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熱誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子ZmNF-YC13調(diào)控?zé)崦{迫應(yīng)答基因提高玉米耐熱性

2023-05-11 01:15梅秀鵬趙子堃賈欣瑤白洋李梅甘宇玲楊秋悅蔡一林
作物學(xué)報 2023年7期
關(guān)鍵詞:擬南芥高溫調(diào)控

梅秀鵬趙子堃賈欣瑤白 洋李 梅甘宇玲楊秋悅蔡一林,*

1西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院, 重慶 400715;2南方山地農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心, 重慶 400715;3廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)農(nóng)學(xué)與園藝系, 廣西南寧 530007

非生物脅迫是環(huán)境因素中對農(nóng)作物影響最為廣泛的脅迫因子[1-2]。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明, 1964—2007年間全球作物(水稻、玉米和小麥)產(chǎn)量因高溫和干旱導(dǎo)致的損失高達(dá)9%~10%[1], 在某些區(qū)域損失更高[3]。其中, 熱脅迫(heat stress)能影響作物的多個生理生化過程, 如高溫條件下玉米胚芽鞘的生長發(fā)育減緩[4],葉片光合效率降低, 玉米雄穗分枝以及雌花小花密度明顯減少, 籽粒產(chǎn)量降低[5-6], 以及玉米籽粒中淀粉、蛋白質(zhì)和油脂等成分的含量下降等[7]。

為應(yīng)對熱脅迫, 植物形成了一系列的調(diào)控機(jī)制[8]。研究表明, 一些轉(zhuǎn)錄因子和功能蛋白在熱脅迫應(yīng)答中發(fā)揮了重要作用。其中最為重要的一類就是熱激轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factor,Hsf)。如HsfA1s在熱脅迫應(yīng)答過程中扮演“主要調(diào)節(jié)因子”的角色, 在整個轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的激活過程中具有不可替代的作用[8]。在番茄和擬南芥中的研究表明, HsfA1s編碼基因的單突變或多突變均能引起植株的熱敏感表型和大量熱脅迫響應(yīng)基因表達(dá)水平的下降[9-11]。而且, HsfA1s還直接參與調(diào)節(jié)一些編碼重要熱脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子的基因, 例如脫水響應(yīng)元件結(jié)合蛋白Dehydration-Responsive Element Binding Protein 2A(DREB2A)、HsfA2、HsfA7a、HsfBs和多肽橋連因子Multiprotein bridging factor 1C(MBF1C)等[9]。熱激蛋白(heat shock proteins, HSPs)是由熱脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的主要功能蛋白, 其編碼基因也是熱脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的重要靶基因之一,同時在由熱脅迫導(dǎo)致的變性蛋白重折疊的質(zhì)量控制過程中也發(fā)揮重要作用[12-13]。如HSP21蛋白是擬南芥在熱脅迫條件下葉綠體正常發(fā)育所必需的[14]。過表達(dá)水稻HsfA2e和擬南芥HsfA2基因均能夠上調(diào)HSPs相關(guān)編碼基因的表達(dá), 并且增強(qiáng)植株的耐熱性[15-16]; 相反,HsfA2突變后增強(qiáng)了植株對熱脅迫的敏感性, 并且下調(diào)了許多與熱脅迫應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)[17]; 此外, HsfA2在維持HSP編碼基因的表達(dá)和延長植株獲得性耐熱能力的持續(xù)時間方面還具有重要作用[17]。

