張新杰，孫永明，閆 淼，李金平，李 穎

·農(nóng)業(yè)生物環(huán)境與能源工程·

低溫產(chǎn)甲烷菌群對(duì)玉米秸稈低溫厭氧消化的生物強(qiáng)化作用

張新杰1,2,3,4，孫永明1,2,3，閆 淼2,3，李金平1,4，李 穎2,3※

（1. 蘭州理工大學(xué)能源與動(dòng)力工程學(xué)院，蘭州 730050；2. 中國科學(xué)院廣州能源研究所，廣州 510640；3. 中國科學(xué)院可再生能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；4. 甘肅省生物質(zhì)能與太陽能互補(bǔ)供能系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050）

為研究產(chǎn)甲烷菌群對(duì)秸稈低溫厭氧消化的生物強(qiáng)化作用，試研究將長(zhǎng)期馴化的低溫產(chǎn)甲烷菌群投加至秸稈厭氧消化體系中，對(duì)比不同添加劑量（3%、6%、9%、12%、15%和18%）對(duì)低溫（20 ℃）批式厭氧消化性能的影響。對(duì)產(chǎn)甲烷性能、中間代謝產(chǎn)物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)和動(dòng)力學(xué)分析，評(píng)價(jià)生物強(qiáng)化效果，確定最佳劑量，結(jié)合微生物群落分析揭示生物強(qiáng)化作用機(jī)制，結(jié)果表明：生物強(qiáng)化可促進(jìn)秸稈低溫厭氧消化，提高甲烷率1.27～2.24倍，促進(jìn)乙酸和丙酸的降解，避免酸抑制，相比對(duì)照組縮短厭氧消化時(shí)間（80）12～19 d；動(dòng)力學(xué)分析表明：生物強(qiáng)化可縮短厭氧消化的延滯期；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明：強(qiáng)化甲烷產(chǎn)量的最佳劑量為12%，單位質(zhì)量菌群強(qiáng)化甲烷產(chǎn)量的最佳劑量為6%；微生物群落分析顯示生物強(qiáng)化促進(jìn)低溫厭氧消化的主要原因是提高了產(chǎn)甲烷菌和相對(duì)豐度。

甲烷；玉米秸稈；低溫厭氧消化；生物強(qiáng)化；微生物群落

0 引 言

厭氧消化技術(shù)可減少有機(jī)廢棄物的環(huán)境污染，并實(shí)現(xiàn)廢棄物的資源化利用[1]。近年來，厭氧消化處理有機(jī)廢棄物的沼氣工程規(guī)?；d起，因低溫氣候條件影響，北方沼氣產(chǎn)業(yè)規(guī)模顯著滯后于南方[2]。低溫下運(yùn)行的沼氣工程因產(chǎn)氣低、保溫成本高、效益差，導(dǎo)致部分處于閑置狀態(tài)。地下式沼氣工程無需加熱，可常年維持在20℃左右，但產(chǎn)氣較少，約(0.2～0.5) m3/(m3·d)。地上沼氣工程通過鍋爐、發(fā)電余熱或太陽能[3]等加熱方式，雖能維持中溫（約35 ℃）發(fā)酵溫度，但保溫成本高。北方冬季平均氣溫-20 ℃，若在35 ℃下運(yùn)行一個(gè)3 000 m3的發(fā)酵罐，其保溫耗能約3 025 kW·h/d（根據(jù)熱損方程計(jì)算），相當(dāng)于消耗每天產(chǎn)氣量（以產(chǎn)氣率0.8 m3/(m3·d)計(jì)）的59%用于保溫，低溫運(yùn)行不具經(jīng)濟(jì)性。秸稈是重要的生物質(zhì)資源，在中國北方資源量豐富[4]，研究提高秸稈低溫消化產(chǎn)甲烷性能的方法，對(duì)推進(jìn)中國乃至世界寒區(qū)秸稈沼氣工程應(yīng)用具有重要的科學(xué)意義[5]。

與中溫（35 ℃）和高溫（55 ℃）厭氧消化相比，低溫（≤20 ℃）厭氧消化性能不佳，主要因?yàn)闇囟扔绊懳⑸锏幕钚裕瑴囟冉档褪辜?xì)胞膜上運(yùn)輸?shù)鞍淄ǖ雷冋?，?xì)胞攝入物質(zhì)能力下降，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，數(shù)量變少。古菌比細(xì)菌對(duì)低溫更敏感，導(dǎo)致反應(yīng)器內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA）積累和pH值下降，啟動(dòng)及運(yùn)行困難，甲烷產(chǎn)量低[6]。

