何陽 高西京 薛喜梅 孫建飛

Ras同源基因(Ras homolog gene, Rho)/Rho相關螺旋卷曲蛋白激酶(Rho-associated coiled coil-forming protein kinase, ROCK)信號通路與腫瘤的發(fā)展有密切聯系[1]。Rho/ROCK通路由核心成員組成,包括Rho三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate, GTP)家族、Rho(A、B和C)、Ras相關蛋白(Ras-related protein, Rac)(1、2和3)和細胞分裂控制蛋白42 (cell division control protein 42, Cdc42),以及下游分子Rho相關含卷曲螺旋域蛋白激酶(Rho-associated coiled coil domain containing protein kinases, ROCK)1/2[2]。RhoA、RhoB和RhoC是ROCK1/2活性的上游調節(jié)因子,處于活性狀態(tài)時,能夠與ROCK1/2的Rho結合域相互作用以增強其活性[3]。一旦Rho/ROCK 通路被異常激活并轉移到特定的亞細胞位置,Rho/Rac蛋白就會與下游效應子合作激活特定的信號網絡,進而促進癌細胞存活、遷移和生長[4]。中藥含多種化學成分, 對抗腫瘤有明確的療效[5]。眾多研究發(fā)現并證實了中藥單藥、中藥單體及中藥復方能夠調控Rho/ROCK信號通路并抑制腫瘤轉移。本文對中藥通過此通路抑制腫瘤轉移方面做一總結,以期為臨床提高抗腫瘤效果發(fā)揮一定的作用。

1 中藥抑制腫瘤血管生成擬態(tài)、降低血管通透性,延緩腫瘤進展

血管生成擬態(tài)(vascular mimcry, VM)是指具有豐富細胞外基質的血液供應系統的新管狀網絡。VM類似于毛細血管,在多種腫瘤模型中都發(fā)現血管生成擬態(tài)的存在,能快速造成腫瘤轉移[6]。上皮鈣黏素(E-cadherin)和磷酯酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)是VM形成的關鍵蛋白,有研究證實ROCK通路的激活能上調E-cadherin和PI3K的表達水平,且ROCK是VM形成的關鍵因子[7]。PI3K/Akt信號通路被眾多研究證實與血管生成關系密切。當PI3K被激活時,與蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)結合,促使Akt磷酸化并激活,從而促進血管生成[8, 9]。現代藥理研究表明,黃芪、莪術、重樓均可抑制腫瘤細胞增殖、轉移,抑制腫瘤血管新生以及修復內皮損傷、保護血管[10]。黃芪多糖與姜黃素聯用能減少血管分支和出芽,改善血管的形狀,促進腫瘤血管正?；?抑制血管過度滲漏進而抑制腫瘤的發(fā)展[11]。實驗證明重樓皂苷對癌細胞的增殖、遷移和侵襲具有一定的抑制作用,并能導致癌細胞的凋亡[12]。劉甜甜[13]將黃芪—莪術—重樓配伍,模擬結腸癌細胞穿越血管內皮的過程,發(fā)現用藥后能夠抑制結腸癌細胞轉移至其他部位,其機制可能是三藥配伍抑制了通路的激活,降低RhoA、ROCK蛋白表達,使緊密連接蛋白ZO-1表達水平升高,降低血管的通透性,維持血管屏障功能。張哲等[14]進行體內體外實驗,發(fā)現黃芩素劑量依賴性抑制肺癌細胞的增殖和VM形成,其機制可能是通過RhoA/ROCK信號抑制VM形成從而來改善腫瘤患者的預后。在張仲景的《金匱要略》中提到鱉甲煎丸具有活血化瘀,軟堅散結之功效,臨床中廣泛用于治療肝癌等疾病?，F代藥理學研究發(fā)現鱉甲煎丸能夠下調RhoA和ROCK1的表達,抑制VM形成和血管樣結構的增多,而且也能抑制肝癌細胞的增殖,促進癌細胞凋亡,從而在一定程度上抑制肝癌的轉移[15]。