CCAAT Binding Factor/Nuclear Factor of the Y Box (CBF/NF-Y)是一類存在于真核生物中的調(diào)控因子[18], 由NF-YA (HAP2/CBF-B)、NF-YB (HAP3/CBF-A)和NF-YC (HAP5/CBF-C) 3個亞家族組成。通常是以NF-YA、NF-YB和NF-YC三個亞基組成的異源三聚體或NF-Y復(fù)合體與其他轉(zhuǎn)錄因子互作的形式調(diào)控下游基因的表達(dá)[19]。已有研究表明,NF-Y轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物的生長發(fā)育過程中具有重要作用, 如參與種子發(fā)育、開花期調(diào)控和逆境應(yīng)答調(diào)控等過程[19-22]。近些年, 在主要農(nóng)作物(玉米、水稻、小麥等)中一些NF-Y編碼基因在抗逆性方面的功能也不斷得到解析。例如, 玉米中過表達(dá)ZmNF-YB2基因后, 轉(zhuǎn)基因植株的抗旱能力顯著增強(qiáng), 而且在缺水條件下能顯著提高植株產(chǎn)量[23]; 過表達(dá)玉米ZmNF-YB16基因能夠增強(qiáng)植株的光合能力和抗氧化能力, 進(jìn)而提高植株的產(chǎn)量和抗旱能力[24]。在良好的灌溉條件下, 過表達(dá)TaNF-YB4基因能顯著增加小麥的穗數(shù), 提高20%~30%的籽粒產(chǎn)量[25]。在水稻中,OsNF-YA10基因突變后可以增強(qiáng)水稻植株的耐旱性[26];OsNF-YA7基因受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá),并通過非ABA依賴途徑參與干旱逆境的響應(yīng)[27];以及NF-YB2通過調(diào)控Late Embryogenesis Abundant7(LEA7)和LEA76基因增強(qiáng)植株的耐旱能力,NF-YB3通過調(diào)控HSFA3和HSP70B基因提高植株對高溫的耐受能力等[28]。在NF-YC編碼基因中, 過表達(dá)OsNF-YC4能促進(jìn)高溫、干旱應(yīng)答基因(OsHSP23.7、OsLEA3、OsRAB21等)的表達(dá), 從而提高植株對高溫干旱的抗性[29]。此外, 擬南芥AtNF-YC1 (AtHAP5A)通過調(diào)控Xyloglucan Endotransglucosylase/Hydrolase 21(AtXTH21)影響植株對冷脅迫的耐受能力, 過表達(dá)AtNF-YC1基因可顯著提高植株對冷脅迫的抗性[30]。AtNF-YC10、AtNF-YA2、AtNF-YB3和DREB2A形成NF-YDREB2A復(fù)合物共同參與植株對熱脅迫的調(diào)控, 在擬南芥和水稻中過表達(dá)AtNF-YC10均能顯著提高植株對高溫的耐受性[31-32]。這些研究結(jié)果均體現(xiàn)了NF-Y核因子在作物中的潛在應(yīng)用價值。然而, 在玉米中關(guān)于NF-YC亞家族編碼基因參與熱脅迫應(yīng)答調(diào)控的研究報道仍是缺乏。

實驗室前期研究表明ZmNF-YC13基因受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫誘導(dǎo)表達(dá), 在玉米中超表達(dá)ZmNF-YC13可提高植株對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫的耐受性[33]。本研究表明ZmNF-YC13還受熱脅迫和滲透脅迫快速誘導(dǎo)表達(dá),通過熱誘導(dǎo)表達(dá)啟動子驅(qū)動ZmNF-YC13基因可顯著提高植株對高溫的耐受性; 表達(dá)分析等表明ZmNF-YC13在高溫條件下可能是通過增強(qiáng)熱脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)來提高植株的耐熱能力。本研究不僅豐富了NF-YC轉(zhuǎn)錄因子在熱脅迫應(yīng)答通路中的調(diào)控模式, 也為利用該位點進(jìn)行耐熱性輔助選擇和種質(zhì)資源鑒定提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 非生物脅迫處理及表達(dá)分析

實驗室苗期玉米材料均播于Pindstrup基質(zhì)中,置于光照培養(yǎng)箱(PERCIVAL, 美國)培養(yǎng), 參數(shù)設(shè)置為溫度28 ℃/ 25 ℃, 光周期16 h/8 h, 光照強(qiáng)度250 μmol m-2s-1, 濕度40%~60%。對ZmNF-YC13基因在高溫處理下的表達(dá)模式進(jìn)行分析時, 轉(zhuǎn)基因受體材料播種后第10天, 保留長勢一致的植株并提前一天澆足水, 將培養(yǎng)箱溫度調(diào)為45℃, 光照強(qiáng)度125 μmol m-2s-1, 分別在0、0.5、1、2和5 h取第2葉相同部位組織, 液氮速凍后于超低溫冰箱保存待用。對ZmNF-YC13基因在滲透脅迫處理下的表達(dá)模式進(jìn)行分析時, 播種后第10 d, 保留長勢一致的植株, 用10%的PEG-6000溶液徹底澆透, 分別在0、0.5、1、2和5 h取第2葉相同部位組織, 液氮速凍后于超低溫冰箱保存待用。利用熱敏感和耐熱自交系進(jìn)行表達(dá)分析時, 在播種后10 d, 保留長勢一致的植株并提前一天澆足水, 將培養(yǎng)箱溫度調(diào)為45℃,光照強(qiáng)度125 μmol m-2s-1, 分別在0 h和0.5 h取第2葉相同部位組織, 液氮速凍后于超低溫冰箱保存待用。