目前，提高低溫厭氧消化產(chǎn)甲烷的方法主要有：馴化低溫接種物提高微生物耐受性[7-8]；降低有機(jī)負(fù)荷（organic loading rate，OLR）避免酸抑制[9]；加入顆?；钚蕴縖10]、磁鐵礦、石墨烯[11]等導(dǎo)電材料促進(jìn)直接電子轉(zhuǎn)移；共發(fā)酵優(yōu)化C/N[12]、反應(yīng)器優(yōu)化改造[13]和生物強(qiáng)化技術(shù)[14]等。其中，生物強(qiáng)化是通過添加具有特定功能微生物來提高消化性能的一種直接的方法[15-16]。

此前，利用本實(shí)驗(yàn)室已馴化的丙酸產(chǎn)甲烷菌群對(duì)能源草[17]、雞糞[18-19]和餐廚垃圾[20]的中溫厭氧消化進(jìn)行生物強(qiáng)化，證實(shí)產(chǎn)甲烷菌群可恢復(fù)酸敗、緩解氨抑制并提高產(chǎn)甲烷率。此外，嘗試了利用中溫丙酸產(chǎn)甲烷菌群強(qiáng)化低溫連續(xù)厭氧發(fā)酵[21]和低溫批式牛糞-秸稈共發(fā)酵[22]，雖然產(chǎn)甲烷性能比未強(qiáng)化的低溫發(fā)酵有所提升，但與中溫產(chǎn)甲烷水平還具有一定差距。因此，為進(jìn)一步提高低溫厭氧發(fā)酵的生物強(qiáng)化性能，本實(shí)驗(yàn)室又馴化出了低溫丙酸產(chǎn)甲烷菌群，目前，利用低溫產(chǎn)甲烷菌群強(qiáng)化低溫厭氧消化的研究鮮有報(bào)道，因此有必要探究低溫產(chǎn)甲烷菌群對(duì)秸稈低溫厭氧消化的生物強(qiáng)化作用。

生物強(qiáng)化菌群添加量是影響強(qiáng)化效果及成本的重要因素，因此，本研究探究菌群劑量對(duì)秸稈低溫厭氧消化生物強(qiáng)化效果的影響，確定最佳劑量，并揭示生物強(qiáng)化的微生物機(jī)理，為提高低溫厭氧消化性能提供理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 原料、接種物及生物強(qiáng)化菌系

原料為玉米秸稈（maize stover，MS），粉碎至粒徑為1 mm備用。接種物為牛糞沼液，接種前分別進(jìn)行一周的低溫（20 ℃）或中溫（37 ℃）馴化（纖維素為碳源，OLR為0.5g/(L·d)。低溫和中溫接種物微生物群落組成詳見2.5.1和2.5.2節(jié)，接種前進(jìn)行一周的脫氣處理，0.4 mm網(wǎng)孔紗布過濾。生物強(qiáng)化菌系（bioaugmentation seeds，BS）為丙酸產(chǎn)甲烷菌群，取自中國科學(xué)院廣州能源研究所長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行的70 L低溫（20±1）℃厭氧消化罐，其產(chǎn)甲烷水平與中溫（35 ℃）條件下相當(dāng)，利用丙酸的VS產(chǎn)甲烷率為390 mL/g，是理論產(chǎn)甲烷率的74%。菌系添加形式為菌泥，將菌液離心（4 000 r/min，5 min）后獲得。表1為各試驗(yàn)原料的基本參數(shù)。

表1 原料、接種物、生物強(qiáng)化菌系基本特性

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置發(fā)酵TS濃度為8%，反應(yīng)器為1 000 mL，工作體積為800 mL，設(shè)置9個(gè)試驗(yàn)組，6個(gè)生物強(qiáng)化組，為R1～R6，生物強(qiáng)化劑量（g/g，以VS計(jì)）分別為3%、6%、9%、12%、15%、18%；另設(shè)置3組對(duì)照組，分別為RM：中溫不加菌系對(duì)照組；R0：低溫不加菌系對(duì)照組，RIn：生物強(qiáng)化對(duì)照組，添加18%的秸稈發(fā)酵液菌泥（發(fā)酵液離心）。各反應(yīng)器分別在低溫（20±1）℃培養(yǎng)箱和中溫（37±1）℃水浴鍋中運(yùn)行。定期測(cè)定產(chǎn)氣量、甲烷含量、pH值、VFAs，定期取樣置于-80 ℃保存，用于微生物分析。