中醫(yī)學認為,癌病病機以“虛、瘀、毒”為主,黃芪補氣,莪術重在破氣行血,重樓可活血解毒,三藥協同配伍,在祛邪的同時固護人體正氣,攻補兼施。但是以上研究在構建腫瘤模型,研究腫瘤轉移的機制時,大多無法充分反映腫瘤細胞跨越內皮細胞完成血行轉移過程,之后可進一步研究中藥對腫瘤血行轉移的影響。

2 中藥調節(jié)Rho/ROCK信號通路抑制癌細胞的增殖

細胞周期進展依賴于細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)的激活。眾所周知,p21蛋白是CDK的抑制蛋白,能夠阻滯癌細胞DNA的復制,抑制細胞質中ROCK蛋白活性。腫瘤細胞可活化RhoA/ROCK 通路,下調p21的表達,促進癌細胞的增殖。有實驗表明[16],移植肝腫瘤模型小鼠應用抗癌中藥(三棱、莪術、赤芍、鱉甲、當歸、川芎、豬苓、玄胡、丹參、紫草根、白花蛇舌草、半枝蓮、蒲公英、大黃)能夠降低RhoA、ROCK的表達水平,而p21相較于模型組呈高表達。由此提示抗癌中藥通過抑制Rho/ROCK通路的活化,提高p21蛋白的含量,從而抑制了肝腫瘤的增殖。阮善明等[17]運用解毒三根湯(藤梨根、虎杖根、水楊梅根)在正氣未損前即運用解毒法干預并協同5-氟尿嘧啶治療結腸癌小鼠,癌細胞中ROCK2陽性表達顯著降低,Caspase-3表達顯著上調,明顯了延長小鼠的生存期,表明解毒法聯合化療藥物能夠促進癌細胞凋亡,抑制癌細胞增殖。廖山嬰等[18]發(fā)現,復方斑蝥膠囊能降低大鼠胃癌發(fā)生率,延緩腫瘤生長,其作用機制可能是復方斑蝥膠囊抑制RhoA/ROCK信號的活化,下調了下游的PI3K、HIF-1α蛋白水平,從而抑制癌細胞的增殖進展。“有胃氣則生,無胃氣則死”,黃芪建中湯具有溫中健脾補氣,緩急止痛之功,可培氣血生化之源,氣血充足則有抗癌之能力,在治療多種腫瘤中有抑制癌細胞生長的作用。黃芪建中湯含藥血清能夠明顯抑制胃癌細胞SNU-1的增殖和轉移能力,同時降低ROCK1基因及蛋白的表達量[19]。

延緩腫瘤細胞周期進展對減少腫瘤增殖,抑制腫瘤轉移具有不可替代的作用,而目前在Rho/ROCK通路中多研究CDK的抑制蛋白p21,缺乏對CDK家族中其他蛋白的相關研究。

3 中藥調節(jié)Rho/ROCK信號通路促進癌細胞凋亡

Rho激酶系統能夠參與細胞內多種信號通路,例如在凋亡通路中,ROCK1不僅在凋亡小體形成過程中發(fā)揮重要作用,而且ROCK1經過裂解活化后可激活內源性凋亡途徑,而激活這一凋亡途徑后凋亡執(zhí)行效應蛋白Caspase-3又可反饋增強ROCK1活化,促使細胞凋亡進程不斷增強[20]。白血病作為全球腫瘤的主要類型之一,其發(fā)病率和病死率均位于前列。沙蟾毒精是一種可以阻斷腫瘤血管生成,從而抑制腫瘤的惡性增殖和轉移的蟾蜍二烯醇化物,是蟾蜍毒液的主要有效成分。研究證實沙蟾毒精能夠激活RhoA/ROCK1信號通路,增加線粒體膜通透性、降低膜電位,酶解活化Caspase-3,最終白血病細胞凋亡增多[21]。從白芷中提取的歐前胡素也被證明具有抗腫瘤作用,可抑制癌細胞增殖,并能誘導癌細胞凋亡[22]。有研究表明歐前胡素[23]能抑制前列腺癌細胞侵襲、促進其凋亡,可能是由于歐前胡素降低了RhoA、ROCK1 mRNA和蛋白表達,進而抑制RhoA/ROCK1信號通路的激活。同樣,最新研究[24]也表明番茄紅素能明顯下調RhoA和ROCK蛋白表達,促進小鼠骨肉瘤細胞凋亡、抑制細胞增殖。

