中制劑處方工藝的篩選與優(yōu)化[20-21]。

本實驗通過單因素試驗篩選出對HP-β-CD-DT包合物制備工藝影響較為顯著的幾個因素，且得到了包封率和載藥量最大時各因素所處的大致范圍，以載藥量和包封率為主要考察指標(biāo)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法對其制備工藝進行優(yōu)化，得到最佳制備工藝為藥物與載體材料的配比為1∶3，反應(yīng)時間為2.5 h，反應(yīng)溫度為40 ℃，在此條件下得到載藥量為5.17%、包封率為63.49%，驗證實驗與預(yù)測有所偏差，同時發(fā)現(xiàn)在響應(yīng)面給出的預(yù)試16號實驗得出的結(jié)果更好，因此從實際出發(fā)，確認最佳工藝為藥物與載體材料的配比為1∶3，反應(yīng)時間為2 h，反應(yīng)溫度為40 ℃，在此條件下得到載藥量為5.44%、包封率為68.78%。最后通過紅外光譜法、紫外光譜法以及薄層色譜法對包合物進行表征，驗證了包合物形成，這為將DT應(yīng)用于后續(xù)實驗和臨床提供了支持。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 鐘贛生. 中藥學(xué) [M]. 第4版. 北京: 中國中醫(yī)藥出版社, 2016: 277.

[2] 李曉娟, 夏榕蔓, 樓招歡, 等. 丹參二萜醌通過PERK-EIF2α通路誘導(dǎo)肺癌PC9細胞凋亡的機制研究 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2017, 32(5): 1897-1902.

[3] 樓招歡, 夏榕蔓, 李曉娟, 等. 丹參二萜醌活化ERS介導(dǎo)的凋亡通路抗肺癌作用機制研究 [J]. 中國中藥雜志, 2018, 43(24): 4900-4907.

[4] 張夢陽, 張光霽, 樓招歡. 丹參二萜醌對PC9肺癌移植瘤動物炎癥微環(huán)境的作用研究 [J]. 浙江中醫(yī)雜志, 2019, 54(1): 8-9.

[5] 姜興粲, 李冰, 張繼瑜. 環(huán)糊精包合物超分子體系的制備與表征研究進展 [J]. 動物醫(yī)學(xué)進展, 2021, 42(3): 96-101.

[6] 張倩, 夏學(xué)軍. 藥物制劑中藥物與輔料相互作用的研究進展 [J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2021, 52(1): 32-41.

[7] 聶曉娟, 李霞, 馬紅艷. 環(huán)糊精聚合物的合成及應(yīng)用研究 [J]. 精細化工, 2019, 36(12): 2364-2370.

[8] Hsu CM, Yu SC, Tsai FJ,. Characterization ofandbioactivity of a ferulic acid-2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complex [J]., 2019, 180: 68-74.

[9] 楊云漢, 趙雪秋, 杜瑤, 等. 長春胺與羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備、表征及理論研究[J]. 中草藥, 2019, 50(2): 352-363.

[10] 許丹, 劉建英, 劉玉梅. β-環(huán)糊精及其衍生物增加客體分子水溶性的研究進展 [J]. 食品工業(yè)科技, 2021, 42(16): 404-411.

[11] Sun C, Cao J, Wang Y,. Ultrasound-mediated molecular self-assemble of thymol with 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin for fruit preservation [J]., 2021, 363: 130327.

[12] 張毅, 鄧昌平, 時敏, 等. 藥用植物丹參中丹參酮IIA的提取分離工藝研究 [J]. 上海師范大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2018, 47(6): 754-761.

[13] 吳妮. CS-γ-PGA-丹參酮IIA包合物的制備與評價 [D].西安: 西北大學(xué), 2019.

[14] 李燕華, 王淑慧, 李俊鵬, 等. 漆黃素與β-環(huán)糊精衍生物的包合行為及性能研究 [J]. 中草藥, 2021, 52(16): 4797-4810.

[15] 李德鋒, 樊金玲, 姚培培, 等. 光甘草定/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的釋放特性、黏液滲透性及細胞攝取[J/OL]. 食品科學(xué): https://kns.cnki.net/kcms/detail/11. 2206.TS.20230413.1954.038.html.

[16] 羅李娜, 陳更新. 關(guān)于中藥新藥開發(fā)現(xiàn)代化的幾點思考 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2017, 32(11): 4798-4800.

[17] 許丹, 劉建英, 劉玉梅. β-環(huán)糊精及其衍生物增加客體分子水溶性的研究進展 [J]. 食品工業(yè)科技, 2021, 42(16): 404-411.

[18] 劉雪城, 丁平剛, 金皓潔, 等. 反式西紅花酸-環(huán)糊精包合物的制備、表征、安全性和抗腫瘤評價 [J]. 中草藥, 2022, 53(15): 4663-4672.

[19] 朱東方, 陳勇, 黃國清. β-環(huán)糊精包埋黑胡椒油樹脂工藝研究 [J]. 食品研究與開發(fā), 2022, 43(7): 96-103.

[20] 徐蓓蕾, 韓曉宇, 劉晶晶, 等. 基于Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法與質(zhì)量綜合評價優(yōu)化葛根芩連湯煎煮工藝 [J]. 中草藥, 2022, 53(22): 7070-7081.

[21] Amanda, Parra-Campos, Eduardo L,. Natural pigment extraction optimization from coffee exocarp and its use as a natural dye in french meringue [J]., 2019, 285(1): 158.

Preparation technology of diterpenoid tanshinone hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complex from active parts of

SU Hang1, LIU Hui-fang2, LIU Ze-ying2, LOU Zhao-huan2, ZHANG Guang-ji1

1. Key Labortary of Blood-Stasis-Toxin Syndrome of Zhejiang Province,School of Basic Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China 2. School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China

To optimize the preparation process of diterpenoid tanshinone (DT) hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD) inclusion complex (IC) (DT&HP-β-CD@IC).Based on the single factor test, the ratio of DT and HP-β-CD, the inclusion temperature, and the inclusion time were selected as the investigating factors, the encapsulation efficiency and drug-loading of the inclusion complex were used as the evaluation index. The Box-Behnken response surface was used to optimize the preparation process of the DT&HP-β-CD@IC, and the inclusion complex was evaluated by infrared spectroscopy, ultraviolet spectroscopy, thin layer chromatography and scanning electron microscopy.The optimal preparation process of the inclusion complex was as follows: HP-β-CD concentration was 0.1 g/mL, the ratio of drug to carrier material was 1:3, the inclusion time was 2 h, and the inclusion temperature was 40 ℃. The encapsulation rate of DT&HP-β-CD@IC was 68.78%, and the drug loading was 5.44%. The results of ultraviolet, infrared spectroscopy and thin-layer chromatography indicated the formation of inclusion complex.DT&HP-β-CD@IC has a high encapsulation efficiency and a certain improvement in solubility.

Bunge; active parts; diterpenoid tanshinone; hydroxypropyl-β-cyclodextrin; inclusion complex; Box-Behnken response surface; dihydrotanshinone Ⅰ; cryptotanshinone; tanshinone Ⅰ; tanshinone ⅡA

R283.6

A

0253 - 2670(2023)10 - 3132 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.10.010

2022-12-16

浙江省科技計劃項目省級重點研發(fā)計劃（2019C03072）；浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（2023ZR081）

蘇 行（1996—），男，碩士研究生，專業(yè)方向為中醫(yī)學(xué)。

張光霽，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向為中醫(yī)體質(zhì)與病因病機學(xué)研究和中醫(yī)藥抗腫瘤創(chuàng)新藥物研究。E-mail: zgj@zcmu.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]