玉米葉片總RNA采用天根生化科技(北京)有限公司的RNAprep pure Plant Kit提取, cDNA第一鏈合成采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific, Waltham, 美國)進(jìn)行。熒光定量PCR儀CFX96 Touch Cycler System (Bio-Rad,Hercules, 美國)和熒光染料SYBR Premix ExTaqII(Takara Biomedical Technology, 中國北京)用于qRT-PCR檢測。每個樣品設(shè)置3個技術(shù)重復(fù),18S rRNA用作內(nèi)參基因, 利用比較CT值法進(jìn)行計算相對表達(dá)量(引物序列見附表1)。

1.2 玉米遺傳轉(zhuǎn)化及陽性鑒定

首先從擬南芥基因組中克隆熱誘導(dǎo)表達(dá)基因AtHSP21起始密碼子上游2 kb序列(HSP21Pro)[14],利用限制性內(nèi)切酶EcoR I、BamH I對已構(gòu)建完成的載體pCAMBIA3301-Ubi:ZmNF-YC13-myc進(jìn)行線性化(同時去掉Ubi啟動子序列)[34], 再借助重組連接酶ClonExpress II One Step Cloning Kit (Vazyme,中國南京)完成HSP21Pro序列和pCAMBIA3301-ZmNF-YC13-myc線性質(zhì)粒的連接, 形成pCAMBIA3301-HSP21 Pro:ZmNF-YC13-myc環(huán)狀質(zhì)粒。最后將經(jīng)測序分析確認(rèn)正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中, 保存?zhèn)溆?。玉米遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)浸染玉米未成熟幼胚的方法進(jìn)行[35], 草銨膦(5 μg L-1)用于組織培養(yǎng)過程中的陽性植株篩選。T3代純合植株在高溫處理不同時間段的葉片總蛋白用于Western blot檢測ZmNF-YC13-myc融合蛋白的表達(dá)情況。

1.3 熒光素酶報告基因試驗

對于熒光素酶報告基因?qū)嶒?ZmNF-YC13編碼序列用于構(gòu)建35S:ZmNF-YC13 (干擾質(zhì)粒)載體,ZmHsfA2c起始密碼子上游1 kb序列用于構(gòu)建pGreenII 0800-ZmHsfA2cPro:LUC (報告質(zhì)粒)載體(引物序列見附表 1), 載體序列連接均用ClonExpress II One Step Cloning Kit (Vazyme, 中國南京)完成。玉米葉片原生質(zhì)體分離、提取和瞬時轉(zhuǎn)化參照Mei等[34]描述方法完成, 質(zhì)粒提取用天根無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒進(jìn)行, 原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化采用PEG-Ca2+介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法進(jìn)行。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后,(1) 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中, 110×g, 2 min,去上清; (2) 加入100 μL Lysis buffer至收集有原生質(zhì)體的離心管中, 充分渦旋混勻; (3) 冰浴5 min,16,260×g, 30 s; (4) 根據(jù)Dual Luciferase Reporter Assay System試劑盒(Promega, 美國)說明書分別測定螢火蟲熒光素酶活性值(LUC)和海腎熒光素酶活性值(REN)。

1.4 玉米苗期高溫處理及表型分析

選擇籽粒大小接近的野生型和ZmNF-YC13熱誘導(dǎo)表達(dá)材料玉米種子播于Pindstrup基質(zhì)中, 置于光照培養(yǎng)箱(PERCIVAL, 美國)培養(yǎng), 溫度28℃/25℃, 光周期16 h/8 h, 光照強(qiáng)度250 μmol m-2s-1,濕度40%~60%。播種后第10天, 保留長勢一致的植株并提前一天澆足水, 將培養(yǎng)箱溫度調(diào)為45℃, 光照強(qiáng)度125 μmol m-2s-1, 繼續(xù)培養(yǎng)8 h。處理結(jié)束后將培養(yǎng)箱參數(shù)調(diào)至正常模式繼續(xù)培養(yǎng)15 d, 培養(yǎng)過程中適時補(bǔ)充水分和營養(yǎng)?;謴?fù)培養(yǎng)結(jié)束后, 分別測量第5葉和第6葉(心葉)長、第5葉寬、地上部粗(地下與地上連接處以上1 cm位置, 用游標(biāo)卡尺測量)和地上部分、地下部分鮮重。測干重前, 先用110℃烘6 h, 再用80℃烘干至恒重。