4 中藥調控Rho/ROCK信號通路減少細胞外基質降解,抑制癌細胞侵襲

腫瘤微環(huán)境的細胞成分能夠調節(jié)細胞外基質(extracellular matrix, ECM)的產生和重塑來促進腫瘤生長。Rho/ROCK信號能夠增強ECM硬度,改變ECM組成,增加腫瘤相關成纖維細胞和淋巴細胞的運動性,并促進腫瘤相關淋巴細胞的跨內皮遷移[25]。Rho/ROCK蛋白調節(jié)ECM降解和重建,促進局部癌細胞浸潤,其主要是通過提高基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)和金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of matrix metalloproteinas, TIMP)的水平[26]。MMP-2是MMP家族的成員,由于其對降解ECM、加速腫瘤生長及促進腫瘤血管生成的作用,故其表達增加與腫瘤細胞侵襲相關[27]。以往研究證實芍藥苷能夠抑制膠質母細胞瘤中的RhoA-ROCK信號通路,抑制癌細胞遷移、侵襲及細胞骨架重排[28],通過進一步應用分子對接尋找芍藥苷抑制腦膠質瘤的潛在靶點并通過實驗研究進行驗證,最終發(fā)現芍藥苷組(25 μmol/L)降低了MMP-2、MMP-9的表達,抑制腦膠質瘤細胞的侵襲[29]。另有研究提示花姜酮[30]同樣能通過RhoA/ROCK1通路降低MMP-2、MMP-9水平,減少ECM和基底膜的降解,進一步抑制肝癌的侵襲和轉移。蓮子心的有效活性成分甲基蓮心堿對肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌和骨肉瘤均有一定的治療作用,甲基蓮心堿能夠下調MMP-2、MMP-9和ROCK1蛋白表達,且呈濃度依賴性,進一步通過分子對接研究證明甲基蓮心堿與ROCK1的親合力強于ROCK通路抑制劑法舒地爾[31],提示甲基蓮心堿可作為ROCK通路抑制劑,阻斷ROCK通路從而抑制非小細胞肺癌的遷移和侵襲。

通過以上研究發(fā)現應用現代技術可使中醫(yī)藥靶向治療腫瘤疾病和開發(fā)新型腫瘤抑制劑成為可能。

5 中藥調節(jié)Rho/ROCK信號通路恢復細胞極性并誘導細胞骨架改變

細胞極性指細胞形態(tài)、細胞膜、細胞骨架以及細胞器的不對稱性,比如分布的不對稱性。細胞的分化、遷移及旁分泌都受到細胞極性的影響,而細胞骨架的極性是其最重要的特征[32]。細胞骨架(cytoskeleton)是一個由細絲和纖維組成的系統,它們對于正常細胞和癌細胞的生存和多種細胞過程至關重要。細胞結構和細胞內細胞器重排和重新定位的改變導致細胞代謝的變化和獲得不適當的遷移和侵襲特征,并且還伴隨著腫瘤的進展,肌動蛋白和微管細胞骨架是支撐這些細胞過程的關鍵調節(jié)劑[33]。肌動球蛋白調節(jié)細胞形狀、重新排列細胞骨架,從而對細胞的增殖、分化、運動和粘附起著十分重要的作用,而其關鍵的調節(jié)因子在于Rho/ROCK信號傳導[34]。Rho通過ROCK調節(jié)LIM激酶(LIM kinase,LIMK),具有調節(jié)肌動蛋白—肌球蛋白細胞骨架動力學的功能,進而影響細胞的形態(tài)和極性[35]。現代藥理研究顯示,山慈菇的活性成分山慈菇總堿有體外細胞毒性和抗腫瘤作用,具體表現為抑制癌細胞增殖和轉移、減少新血管生成、增加癌細胞凋亡、提高免疫力[36]。將山慈菇含藥血清作用于人肝癌細胞,發(fā)現用藥后肝癌細胞E-cadherin蛋白水平顯著上升,抑制了上皮間質轉化,可能促進細胞間的粘附,抑制腫瘤生長[37]。研究證實姜黃素和黃芩素通過RhoA/ROCK-1信號通路能誘導喉癌細胞凋亡,抑制腫瘤細胞增殖[38, 39]。另外,姜黃素也能夠改變腫瘤細胞骨架的結構,主要是通過抑制口腔癌細胞Rho/ROCK信號通路中ROCK2的活化,從而誘導細胞骨架改變,一定程度上抑制了腫瘤細胞的侵襲和轉移[40]。李麗等[41]發(fā)現葫蘆素E能減少結腸癌細胞p-LIMK2蛋白的表達,表明葫蘆素E可能通過改變細胞骨架結構,從而抑制結腸癌細胞的遷移。

