周 梅,劉秋月,孫 慶,田志龍,向光明,狄 冉,王翔宇,儲明星*

(1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室,北京 100193;2 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,豬分子數(shù)量遺傳學(xué)安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重點實驗室,畜禽產(chǎn)品安全工程安徽省重點實驗室,合肥 230001)

產(chǎn)羔數(shù)是綿羊最重要的經(jīng)濟性狀之一,其對綿羊繁殖力遺傳的貢獻為74%—96%[1-3],是衡量母羊生產(chǎn)性能的關(guān)鍵指標(biāo)。 潘章源等[1]對10 個中國地方綿羊品種進行全基因組重測序,篩選到了組蛋白細胞周期調(diào)節(jié)(histone cell cycle regulator,HIRA)基因。HIRA基因編碼的HIR∕HIRA 蛋白是組蛋白的伴侶蛋白,該蛋白參與各種染色質(zhì)調(diào)節(jié)過程,如基因轉(zhuǎn)錄和精子染色質(zhì)的重塑[2-3]。 在真核生物中,DNA 與組蛋白結(jié)合形成核小體這種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu),從而參與各種生物學(xué)過程(如DNA 復(fù)制、修復(fù)和轉(zhuǎn)錄,成肌細胞分化,心臟發(fā)育和胚胎發(fā)育)[4-8]。 研究發(fā)現(xiàn),在小鼠和魚類胚胎發(fā)育過程中,HIRA基因?qū)τ诮M蛋白與DNA的結(jié)合尤為重要[9-11]。HIRA基因?qū)τ谌旧|(zhì)組裝過程中H3.3 變異體的沉積至關(guān)重要,該基因缺失會影響H3.3∕H4 的置換,并影響精子染色質(zhì)的組裝,從而影響小鼠受精[12-16]。 在小鼠胚胎發(fā)生中,HIRA 蛋白失活會引起妊娠中期胚胎死亡[17]。 Buhe 等[9]和Veselovska 等[18]研究發(fā)現(xiàn),HIRA 蛋白對于小鼠卵子發(fā)生過程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和DNA 甲基化至關(guān)重要,原始卵泡細胞中HIRA 蛋白缺失可導(dǎo)致發(fā)育嚴(yán)重缺陷,從而使卵母細胞大量死亡。HIRA基因一個點突變可使果蠅雌性不育,阻止受精后精核的解凝,導(dǎo)致父本染色體無法參與后代胚胎發(fā)育[19-22]。 郭秋紅等[23]研究發(fā)現(xiàn),HIRA基因主要參與受精或胚胎發(fā)育過程,對卵子發(fā)生或減數(shù)分裂并沒有顯著影響。

HIRA基因mRNA 表達在不同產(chǎn)羔數(shù)綿羊繁殖相關(guān)組織間顯著差異,且該基因的g.71874104G ＞A 和g.71833755T ＞C 兩個突變位點均與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)存在顯著關(guān)聯(lián)[13]。 本試驗通過研究g.71874104G ＞A 和g.71833755T ＞C 兩個突變位點對不同HIRA基因型綿羊卵巢顆粒細胞中mRNA 和蛋白表達水平以及生殖激素濃度的影響,以探究HIRA基因突變與綿羊產(chǎn)羔數(shù)之間可能存在的內(nèi)在聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和RNA 提取

綿羊卵巢組織取自河北南營屠宰場。 采用動物組織∕細胞微量RNA 提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]加Trizol(Invitrogen 公司,美國)提取各組織總RNA,使用Nanodrop 2000 檢測提取RNA 的濃度和OD 值,并采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank 提供的綿羊HIRA基因mRNA 的轉(zhuǎn)錄本序列(登錄號為:XM_012164242.2),利用Primer 3 在線軟件設(shè)計HIRA基因突變位點分型和熒光定量所需引物,以β-actin(NM_001009784)作為內(nèi)參基因。 引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成,測序由北京華大生物科技有限公司完成。 引物具體信息見表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3 綿羊卵巢顆粒細胞的獲取和培養(yǎng)

將綿羊卵巢置于4 ℃的1 ×PBS 緩沖液(Gibco 公司,美國)中帶回實驗室,用75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗滌2 次(每次5—10 s),然后用0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的生理鹽水洗滌3 次,最后將卵巢置于含有生理鹽水+1%(體積分?jǐn)?shù))青鏈霉素(Gibco 公司,美國)的混合液中,37 ℃水浴。 小心取出卵巢,用滅菌的10 mL 注射器吸取0.5 mL 完全培養(yǎng)基[完全培養(yǎng)基按照DMEM(HyClone 公司,美國)、胎牛血清(Gibco 公司,美國)和青鏈霉素分別為84%、15%和1%的體積比例進行配制)],從卵泡(直徑＞3.0 mm)中吸出含有顆粒細胞的卵泡液樣品,將混合液依次打入4 孔板(Costar,Cambridge,MA,USA)中并做好標(biāo)記,然后置于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))的二氧化碳培養(yǎng)箱中。