1.3 測(cè)試及分析方法

TS和VS按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定[23]，秸稈木質(zhì)纖維素成分分析按照美國可再生能源實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定（LAP，NREL）[24]。C、H、N元素含量通過Vario EL（elementar analysensysteme gmbh，Hanau，Germany）元素分析儀測(cè)定，pH值通過便攜式pH計(jì)測(cè)定（梅特勒-托利多FE28），測(cè)試前用pH值為4.00、7.00、10.01的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液進(jìn)行校準(zhǔn)，VFAs濃度使用高效液相色譜儀（Model e2698，Waters，US）測(cè)定。色譜儀配有 Bio-RAD 色譜柱，溫度設(shè)置為50 ℃，流動(dòng)相為0.005 mM H2SO4，流速為0.5 mL/min。氣體成分采用氣相色譜（島津 GC-2014 型）測(cè)定。

1.4 動(dòng)力學(xué)分析

修正的Gompertz方程已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于批式厭氧消化過程的模擬分析，利用此方程對(duì)產(chǎn)甲烷潛力、最大產(chǎn)甲烷速率和延滯期進(jìn)行模擬[25]。

式中為時(shí)刻單位VS底物的累積甲烷產(chǎn)量，mL/g；為最終累積VS甲烷產(chǎn)率，mL/g；R為日最大VS甲烷產(chǎn)率，mL/(g·d)；e為自然對(duì)數(shù)常數(shù)，其值為2.713；為延滯期，d；為試驗(yàn)時(shí)間，d。

1.5 高通量測(cè)序分析方法

高通量測(cè)序用于分析發(fā)酵系統(tǒng)中微生物群落組成結(jié)構(gòu)。樣品提取DNA后，利用 Qubit4.0 DNA 檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組 DNA 精確定量，進(jìn)行兩輪PCR 擴(kuò)增，對(duì) DNA 純化回收，經(jīng)等量混合后進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序后得到的有效序列采用RDP 分類算法進(jìn)行分類學(xué)分析，通過識(shí)別古菌和細(xì)菌序列、物種豐富度，在不同生物分類水平進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物強(qiáng)化菌系劑量對(duì)低溫厭氧消化產(chǎn)甲烷性能的影響

不同生物強(qiáng)化劑量對(duì)秸稈低溫厭氧消化累積產(chǎn)甲烷率的影響如圖1a所示，與不加強(qiáng)化菌系的R0相比，所有劑量的生物強(qiáng)化組產(chǎn)氣性能均有不同程度的提升，當(dāng)添加劑量不高于12%時(shí)，累積VS產(chǎn)甲烷率隨菌系添加量增加而升高，與之相反，劑量高于12%時(shí)，隨添加量增加而降低，這可能是由于添加的強(qiáng)化菌系過多，底物被菌群降解用于自身生長(zhǎng)，消耗了部分產(chǎn)甲烷的底物。因此，在試驗(yàn)設(shè)置的劑量范圍內(nèi)，最佳劑量為12%，即R4，其累積VS產(chǎn)甲烷率最高，達(dá)134.1 mL/g，比R0提高2.35倍，達(dá)到中溫組RM的66%，其余劑量的生物強(qiáng)化組累積產(chǎn)甲烷率從高到低依次為15%（R5）、9%（R3）、6%（R2）、18%（R6）、3%（R1），提高產(chǎn)甲烷率1.3～2.4倍，此外，除最低劑量3%的R1外，其余添加丙酸產(chǎn)甲烷菌系的試驗(yàn)組均比添加18% 的秸稈發(fā)酵液菌泥強(qiáng)化的RIn的產(chǎn)甲烷率高，提升了30%～54%，但3%（R1）在前15 d內(nèi)產(chǎn)甲烷優(yōu)于RIn，由此可見，添加丙酸產(chǎn)甲烷生物強(qiáng)化菌系進(jìn)行針對(duì)性強(qiáng)化，可有效提升低溫厭氧消化產(chǎn)甲烷性能。在此前利用中溫丙酸產(chǎn)甲烷菌系強(qiáng)化牛糞與秸稈低溫共發(fā)酵研究中，投加14%的最佳劑量下，累積VS產(chǎn)甲烷率提升至36.0 mL/g[22]，不到中溫產(chǎn)甲烷的40%，與之相比，本研究利用低溫丙酸產(chǎn)甲烷菌系強(qiáng)化，可達(dá)到中溫條件下產(chǎn)甲烷率的66%，效果更優(yōu)。