1.5 熱誘導(dǎo)表達(dá)材料Western blot檢測

對ZmNF-YC13熱誘導(dǎo)表達(dá)材料在高溫處理下的表達(dá)情況進(jìn)行檢測時, T3代純合轉(zhuǎn)基因材料播種后第10天, 保留長勢一致的植株并提前一天澆足水,將培養(yǎng)箱溫度調(diào)為45℃, 光照強(qiáng)度125 μmol m-2s-1,分別在0、0.5、1、2、5、12、24、36和48 h取植株相同部位葉片, 快速稱量1 g組織于液氮速凍后放入超低溫冰箱保存待用。提取總蛋白時, 液氮充分研磨組織后, 加入1 mL預(yù)冷蛋白提取液(50 mmol L-1Tris-HCl, 1 mmol L-1EDTA, 150 mmol L-1NaCl,10% Glyerol, 1 mmol L-1PMSF), 輕柔混勻后, 置于4℃冰箱, 顛倒搖30 min; 隨后4 ℃, 16,260×g,30 min, 收集上清即為蛋白溶液。變性凝膠電泳采用Bio-Rad電泳儀和蛋白電泳槽進(jìn)行, 轉(zhuǎn)膜采用Bio-Rad Transblot SD半干轉(zhuǎn)系統(tǒng)(Bio-Rad, Hercules,美國)進(jìn)行。一抗1∶2000稀釋, 二抗1∶5000稀釋,WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate(LI-COR, 美國)用于顯影, C-DiGit Blot Scanner(LI-COR, 美國)用于照相。所有操作步驟參照Mei等描述方法完成[33-34]。

1.6 下游基因表達(dá)特點分析

分析下游基因在高溫處理下的表達(dá)特點時, 野生型和ZmNF-YC13熱誘導(dǎo)表達(dá)材料培養(yǎng)和高溫處理以及總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、和qRT-PCR檢測均參照1.1中的實驗方案進(jìn)行。

1.7 染色質(zhì)免疫共沉淀

將生長14 d的HSP21Pro:ZmNF-YC13-myc植株葉片(45℃處理2 h后)切成0.5~1.0 cm條狀, 然后放入含1%甲醛的固定液中, 冰上真空(0.08 MPa)交聯(lián)10 min后, 加入甘氨酸(終濃度為0.125 mol L-1), 再真空滲透10 min, 停止交聯(lián), ddH2O沖洗3次, 用濾紙快速吸干材料表面液體后放入液氮速凍。組織均一化和細(xì)胞核提取參照Cold Spring Harbor方法進(jìn)行[36]。瓊脂糖磁珠Binding control用于細(xì)胞裂解液預(yù)清除, GFP-Trap 瓊脂糖磁珠和 Myc-Trap瓊脂糖磁珠(ChromoTek GmbH,德國)用于免疫沉淀。QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, 德國)用于純化回收input和沉淀后DNA。qPCR檢測分析后以GFP-Trap作為對照進(jìn)行計算富集度, 分別進(jìn)行3次獨立實驗(引物序列見附表1)。

附表1 本研究中所用引物Table S1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmNF-YC13表達(dá)特點分析及熱誘導(dǎo)表達(dá)材料創(chuàng)制

在實驗室前期研究中, 篩選出了響應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫應(yīng)答調(diào)控因子ZmNF-YC13, 并證實該基因在玉米內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫應(yīng)答調(diào)控過程中具有重要作用[33]。進(jìn)一步對該基因在其他非生物脅迫條件下的分析表明,ZmNF-YC13基因的表達(dá)受到滲透脅迫和高溫的快速誘導(dǎo), 隨后下降(圖1-A)。為進(jìn)一步分析ZmNF-YC13基因表達(dá)量與玉米耐熱性的關(guān)系, 我們選取了在耐熱能力上具有極端差異(耐熱型和熱敏感型)的玉米自交系, 并于高溫脅迫處理前后分別檢測了ZmNF-YC13基因的表達(dá)量。結(jié)果表明, 在正常條件下, 耐熱型自交系材料中ZmNF-YC13基因的表達(dá)量均高于熱敏感型自交系材料(圖1-B)。45℃高溫處理1 h后,ZmNF-YC13基因在各自交系材料中出現(xiàn)了不同程度的響應(yīng), 在耐熱型自交系材料中上調(diào)水平更高, 且該基因整體的表達(dá)水平高于熱敏感型自交系材料(圖1-C)。上述結(jié)果說明,ZmNF-YC13基因可能參與玉米熱脅迫應(yīng)答調(diào)控過程。