1.4 卵巢組織DNA 提取及基因分型

取綠豆大小卵巢組織,利用動物組織DNA 提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取DNA。通過測序?qū)γ總€卵巢組織HIRA 基因g.71874104G ＞A 和g.71833755T ＞C 位點進行基因分型。

1.5 顆粒細胞激素測定和HIRA 基因表達

待培養(yǎng)皿中細胞密度達到80%左右,將培養(yǎng)液更換為不含血清的培養(yǎng)基,并將該換液時間記為0 h,48 h 時收集細胞培養(yǎng)液,送至北京北方生物科技有限公司利用放射免疫的方法檢測細胞培養(yǎng)液中孕酮(P4)和雌二醇(E2)的含量。 剩余的細胞用于提取RNA,利用qPCR 方法檢測g. 71874104G ＞A 和g.71833755T ＞C 位點不同HIRA 基因型在綿羊顆粒細胞中的mRNA 表達情況。 反應(yīng)體系為20 μL:SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL,上下游引物各0.8 μL,cDNA 模板2.0 μL,ddH2O 6.4 μL。 反應(yīng)程序為:95 ℃預(yù)變性5 s;95 ℃變性5 s,60 ℃30 s,40 個循環(huán);反應(yīng)結(jié)束后分析熔解曲線。 qPCR 檢測利用Roche Light Cycler? R480Ⅱ型熒光定量PCR 儀進行,每個樣品重復(fù)3 次。

1.6 免疫熒光試驗

采用免疫熒光法檢測HIRA 蛋白在綿羊卵巢顆粒細胞中的表達。 用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定細胞并用1 ×PBS 清洗3 次后,向清洗后的培養(yǎng)皿每孔加入100 μL 封閉液1[5 mL 封閉液1:500 μL 山羊血清(Abcam 公司,英國) +4.5 mL 1%的BSA(用1 ×PBS 稀釋) (北京經(jīng)日今典科技有限公司) +5 μL 1%Triton-100(用1 ×PBS 稀釋) (北京經(jīng)日今典科技有限公司)],封閉20 min。 吸出封閉液1,加入一抗(Abcam 公司,英國) 100 μL(一抗∶封閉液1 =1∶200),4 ℃冰箱中放置過夜。 吸出一抗,用1 ×PBS 輕柔地清洗3 次。 向清洗后的培養(yǎng)皿每孔加入200 μL 二抗(Abcam,英國)(二抗∶封閉液2 =1∶1 000;5 mL 封閉液2:400 μL 山羊血清+4.6 mL 1%的BSA +5 μL 1% Triton-100),在黑暗中放置1 h。 吸出二抗,用1 ×PBS 輕柔地清洗3 次。 向清洗后的培養(yǎng)皿每孔細胞表面加入15 μL ProLong(Life 公司,美國)和Hoechst(Hoechst AG 公司,德國)混合液,蓋上圓形蓋玻片,用錫箔紙包好后放置于4 ℃冰箱。 HIRA 蛋白表達陽性率=陽性表達的細胞數(shù)∕總細胞數(shù)。 共統(tǒng)計18 個樣本中HIRA 的表達情況(20 倍鏡),包括g.71874104G ＞A 和g.71833755T ＞C 位點各3 種基因型,每種基因型設(shè)3 個生物學(xué)重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法[24]計算目的基因相對表達量,利用SPSS 20 軟件中LSD 法對不同組別之間mRNA 和蛋白表達以及激素濃度進行差異比較分析,所有數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同HIRA 基因型綿羊顆粒細胞mRNA 和蛋白表達

qPCR 檢測結(jié)果表明(圖1),g.71874104G ＞A 位點各基因型顆粒細胞之間HIRA 的表達量GG 型最高,其次是GA 型,AA 型最低,但三者之間差異均不顯著(P＞0.05)。 而g.71833755T ＞C 位點則是TT 型顆粒細胞中HIRA的表達量最高,其次是TC 型和CC 型,且TT 型顯著高于TC 和CC 型(P＜0.05),TC 和CC 型之間差異不顯著。 由圖2 可知,HIRA 蛋白在原代培養(yǎng)的綿羊卵巢顆粒細胞的細胞核中呈中度表達。 從表2 可以看出,g.71874104G ＞A 突變位點GG 型顆粒細胞中HIRA 蛋白表達量最高,其次是AA型,GA 型最低且極顯著低于GG 和AA 型(P＜0.01);g.71833755T ＞C 突變位點TT 型顆粒細胞中HIRA蛋白表達量最高,其次是TC 型,CC 型最低,且3 種基因型之間均差異極顯著(P＜0.01)。

圖1 不同HIRA 基因型在綿羊顆粒細胞中的表達Fig.1 Expression of HIRA gene with different genotypes in ovine granulosa cells

圖2 綿羊顆粒細胞中HIRA 蛋白表達情況Fig.2 Expression of HIRA protein in ovine granulosa cells

表2 g.71874104G ＞A 和g.71833755T ＞C 突變位點不同基因型綿羊顆粒細胞中HIRA 蛋白表達Table 2 HIRA protein expression in ovine granulosa cells with different genotypes of g.71874104G ＞A and g.71833755T ＞C mutations