注：R0：低溫對(duì)照組，R1～R6：添加不同劑量生物強(qiáng)化菌系，R1：3%，R2：6%，R3：9%，R4：12%，R5：15%，R6：18%，RIn：添加18%秸稈發(fā)酵液離心菌泥，RM：中溫對(duì)照組，下同。

從日產(chǎn)甲烷率（圖1b）可以看出，所有生物強(qiáng)化組在試驗(yàn)的前18 d產(chǎn)氣性能均比R0有所提升，菌群添加量越大，日產(chǎn)甲烷率越高，且達(dá)到最大產(chǎn)甲烷率需要的時(shí)間越短，R6在第3天內(nèi)達(dá)到最大值，達(dá)到584.26 mL/(L·d)，是R0的4.8 倍，是RIn的4.3倍，達(dá)到中溫（RM）最大日產(chǎn)甲烷量的77%，這表明投加生物強(qiáng)化菌群可加快產(chǎn)甲烷進(jìn)程，且強(qiáng)化體系的產(chǎn)氣率高峰時(shí)間和菌群添加量呈正相關(guān)。

2.2 生物強(qiáng)化菌系劑量對(duì)低溫厭氧消化VFAs和pH的影響

不同生物強(qiáng)化劑量對(duì)VFAs的影響如圖2a所示，所有試驗(yàn)組VFAs均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，添加丙酸產(chǎn)甲烷菌群生物強(qiáng)化組VFAs濃度始終低于R0和RIn，R0和RIn的VFAs濃度在試驗(yàn)第12天內(nèi)和9天內(nèi)達(dá)到最大值，分別為9.6和6.0 g/L，RM的VFAs在第0天達(dá)到最大值5.22 g/L后一直下降，而生物強(qiáng)化組VFAs濃度最大范圍處于0.89～4.5 g/L，較R0、RIn、RM組分別減少53.03%～90.71%、24.87%～85.14%、12.28%～83.82%，表明添加生物強(qiáng)化菌系可加快VFAs的降解，VFAs積累程度取決于菌系添加量，菌系添加劑量越高，VFAs積累程度越小。

試驗(yàn)過程中各組VFAs組分變化如圖2b～2d所示，在整個(gè)發(fā)酵過程中，乙酸和丙酸是主要的揮發(fā)酸，同時(shí)檢測(cè)到少量丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸。低劑量組R1和R2在第6天乙酸達(dá)到最大值，分別為2.33和1.74 g/L。高劑量組R3、R4、R5、R6的乙酸一直無明顯積累，9 d內(nèi)基本降解，濃度小于0.5 g/L。R0和RIn乙酸濃度分別在12 d和9 d內(nèi)達(dá)到最大值，分別為4.43和2.94 g/L，RM最初就達(dá)到最大值2.7 g/L，迅速降解。額外添加菌群可促進(jìn)乙酸降解產(chǎn)甲烷，但投加秸稈發(fā)酵液離心后的菌泥對(duì)乙酸降解速率和效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于投加丙酸產(chǎn)甲烷菌群系。丙酸變化趨勢(shì)與乙酸基本一致，高劑量組R3、R4、R5、R6丙酸無明顯累積，基本呈下降趨勢(shì)，在12 d內(nèi)全部降解；R1和R2丙酸濃度分別在9 d內(nèi)和6 d內(nèi)達(dá)到最大值，分別為1.97和1.49 g/L，在20 d和15 d全部降解，丙酸濃度大于1 000 mg/L對(duì)產(chǎn)甲烷菌有抑制作用[20,26]，這是低劑量生物強(qiáng)化后產(chǎn)甲烷率仍然不高的原因。R0丙酸濃度在12 d內(nèi)達(dá)到最大值3.88 g/L，后期積累的丙酸一直無明顯降解，導(dǎo)致pH降低及產(chǎn)甲烷率下降。RIn丙酸濃度在12 d達(dá)到最大值2.65 g/L，直至試驗(yàn)結(jié)束才全部降解，說明添加秸稈發(fā)酵液離心的菌泥可以緩解丙酸積累，但是依然不能解除酸抑制，RM初始丙酸濃度最高，達(dá)2.22 g/L，在12 d內(nèi)就全部降解。從丙酸濃度來看，生物強(qiáng)化菌群劑量越高，降解丙酸能力越強(qiáng)，生物強(qiáng)化可極大地促進(jìn)丙酸降解，解除低溫消化酸抑制，從而提高產(chǎn)甲烷率，加快反應(yīng)進(jìn)程。這與本實(shí)驗(yàn)室前期利用丙酸產(chǎn)甲烷菌群強(qiáng)化不同原料中溫厭氧發(fā)酵生物強(qiáng)化的結(jié)果類似，即均可有效降解丙酸及乙酸，避免酸抑制，從而提高產(chǎn)甲烷率[18-22]。