組成型表達(dá)ZmNF-YC13雖在一定程度上提高玉米植株對非生物脅迫的抗性, 但過高的ZmNFYC13基因表達(dá)量同時也會抑制植株的生長[34]。為避免提高ZmNF-YC13基因表達(dá)量對植株生長帶來的遲緩效應(yīng), 我們克隆了擬南芥熱誘導(dǎo)表達(dá)基因AtHSP21基因啟動子, 構(gòu)建了利用該啟動子表達(dá)ZmNF-YC13基因的玉米轉(zhuǎn)基因材料(HSP21Pro:ZmNF-YC13-myc)。隨后我們在高溫處理前以及高溫處理后不同時間段利用anti-myc抗體在蛋白水平上對T3代純合材料HSP21Pro:ZmNF-YC13-myc檢測表明, 在正常培養(yǎng)條件下(0 h), ZmNF-YC13-myc融合蛋白的表達(dá)量較低; 受到45℃高溫處理后,ZmNF-YC13-myc的蛋白水平快速積累。該結(jié)果表明成功構(gòu)建了ZmNF-YC13基因的熱誘導(dǎo)表達(dá)玉米材料(圖1-D)。

圖1 ZmNF-YC13在不同條件和材料中的表達(dá)分析Fig. 1 Relative expression level ofZmNF-YC13under different conditions and inbred lines in maizeA: 高溫和滲透脅迫處理條件下ZmNF-YC13基因葉片中的表達(dá)特點分析; B: 正常生長條件下耐熱型和熱敏感型玉米自交系植株葉片中ZmNF-YC13基因表達(dá)量分析; C: 高溫脅迫處理后耐熱型和熱敏感型玉米自交系植株中ZmNF-YC13基因表達(dá)量分析; 每組試驗均采用3次生物學(xué)重復(fù), 數(shù)據(jù)顯著性分析采用Student’st測驗(雙尾), *:P< 0.05, **:P< 0.01; D: HSP21Pro:ZmNF-YC13-myc植株在高溫處理下ZmNF-YC13-myc融合蛋白檢測。A: relative expression level ofZmNF-YC13genes in maize leaves under heat stress and osmotic conditions. B:ZmNF-YC13gene expression in heat-tolerant and heat-sensitive maize inbred plants leaves under normal condition. C:ZmNF-YC13gene expression in heat-tolerant and heat-sensitive maize inbred plants leaves after heat stress. Data are means of three biological replicates. Differences among data were tested using two-tailed Student’st-test. *:P< 0.05, **:P< 0.01. D: ZmNF-YC13-myc fused protein analysis of the HSP21Pro:ZmNF-YC13-myc plants leaves under heat stress by Western blot.

2.2 熱誘導(dǎo)表達(dá)ZmNF-YC13基因提高玉米苗期植株的耐熱能力

我們進(jìn)一步對通過熱誘導(dǎo)表達(dá)ZmNF-YC13基因是否能夠提高玉米苗期植株的耐熱能力進(jìn)行了分析。在正常培養(yǎng)條件下, 野生型植株與ZmNF-YC13熱誘導(dǎo)表達(dá)植株的長勢無顯著差異(圖2-A)。在經(jīng)過45℃高溫脅迫處理8 h后, 野生型植株和ZmNF-YC13熱誘導(dǎo)表達(dá)植株的葉片均出現(xiàn)了不同程度的卷曲和萎蔫現(xiàn)象(圖2-B)。將處理后的植株在正常條件下恢復(fù)培養(yǎng)15 d后,ZmNF-YC13熱誘導(dǎo)表達(dá)植株的長勢均優(yōu)于野生型的植株(圖2-C)。同時, 我們對野生型植株和ZmNF-YC13熱誘導(dǎo)表達(dá)植株正常培養(yǎng)條件下和在高溫處理后的生物量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明, 在高溫處理之后,ZmNF-YC13熱誘導(dǎo)表達(dá)植株的地上部和地下部的鮮重和干重均顯著高于野生型植株; 第6葉、第5葉長度和寬度以及地上部粗度(地下部和地上部連接處以上1 cm位置)均顯著高于野生型植株(圖2-D, E)。以上結(jié)果說明, 熱誘導(dǎo)表達(dá)ZmNFYC13基因能夠提高玉米苗期植株的耐熱能力。

圖2

圖2 野生型與ZmNF-YC13熱誘導(dǎo)表達(dá)材料在高溫處理后的表型分析Fig. 2 Phenotypic analysis of wild-type (WT) and HSP21Pro:ZmNF-YC13-myc plants under heat stressA~D: 野生型和ZmNF-YC13誘導(dǎo)材料在正常條件和高溫處理后的植株長勢形態(tài), D圖中箭頭指示為第5葉, 比例尺為5 cm; E: 高溫處理后野生型和ZmNF-YC13熱誘導(dǎo)材料葉長、葉寬、地上部粗、地上部分和地下部分的鮮重和干重統(tǒng)計; 顯著性分析采用Student’st測驗(雙尾),n> 20,*:P< 0.05,**:P< 0.01。A-D: Plant morphologies of wild-type (WT) and HSP21Pro:ZmNF-YC13-myc plants before and after high temperature treatment. The arrow in Fig. 2-D indicates the fifth leaf, Bar: 5 cm. E: leaf length, leaf width, shoot thickness, and biomass of the wild-type (WT) and HSP21Pro:ZmNF-YC13-myc plants after high temperature treatment. Data are means of three biological replicates. Differences among data were tested using two-tailed Student’st-test.*:P< 0.05,**:P< 0.01.