2.2 HIRA 基因突變對綿羊顆粒細胞中重要生殖激素分泌的影響

由圖3 可以看出,g.71874104G ＞A 突變位點各基因型綿羊卵巢顆粒細胞GG 型P4 的分泌量顯著高于GA 和AA 型(P＜0.05),GA 和AA 型之間無顯著差異;GA 型E2 的分泌量顯著高于GG 和AA 型(P＜0.05),GG 和AA 型之間無顯著差異。 g.71833755T ＞C 突變位點各基因型之間P4 和E2 的分泌量均無顯著差異(P＞0.05)。

圖3 g.71874104G ＞A 和g.71833755T ＞C 突變位點不同基因型顆粒細胞激素分泌Fig.3 Hormone secretion of different genotypes of granulosa cells for g.71874104G ＞A and g.71833755T ＞C mutations

3 討論

研究表明,HIRA基因?qū)棺祫游锏呐咛グl(fā)育至關(guān)重要,該基因缺失會導(dǎo)致小鼠胚胎死亡[4,25]。HIRA基因是一個保守的不依賴于DNA 復(fù)制的染色質(zhì)裝配因子,在果蠅受精過程中發(fā)揮著特殊作用,對受精過程中父本染色質(zhì)組裝尤為重要[26]。 同果蠅一樣,小鼠的母本HIRA基因?qū)ζ浒l(fā)育也尤為重要,它能夠?qū)⒔M蛋白變體H3.3 摻入父本基因組中進而參與合子的發(fā)育[27-28]。 而HIRA基因缺失則會阻止小鼠精子基因組中的核小體裝配,致使雄性原核無法形成,從而導(dǎo)致受精失敗[29]。 另有研究表明,HIRA基因突變雌性小鼠雖然可以正常排卵,但在與野生型雄性交配后表現(xiàn)為不育,且野生純合型和雜合型小鼠之間的排卵數(shù)無顯著差異[27]。 有趣的是,研究還發(fā)現(xiàn)絕大部分雜合子的卵母細胞受精后均能發(fā)育至囊胚階段,而沒有突變純合子的卵母細胞能夠發(fā)育至二細胞期[27]。 可見,HIRA基因在小鼠胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用。

本團隊前期研究顯示,HIRA基因突變位點g.71874104G ＞A 和g.71833755T ＞C 對于小尾寒羊和魯中肉羊不同胎次產(chǎn)羔數(shù)均存在不同程度的影響[2,30]。 突變位點g.71874104G ＞A 和g.71833755T ＞C 分別位于HIRA基因的上游調(diào)控區(qū)和編碼區(qū),其中g(shù).71833755T ＞C 為錯義突變位點,該突變導(dǎo)致原本應(yīng)該編碼谷氨酰胺的密碼子突變成了編碼精氨酸的密碼子。 本研究發(fā)現(xiàn),兩個突變位點不同基因型顆粒細胞中HIRA 蛋白的表達量存在顯著差異。 g.71874104G ＞A 突變位點不同基因型顆粒細胞中,HIRA 蛋白表達量最低的為GA 型,顯著低于AA 和GG 型,但AA 和GG 型之間的表達量無顯著差異,個體水平上GA型小尾寒羊的產(chǎn)羔數(shù)最高,另外兩種基因型之間產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著[2];g.71833755T ＞C 突變位點不同基因型顆粒細胞中,CC 型蛋白表達量最低,TC 型HIRA 蛋白表達量顯著低于TT 型,個體水平TC 型綿羊產(chǎn)羔數(shù)最高[2]。 在細胞培養(yǎng)過程中CC 型顆粒細胞的成活力極低,而顆粒細胞的增殖分化是卵泡發(fā)育的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié),其分泌的抑制素可作為一種旁分泌因子抑制鄰近卵泡的生長,是優(yōu)勢卵泡募集的重要調(diào)節(jié)因素[31],因此顆粒細胞成活力極低很有可能會導(dǎo)致優(yōu)勢卵泡無法募集,從而導(dǎo)致綿羊個體無法正常排卵,這與前期發(fā)現(xiàn)的CC 型綿羊個體極少一致[2]。 g.71833755T ＞C 位點受到選擇發(fā)生突變,但該突變可能與繁殖軸上某個有害突變連鎖,會影響綿羊生存狀況,在自然選擇過程中該突變被清除了。 綜上,兩個位點的突變雜合子可通過下調(diào)其在顆粒細胞中的蛋白表達促進綿羊卵泡發(fā)育、受精以及胚胎發(fā)育等過程,最終增加產(chǎn)羔數(shù)。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn),g.71874104G ＞A 和g.71833755T ＞C 位點突變均導(dǎo)致卵巢顆粒細胞中HIRA 蛋白表達發(fā)生顯著變化,但HIRA基因mRNA 的表達均無明顯差異,且僅g.71874104G ＞A 突變位點對顆粒細胞P4和E2 的分泌有顯著影響。 推測HIRA基因的g.71874104G ＞A 和g.71833755T ＞C 兩個突變位點可能主要通過改變綿羊卵巢顆粒細胞中HIRA 蛋白表達量影響后續(xù)的受精和胚胎發(fā)育過程,最終影響綿羊的生殖能力。