中藥活性成分具有一定的抗腫瘤作用,但以上研究中,中藥單體的應用大多局限于體內或體外實驗,缺乏較廣泛的臨床試驗,各研究團隊可拓寬中藥單體的應用范圍并證實其有效性及安全性。

6 調控Rho/ROCK信號通路抑制腫瘤轉移的主要中藥及其提取物

本文對部分國內外文獻中醫(yī)藥調控Rho/ROCK信號通路抑制腫瘤轉移的具體機制進行歸納總結,以方便讀者的查閱,見表1。

表1 中藥調控Rho/ROCK信號通路抑制腫瘤轉移的機制

續(xù)表

7 總結與展望

隨著對Rho/ROCK信號通路研究的深入研究,Rho/ROCK 信號通路被證實與多種疾病有關[42-44]。Rho/ROCK 信號通路對腫瘤的進展也起著不可忽視的作用,其異常表達或激活是腫瘤轉移的重要原因之一。

通過文獻研究可以看出:(1)中藥依靠其特性可以通過Rho/ROCK信號通路作用于下游靶點抑制VM的形成、減少癌細胞的增殖、促進凋亡、改變細胞骨架、抑制癌細胞的遷移或侵襲,從而抑制腫瘤的轉移與進展;(2)具有清熱解毒,活血化瘀的中藥復方,如抗癌中藥、復方斑蟄膠囊、鱉甲煎丸等在抑制癌細胞增殖方面具有較明顯作用,抗腫瘤療效顯著;(3)單味中藥的配伍在抗腫瘤中能起到協同作用,如黃芪—莪術—重樓配伍能夠激活ZO-1,保持血管通透性,進而減少腫瘤血管生成,延緩腫瘤進展。(4)中藥可作為Rho/ROCK信號通路抑制劑,例如通過分子對接發(fā)現甲基蓮心堿與法舒地爾復合體構象大體吻合,并能在抑制腫瘤中發(fā)揮作用。但本文認為目前在中藥發(fā)揮抗腫瘤作用的研究中存在以下問題:(1)目前相關腫瘤抑制劑的應用存在限制,較多依賴于細胞環(huán)境及腫瘤類型;(2)多數研究為基礎體內體外實驗,缺乏大樣本的臨床試驗證明中藥在抗腫瘤的有效性與安全性;(3)中藥復方及其單體的應用上缺乏中醫(yī)辨證論治思維,是否應考慮將中藥的功效與辨證論治相結合,更好的發(fā)揮抗腫瘤作用。本文基于Rho/ROCK信號通路介導腫瘤轉移的理論視角,闡明中醫(yī)藥抗腫瘤的作用機制;靶向調控Rho/ROCK信號通路來干預腫瘤疾病的發(fā)展及預后,有望為腫瘤疾病的治療提供新的策略,具有廣闊的應用前景。