圖2 低溫生物強(qiáng)化對(duì)總揮發(fā)性脂肪酸濃度和各組分揮發(fā)酸濃度的影響

圖3為不同菌系劑量添加對(duì)發(fā)酵體系內(nèi)pH值的影響。各試驗(yàn)組都呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，這是因?yàn)樵谠囼?yàn)反應(yīng)初期發(fā)酵系統(tǒng)主要進(jìn)行水解產(chǎn)酸，VFAs的積累導(dǎo)致pH值下降。后期升高說明系統(tǒng)內(nèi)的VFAs被降解，未添加生物強(qiáng)化菌系組pH值比強(qiáng)化組波動(dòng)大，表明：加入低溫強(qiáng)化菌系可維持系統(tǒng)pH值穩(wěn)定，并且可看出，在一定范圍內(nèi)，菌系劑量越高，pH值波動(dòng)幅度越小，系統(tǒng)越穩(wěn)定。R0、RIn與RM的pH值在試驗(yàn)初期呈現(xiàn)急劇下降的趨勢(shì)，而R0直至第9天內(nèi)下降到最低值6.5，說明低溫抑制產(chǎn)甲烷微生物活性，導(dǎo)致?lián)]發(fā)酸不能被及時(shí)利用，形成酸抑制，這是低溫消化啟動(dòng)慢、產(chǎn)甲烷性能差的原因。

圖3 低溫生物強(qiáng)化對(duì) pH值的影響

2.3 低溫厭氧消化生物強(qiáng)化效果的統(tǒng)計(jì)分析

表2詳細(xì)對(duì)比了不同菌系添加量對(duì)秸稈低溫批式厭氧消化的生物強(qiáng)化效果，可以看出各劑量的生物強(qiáng)化均可提高累積產(chǎn)甲烷率，產(chǎn)甲烷增強(qiáng)倍數(shù)反映了累積產(chǎn)甲烷率的提升效果，菌系添加量為12% 的R4產(chǎn)甲烷增強(qiáng)倍數(shù)最高，較R0提高2.4倍，其他反應(yīng)器增強(qiáng)倍數(shù)從大到小依次為R5、R2、R6、R3、R1，分別提升了2.24、2.01、1.98、1.91、1.27倍。因此，在甲烷增強(qiáng)倍數(shù)方面，12%的低溫菌系劑量最佳。

表2 低溫厭氧消化生物強(qiáng)化效果的統(tǒng)計(jì)分析

注：生物強(qiáng)化效率=（生物強(qiáng)化組產(chǎn)甲烷率-R0產(chǎn)甲烷率）/菌劑添加量；Ino是秸稈發(fā)酵液離心收集的菌泥，80為累積產(chǎn)甲烷量達(dá)到總產(chǎn)甲烷量80%所需的時(shí)間。

Note: Bioaugmentation efficiency = (methane yield of bioaugmented reactors- methane yield of R0) / Bioaugmentation seeds adding mass. Ino is the microbial sediment collected from stover digestate.80is the time required for cumulative methane production to reach 80% of total production.

然而，生物強(qiáng)化效率隨菌系添加量先增加后降低，最大的生物強(qiáng)化效率在6%的劑量下獲得，達(dá)到31.3 mL/g（以VSBS計(jì)），其次為R4，達(dá)到20.9 mL/g（以VSBS計(jì)），因此，從單位質(zhì)量菌劑強(qiáng)化的效果考慮，6% g (VSBS/VSMS)劑量的R2生物強(qiáng)化效率最高。

80是累積產(chǎn)甲烷量達(dá)到總產(chǎn)甲烷量80%所需的時(shí)間，反映發(fā)酵體系底物甲烷化快慢的重要指標(biāo)之一。80越短，表明產(chǎn)甲烷效率越高。從表看出，不同劑量的生物強(qiáng)化組的80均有所提前，比低溫對(duì)照組縮短12～19 d。生物強(qiáng)化組80隨菌系增加而縮短，R3、R4、R5的80與中溫的80（12 d）相當(dāng)，R6的80僅9 d，比中溫的80提前3 d。此前利用中溫丙酸產(chǎn)甲烷菌系強(qiáng)化牛糞與秸稈低溫共發(fā)酵的80為42 d[22]，說明投加低溫丙酸產(chǎn)甲烷菌系的生物強(qiáng)化，顯著縮短了80，大大加快低溫厭氧消化產(chǎn)甲烷。