2.3 ZmNF-YC13調(diào)控?zé)崦{迫誘導(dǎo)表達(dá)基因的表達(dá)

由于高溫脅迫是自然條件下引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫的主要因素之一[37]。因此我們猜測ZmNF-YC13在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫應(yīng)答通路中調(diào)控的下游基因(ZmDnaJ1、ZmDnaJ2、ZmHSP70和ZmHsfA2c等)可能同樣參與了熱脅迫應(yīng)答調(diào)控[33,38]。為證實這一猜測, 我們首先對受ZmNF-YC13調(diào)控的下游基因在高溫處理下的表達(dá)特點進(jìn)行了分析。結(jié)果表明, 在45℃高溫處理下,野生型玉米植株中ZmDnaJ1、ZmDnaJ2、ZmHSP70和ZmHsfA2c基因的表達(dá)量快速增加, 且在1 h左右達(dá)到高峰, 說明ZmDnaJ1、ZmDnaJ2、ZmHSP70和ZmHsfA2c基因是熱脅迫應(yīng)答基因。在ZmNF-YC13熱誘導(dǎo)表達(dá)材料中,ZmDnaJ1、ZmDnaJ2、ZmHSP70和ZmHsfA2c基因受高溫誘導(dǎo)表達(dá)的程度較野生型植株明顯提高, 表明提高ZmNF-YC13基因表達(dá)量能增強(qiáng)熱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)基因的表達(dá)(圖3)。

圖3 高溫脅迫應(yīng)答基因在野生型材料和ZmNF-YC13熱誘導(dǎo)材料中的表達(dá)模式分析Fig. 3 Relative expression patterns of heat stress responsive genes in wild-type and HSP21Pro:ZmNF-YC13-myc plants

2.4 ZmNF-YC13調(diào)控ZmHsfA2c基因表達(dá)

由于熱應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子在植物熱脅迫應(yīng)答調(diào)控中具有重要作用, 且Gu等研究表明在擬南芥中超表達(dá)HSFA2(ZmHsfA2c)可提高植株耐熱能力[39], 而在本研究中發(fā)現(xiàn)ZmHsfA2c的表達(dá)量受ZmNF-YC13的調(diào)控。為了進(jìn)一步證實ZmNF-YC13-ZmHsfA2c這一調(diào)控通路, 我們利用熒光素酶報告基因?qū)嶒灪虲hIP-qPCR進(jìn)一步進(jìn)行了分析。熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果表明, ZmNF-YC13蛋白可顯著激活ZmHsfA2c基因的啟動子(圖4-A)。利用染色質(zhì)免疫共沉淀并結(jié)合qPCR的方法對ZmHsfA2c基因起始密碼子ATG上游1 kb范圍的啟動子區(qū)域分析表明, 目標(biāo)蛋白在ZmHsfA2c基因的啟動子區(qū)段2和區(qū)段3上有較高的富集峰(圖4-B)。我們進(jìn)一步對啟動子區(qū)段2和區(qū)段3的序列分析發(fā)現(xiàn), 在區(qū)段中存在兩個典型的熱脅迫應(yīng)答元件(heat shock element, HSE)(圖4-C)。以上結(jié)果表明, ZmNF-YC13能夠調(diào)控ZmHsfA2c基因表達(dá), 可能依賴于熱脅迫應(yīng)答元件。

圖4 ZmNF-YC13調(diào)控ZmHsfA2c基因表達(dá)Fig. 4 Relative expression levels ofZmHsfA2cgenes regulated by ZmNF-YC13A:ZmHsfA2c基因啟動子和ZmNF-YC13蛋白之間的反式激活效應(yīng)分析。-ZmNF-YC13表示不含有ZmNF-YC13蛋白(對照),+ZmNF-YC13表示含有ZmNF-YC13蛋白。數(shù)據(jù)為3次獨立實驗的平均值。**: P< 0.01。B:ZmNF-YC13基因的啟動子結(jié)合位點ChIP-qPCR分析。數(shù)據(jù)為3次獨立實驗的平均值。C: 用于ChIP-qPCR分析的ZmHsfA2c啟動子片段示意圖。A: the transactivation ofZmHsfA2cpromoter and ZmNF-YC13. For the transactivation, -ZmNF-YC13 means empty effector plasmid and+ZmNF-YC13 means ZmNF-YC13-fused effector plasmid. Data are means ± SDs of three independent experiments.**: P< 0.01. B: the promoter binding site analysis ofZmNF-YC13. The experiment was performed by three independent experiments. C: the schematic diagram of theZmHsfA2cpromoter fragments using for ChIP-qPCR analysis.