2.4 厭氧消化過程中甲烷生成的動(dòng)力學(xué)分析

不同菌系添加量產(chǎn)甲烷動(dòng)力學(xué)分析如表3所示。修正的Gompertz方程很好地模擬了不同菌系添加量對(duì)低溫消化的影響，決定系數(shù)2均在0.95以上，說明擬合程度較高。延滯期表示產(chǎn)甲烷活性，可表示厭氧消化過程中微生物對(duì)底物的利用情況，添加產(chǎn)甲烷菌群系會(huì)縮短延滯期，菌系劑量越大，延滯期越短，R表示日最大產(chǎn)甲烷率，R隨菌系添加量增加而提高，且添加18% 秸稈發(fā)酵液離心的菌泥對(duì)照組的和R低于所有添加丙酸產(chǎn)甲烷菌系組。說明生物強(qiáng)化可縮短低溫消化延滯期和提高VS產(chǎn)甲烷速率。

表3 不同菌群添加量下的修正Gompertz模型的參數(shù)

2.5 生物強(qiáng)化對(duì)發(fā)酵體系微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

2.5.1 對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

接種物及各反應(yīng)器內(nèi)細(xì)菌在屬水平的群落結(jié)構(gòu)如圖 4所示，低溫接種物（P-Ino）和中溫接種物（M-Ino）優(yōu)勢(shì)菌屬有較大差異，說明溫度影響微生物的群落組成，低溫接種物優(yōu)勢(shì)水解菌屬為（8.49%），（7.63%），（7.18%），（7.04%），（5.78%）；中溫接種物優(yōu)勢(shì)水解菌屬為（17.51%），（9.00%），（6.68%），（5.92%）。其中是產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌[27]，中溫優(yōu)勢(shì)菌屬為纖維素降解菌，而低溫接種物纖維素降解菌相對(duì)豐度較低，這是秸稈在低溫和中溫水解程度差異明顯的主要原因。低溫生物強(qiáng)化菌群（P-BS）優(yōu)勢(shì)菌屬為（23.43%），（16.15%），（12.12%），（4.50%），（4.43%），（4.27%），（3.41%）.是綠彎曲菌門中的主要屬，在厭氧條件下參與碳水化合物發(fā)酵[28]。通過代謝丙酸，最終生成乙酸[29]。在低溫消化組中所有反應(yīng)器之間群落結(jié)構(gòu)沒有明顯差異，與未生物強(qiáng)化組相比，前期生物強(qiáng)化組的相對(duì)豐度分別增加了1.47～8.77 倍，主要參與纖維素、淀粉的水解[30]。相對(duì)豐度后期提高4.19～10.79倍，屬主要參與厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸階段，以大分子碳水化合物為底物，代謝產(chǎn)物為氫氣和VFAs[31]。相對(duì)豐度提高2.35～4.05倍，主要功能為降解糖類基質(zhì)為乙酸[32]。相對(duì)豐度提高0.46～2.12倍，主要參與氨基酸降解[33]。而添加秸稈發(fā)酵液離心的菌泥對(duì)菌群結(jié)構(gòu)無顯著影響。中溫對(duì)照組中的水解菌屬遠(yuǎn)高于低溫試驗(yàn)組，因此秸稈在中溫水解程度更徹底，產(chǎn)甲烷率高。以上結(jié)果表明添加生物強(qiáng)化菌群可以提高水解菌系的豐度，為秸稈轉(zhuǎn)化為甲烷提供了更多的中間產(chǎn)物。

2.5.2 對(duì)古菌群落結(jié)構(gòu)的影響

接種物及各反應(yīng)器內(nèi)古菌在屬水平的群落結(jié)構(gòu)如圖 5所示。

注：M-Ino：中溫接種物，P-Ino：低溫接種物，P-BS：低溫生物強(qiáng)化菌系；RIn：添加18%秸稈發(fā)酵液離心菌泥，下同。

圖5 產(chǎn)甲烷古菌群落在屬水平上的演替

低溫接種物（P-Ino）和中溫接種物（M-Ino）的古菌屬群落結(jié)構(gòu)差異不大，優(yōu)勢(shì)菌屬均為乙酸型產(chǎn)甲烷菌和甲烷桿菌屬，而低溫生物強(qiáng)化菌系（PBS）的優(yōu)勢(shì)菌屬為（69.17%）與（17.85%），為乙酸型產(chǎn)甲烷菌，將乙酸代謝為甲烷；是厭氧系統(tǒng)中常見的產(chǎn)甲烷菌屬，能利用多種產(chǎn)甲烷基質(zhì)，可通過3種代謝途徑產(chǎn)甲烷（甲醇及甲胺類物質(zhì)、乙酸、氫）[34]。在生物強(qiáng)化組內(nèi)，隨著菌群添加量的增加，的相對(duì)豐度逐漸上升，相對(duì)豐度從 55.23%依次上升至63.23%、64.93%、67.24%、71.62%、73.19%、 73.92%。強(qiáng)化系統(tǒng)中的相對(duì)豐度的增加，加快了乙酸的降解速率，增強(qiáng)了產(chǎn)甲烷古菌的代謝途徑，這也是體系內(nèi)產(chǎn)甲烷性能提升的主要原因。因此，投加低溫生物強(qiáng)化菌群可以維持產(chǎn)酸、產(chǎn)甲烷階段相平衡，避免中間產(chǎn)物酸的累積。秸稈發(fā)酵液離心的菌泥強(qiáng)化組（RIn）和對(duì)照組（R0) 相比產(chǎn)甲烷菌屬的豐度并沒有提高，生物強(qiáng)化體系的相對(duì)豐度均低于RIn和R0，且相對(duì)豐度隨菌群添加量增加而降低，是低pH下的一種酸耐受菌[35]，這也可以解釋生物強(qiáng)化組緩解VFAs積累避免了pH值下降。中溫組優(yōu)勢(shì)菌屬也是19.80%～42.21%）和13.38%～27.12%），但豐度隨消化時(shí)間而提高，這可說明中溫條件更有利于其繁殖生存。

綜上，添加生物強(qiáng)化菌群增加了與的相對(duì)豐度，加速了乙酸降解，提高產(chǎn)甲烷率。這與前期投加中溫丙酸產(chǎn)甲烷菌系強(qiáng)化中溫厭氧發(fā)酵的試驗(yàn)結(jié)果類似，即通過提高的相對(duì)豐度促進(jìn)產(chǎn)甲烷[36-37]。

3 結(jié) 論

1）生物強(qiáng)化可促進(jìn)秸稈低溫厭氧消化，提高產(chǎn)甲烷率、縮短厭氧發(fā)酵時(shí)間，菌系添加量為6%時(shí)，單位VS菌系提升產(chǎn)甲烷率最高，達(dá)到31.3 mL/g；菌系添加量為12%時(shí)，促進(jìn)產(chǎn)甲烷效果最佳，累積VS產(chǎn)甲烷率達(dá)到134.1 mL/g，提升產(chǎn)甲烷率2.35倍，菌系添加量為18%時(shí)，日產(chǎn)甲烷率達(dá)到584.26 mL/(L·d)，是空白對(duì)照的4.8倍，達(dá)到中溫的77%，強(qiáng)化體系的產(chǎn)氣率高峰時(shí)間和菌群添加量呈正相關(guān)，且最大產(chǎn)甲烷率對(duì)應(yīng)的時(shí)間越短，80縮短12～19 d，與中溫厭氧消化時(shí)間相當(dāng)。

2）生物強(qiáng)化可促進(jìn)秸稈低溫厭氧消化體系內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸的降解，尤其乙酸和丙酸，高劑量的生物強(qiáng)化體系（9%、12%、15%、18%）中乙酸和丙酸無明顯積累；低劑量組（3%、6%）乙酸和丙酸稍有累積；而未生物強(qiáng)化組乙酸和丙酸積累達(dá)到4.43和3.88 g/L，嚴(yán)重抑制產(chǎn)甲烷，導(dǎo)致產(chǎn)甲烷率較低。生物強(qiáng)化加快揮發(fā)酸降解，避免酸抑制，提高甲烷產(chǎn)率。

3）修正Gompertz方程可很好地模擬添加產(chǎn)甲烷菌群系對(duì)秸稈的厭氧消化的影響，決定系數(shù)均在0.95以上，隨生物強(qiáng)化菌系添加量的增加，延滯期縮短，單位VS產(chǎn)甲烷率提高。添加產(chǎn)甲烷菌群系生物強(qiáng)化低溫消化可有效縮短延滯期和提高甲烷產(chǎn)率。

4）低溫生物強(qiáng)化增加了產(chǎn)甲烷古菌與的相對(duì)豐度，從而提高了低溫秸稈產(chǎn)甲烷率；此外，生物強(qiáng)化還可提高水解細(xì)菌的相對(duì)豐度，促進(jìn)秸稈水解及甲烷轉(zhuǎn)化進(jìn)程。