3 討論

植物作為一種固著生物, 其生長發(fā)育極易受到自然環(huán)境的影響, 如高溫破壞植物細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性、引起細(xì)胞內(nèi)酶系統(tǒng)紊亂、籽粒過早脫水等, 從而擾亂其正常的生理階段和進(jìn)程, 使生長發(fā)育和產(chǎn)量形成受到嚴(yán)重影響[40]。植物在進(jìn)化過程中從分子、細(xì)胞和生理生化層面上也形成了一系列的調(diào)節(jié)機(jī)制,以應(yīng)對或緩解環(huán)境變化所帶來的影響[41]。如在高溫脅迫下, 植物細(xì)胞首先感知高溫刺激并將信號放大傳遞至胞內(nèi), 進(jìn)而激活一系列高溫脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)以此來應(yīng)對或緩解高溫帶來的損傷, 這一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在植物響應(yīng)高溫脅迫過程中至關(guān)重要, 而與熱脅迫應(yīng)答相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子作為調(diào)控下游靶基因表達(dá)的分子開關(guān), 在這個過程中具有不可替代的作用[42-43]。

Mei等[33-34]研究發(fā)現(xiàn)ZmNF-YC13基因受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫(用化學(xué)試劑二硫蘇糖醇和衣霉素處理)誘導(dǎo)表達(dá), 編碼核內(nèi)蛋白, 且具備一定的轉(zhuǎn)錄激活能力;在玉米中組成型表達(dá)ZmNF-YC13基因后能夠提高植株對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫的耐受能力[33]。在自然環(huán)境中,高溫是誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫的重要因素[37]。因此,本研究中進(jìn)一步分析了ZmNF-YC13基因在高溫和滲透脅迫下的表達(dá)特點。結(jié)果表明ZmNF-YC13基因受高溫和滲透脅迫快速誘導(dǎo)表達(dá), 說明ZmNFYC13可能是一個響應(yīng)熱脅迫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。然而提高ZmNF-YC13基因的表達(dá)量雖能提高植株對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫的耐受能力, 但過高的ZmNF-YC13表達(dá)量同時也抑制植株葉片的生長[34]。為了能利用提高ZmNF-YC13基因表達(dá)量來增強(qiáng)植株的抗逆性, 同時又盡可能消除過高的ZmNF-YC13表達(dá)量帶來的不良效應(yīng), 我們創(chuàng)制了利用擬南芥熱脅迫應(yīng)答基因AtHSP70的啟動子在玉米中驅(qū)動ZmNF-YC13基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因玉米材料。高溫條件下的表型分析也證實了通過熱誘導(dǎo)表達(dá)ZmNF-YC13基因能夠增強(qiáng)玉米植株的耐熱能力。

熱激蛋白是生物體在感知到高溫、干旱等不利環(huán)境因素時誘導(dǎo)合成的一類結(jié)構(gòu)保守的應(yīng)激蛋白, 是植物短暫適應(yīng)或應(yīng)對逆境脅迫不可或缺的成分[44]。如在玉米、水稻、小麥和甘蔗等中的研究表明, HSP70熱激蛋白受熱誘導(dǎo)并在響應(yīng)熱脅迫的過程中發(fā)揮重要作用[44]。DnaJ蛋白是生物體內(nèi)重要的分子伴侶類因子[45], 它具有獨自或協(xié)助HSP70完成蛋白質(zhì)折疊、解折疊、聚合和調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物解聚等功能, 是植物在逆境脅迫條件下維持蛋白質(zhì)或蛋白復(fù)合體穩(wěn)定的重要角色[46]。如番茄的DnaJ蛋白SICDJ2可通過維持較低的蛋白水解酶活性來延緩Rubisco的降解速度, 從而緩解高溫對光合作用的抑制效應(yīng)[47]。擬南芥DnaJ蛋白TMS1通過與未折疊蛋白應(yīng)答途徑的重要因子BiP1和BiP3蛋白互作來參與未折疊蛋白再折疊和降解的調(diào)控過程, 進(jìn)而在花粉管及其他組織耐熱性中發(fā)揮作用[48]。在玉米ZmNF-YC13基因的組成型表達(dá)材料中,ZmDnaJ1、ZmDnaJ2和ZmHSP70等基因的表達(dá)量得到顯著上調(diào), 表明這些基因可能受ZmNF-YC13蛋白的調(diào)控; 熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M(jìn)一步證實了ZmNF-YC13蛋白能夠激活ZmDnaJ2和ZmHSP70基因的啟動子活性[33]。并且在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫條件下, ZmNF-YC13轉(zhuǎn)錄因子能夠通過調(diào)控ZmDnaJ1、ZmDnaJ2和ZmHSP70基因的表達(dá)來緩解植株的受脅迫狀態(tài)[33]。本研究中的表達(dá)分析表明,ZmDnaJ1、ZmDnaJ2和ZmHSP70等基因的表達(dá)受熱脅迫快速誘導(dǎo), 而且ZmNF-YC13蛋白能夠在高溫條件下增強(qiáng)上述基因的表達(dá)。