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Bioaugmentation of psychrophilic methanogenic microbial consortia on psychrophilic anaerobic digestion of maize stovers

ZHANG Xinjie1,2,3,4, SUN Yongming1,2,3, YAN Miao2,3, LI Jinping1,4, LI Ying2,3※

(1.,,730050,;2.,,510640,; 3.,,510640,; 4.,730050,)

A large number of maize stover can be generated per year in recent years. Sustainable treatments of maize stover can be expected to produce the renewable energy. Among them, anaerobic digestion is a friendly biotechnology to recover the renewable energy from maize stover. Especially, the psychrophilic anaerobic digestion can only require less energy input, compared with the commonly-used mesophilic and thermophilic digestors. However, a psychrophilic environment can inhibit the microbial activity, causing the low efficiency of methane production. In this study, the bioaugmentation of psychrophilic propionate-degrading consortia (the mixture of propionic-degrading consortia and acetogenic methanogen) was conducted to boost the anaerobic digestion of corn straw in psychrophilic batch reactors, with the different dosages of 3%, 6%, 9%, 12%, 15%, and 18% at low temperature (20 ℃). The concentrated indigenous inoculum with the dosage of 18% was introduced as the control. The reactor performance, microbial metabolites, and microbial community dynamics were analyzed to investigate the optimum dosage and mechanism. The results showed that the bioaugmentation consortia was improve the methane production rate under a psychrophilic anaerobic environment, as evidenced by 1.27 to 2.24 times increase in the bioaugmented groups, compared with the control (without bioaugmentation). The bioaugmentation dosage in the range of 3% to 12% was positively correlated with the methane yields. The optimal dose was 12%, with the methane yields of 134.1 mL/g VS. The accumulative methane yield was 2.35 times higher than that of the control. By contrast, there was no increase in the methane yields within the higher bioaugmentation dosage (i.e., 15%-18%). The modified Gompertz model showed that the concentrated indigenous inoculum was reduced the lag phase from 3.501 to 12.509 days, indicating the necessity of bioaugmentation with the key microbial consortia to boost the methane yields. Bioaugmentation inocula with the propionate-degrading consortia was shorten the lag phase from 0.716 to 12.509 days, whereas, there was the increase in the maximum methane production rate from 2.445 to 17.929 mL CH4/(gVS·d). Meanwhile, the psychrophilic environment was caused the acetate accumulation up to 4.43 g/L. At the same time, the propionate concentrations were kept at 3.88 g/L in the control reactor in the whole experimental process. Conversely, the bioaugmentation with psychrotrophic propionate-degrading consortia was accelerated the VFAs degradations, especially the acetate and propionate, which was 53.03%-90.71% less than that of the control reactor. Moreover, the acetate and propionate were fully degraded within the first 9 days in the bioaugmented reactors with 9%-15% dosage, indicating the important role of bioaugmented consortia in the scavenging propionate and acetate. Microbial analysis showed that the bioaugmentation increased the relative abundance of taxa (e.g., Proteocatella, Smithella, Peptococcaceae) for the hydrolysis and acetogenesis process. The dominant methanogens in the bioaugmented reactors were represented by acetoclastic methanogens (i.e., Methanothrix and Methanosarcina) and hydrogenotrophic methanogen (Methanobrevibacter), indicating the key contributions to increase the methane yield under psychrotrophic environment. Consequently, the bioaugmentation consortia can generate a domino effect, where acetate levels were reduced first and other VFAs degradation became thermodynamics feasible, leading to the balance between VFAs degradation and methane production. This finding can provide the evidence and guidance to improve the psychrophilic anaerobic digestion through bioaugmentation.

methane; maize stover; psychrophilic anaerobic digestion; bioaugmentation; microbial community

10.11975/j.issn.1002-6819.202211136

S21；TK6

A

1002-6819(2023)-06-0186-08

張新杰，孫永明，閆淼，等. 低溫產(chǎn)甲烷菌群對(duì)玉米秸稈低溫厭氧消化的生物強(qiáng)化作用[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2023，39(6)：186-193.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.202211136 http://www.tcsae.org

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2022-11-15

2023-03-08

中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)(XDA21050400)；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（52170143）；廣東省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2021A1515012082）；中國科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)

張新杰，研究方向?yàn)榈蜏貐捬醢l(fā)酵與生物強(qiáng)化技術(shù)。Email：zhangxinjie1222@163.com

李穎，博士，研究員，研究方向?yàn)橛袡C(jī)固體廢棄物生物處理及資源化利用。Email：liying@ms.giec.ac.cn