除了熱激蛋白及其輔助因子外, 熱激轉(zhuǎn)錄因子是存在于真核生物體內(nèi)調(diào)控?zé)崦{迫應(yīng)答的一類重要轉(zhuǎn)錄因子。例如,HsfA1a是番茄(Lycopersicon esculentum)中熱脅迫應(yīng)答的主要調(diào)節(jié)因子[11]; 在擬南芥中,HsfA1a和HsfA1b在熱脅迫應(yīng)答早期誘導(dǎo)熱激蛋白編碼基因的表達(dá)中起重要作用[49]。HsfA2基因的表達(dá)在番茄[50]和擬南芥[51]中受熱脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo),并且HsfA2在植物長期熱脅迫條件下或熱脅迫后恢復(fù)過程中對HSP基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控起重要作用[52], 也是擬南芥植株保持獲得性耐熱能力的必需基因[17]。此外, 在擬南芥中超表達(dá)玉米HSFA2(ZmHsfA2c)基因能夠提高植株的耐熱性[39]。在本研究中, 表達(dá)分析、熒光素酶報告基因?qū)嶒炓约癈hIP-qPCR等實驗表明ZmNF-YC13能調(diào)控ZmHsfA2c的表達(dá), 說明ZmNF-YC13在熱脅迫應(yīng)答途徑中是一個重要的上游調(diào)控子, 由此也反應(yīng)出ZmNF-YC13可能從多個途徑參與了玉米熱脅迫應(yīng)答的調(diào)控過程。前人的研究結(jié)果中, 水稻OsNF-YC4通過調(diào)控OsHSP23.7等基因提高植株對高溫的耐受性[29], 擬南芥AtNFYC10以NF-Y-DREB2A復(fù)合物形式調(diào)控HSP17.6A、HsfA2、HsfA3和HsfA7等基因的表達(dá)來參與對熱脅迫的響應(yīng)[31]。本研究結(jié)果不僅表明ZmNF-YC13可通過調(diào)控HSP70和HsfA2c等基因的表達(dá)來響應(yīng)熱脅迫, 還揭示了 DnaJ類分子伴侶因子也是ZmNF-YC13蛋白調(diào)控的重要下游基因。因此, 本研究不僅拓展了NF-YC轉(zhuǎn)錄因子在熱脅迫通路中調(diào)控的下游基因, 同時也證實了植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫應(yīng)答和植物熱脅迫應(yīng)答在調(diào)控通路上存在交叉。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明玉米核因子編碼基因ZmNFYC13受高溫和滲透脅迫誘導(dǎo)表達(dá), 在玉米中熱誘導(dǎo)表達(dá)ZmNF-YC13可提高玉米苗期植株的耐熱能力。對野生型和轉(zhuǎn)基因材料在高溫條件下的表達(dá)分析表明ZmNF-YC13在熱脅迫條件下可增強(qiáng)熱脅迫應(yīng)答基因的表達(dá); 熒光素酶報告基因?qū)嶒灪虲hIP-qPCR實驗表明ZmNF-YC13還能調(diào)控?zé)峒まD(zhuǎn)錄因子編碼基因ZmHsfA2c的表達(dá)。因此, 本研究結(jié)果表明ZmNF-YC13是玉米響應(yīng)熱脅迫應(yīng)答過程中的重要調(diào)控因子, 熱誘導(dǎo)表達(dá)ZmNF-YC13可能是通過增強(qiáng)下游熱脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)來提高植株的耐熱能力。

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