鐘世順 梁瑋 許炎欽 劉進生

結腸癌是全球第三常見的惡性腫瘤，也是第二常見的惡性腫瘤死亡原因[1]。結腸癌的發(fā)生與環(huán)境、飲食、腸道微生物等因素有關[2]。已有研究表明，腸道微生物會多方面影響腸道健康，包括對腸道細胞特征、新陳代謝和免疫的影響[3，4]。腸道微生物是寄居在人體腸道內的龐大、復雜的微生物群落[5]。益生菌是一類重要的腸道微生物，可以通過平衡腸道微生物菌群和增強消化系統(tǒng)中的營養(yǎng)吸收，對宿主產生有利影響[6]。

雙歧桿菌屬是常見的益生菌。雙歧桿菌是一種革蘭氏陽性、不運動、細胞呈桿狀、一端有時呈分叉狀的厭氧細菌。其能夠合成氨基酸、硫胺素和核黃素，是腸道菌群的重要組成成員之一，在抑制腸道病原體的定植、保持腸道微生物穩(wěn)態(tài)、保護腸道黏膜屏障的完整性等方面發(fā)揮著重要作用[7]。已有研究表明，雙歧桿菌可以調節(jié)小鼠腸道菌群組成，提高短鏈脂肪酸含量，提高腸道屏障相關基因的表達，進而有效緩解小鼠潰瘍性結腸炎[8]。除了緩解腸炎方面的研究外，Bahmani 等[9]研究發(fā)現雙歧桿菌能抑制結腸癌細胞的生長。本研究評估體外條件下雙歧桿菌對人結腸癌DLD-1 細胞系增殖、侵襲及遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)結腸癌細胞系DLD-1 從美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American type culture collection，ATCC）獲得，DLD-1 細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的PRMI-1640 培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 細菌培養(yǎng)將雙歧桿菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h，室溫5 000g 離心4min 收獲雙歧桿菌細胞，并將其重新懸浮在培養(yǎng)基，制備成1×108CFU/ml 的雙歧桿菌懸液。

1.3 CCK-8 實驗將DLD-1 細胞按照2 000 個/孔的數量加到含180μl 完全培養(yǎng)基的96 孔板中。實驗組中每孔加入20μl 的1×108CFU/ml 雙歧桿菌懸液（雙歧桿菌終濃度為1×107CFU/ml），對照組中每孔加入20μl 的培養(yǎng)液。每組包含6 個復孔，設置0、24h、48h、72h 4 個時間梯度。將細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。測量時在培養(yǎng)孔中加入10μl CCK8 試劑后置于37℃靜置1h。在460nm 波長處測量每個培養(yǎng)孔的OD 值。

1.4 劃痕實驗將DLD-1 細胞以每孔1×106個接種于6 孔板之中，每組設置3 個復孔，隨后置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞與細胞之間契合并鋪滿整個6 孔板時，借助直尺用10μl 的槍頭在6孔板中劃出九宮格，槍頭劃過的地方形成沒有細胞的區(qū)域，用適量的PBS 洗滌培養(yǎng)孔3 遍，吸去PBS，而后每孔加入1.8ml 無血清培養(yǎng)基，實驗組每孔中加入200μl 的1×108CFU/ml 雙歧桿菌懸液，對照組中每孔加入200μl 的培養(yǎng)液。接著進行觀察拍照和記錄，拍攝完畢后置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)48h 后，吸去無血清培養(yǎng)基，用PBS 洗滌3 次后再次加入2ml 無血清培養(yǎng)基，對劃痕區(qū)域進行拍照，并記錄比對觀察遷移情況。

1.5 Transwell 實驗取一塊新的24 孔板，每孔加入270μl 完全培養(yǎng)液，實驗組每孔加入30μl 的1×108CFU/ml 雙歧桿菌懸液，對照組每孔加入30μl的培養(yǎng)液。將Transwell 小室放入含有完全培養(yǎng)液的24 孔板內，將小室的基質膜水化，在Transwell 小室上方加入180μl 無血清培養(yǎng)基，實驗組每孔加入20μl 的1×108CFU/ml 雙歧桿菌懸液，對照組每孔加入20μl 的培養(yǎng)液。將DLD-1 細胞以每孔1×104個接種于小室中，每組設置3 個復孔，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24h 后，取出小室，用移液槍吸取小室中的培養(yǎng)液，使用棉簽小心地擦去小室基質膜上層細胞，在新的24 孔板中加入400μl 結晶紫染液，將擦干凈的小室放入帶有結晶紫染液的孔洞中染色15min。染色后用移液槍吸取染色液，用棉簽擦去基質膜周圍多余的結晶紫染液。顯微鏡觀察小室并拍照記錄。

1.6 統(tǒng)計學分析CCK8 分析采用雙因素方差分析（Two-way ANOVA）方法進行分析，兩組間的差異分析采用Studentt檢驗方法進行分析，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 雙歧桿菌抑制結腸癌細胞DLD-1增殖CCK-8實驗結果表明，相比于對照組，雙歧桿菌組的結腸癌細胞DLD-1 的增殖能力顯著被抑制（P<0.01），見圖1。

圖1 兩組結腸癌細胞DLD-1增殖能力

2.2 雙歧桿菌抑制結腸癌細胞DLD-1 侵襲及遷移劃痕實驗結果表明，相比于對照組，雙歧桿菌可以顯著抑制結腸癌細胞DLD-1 的遷移（P<0.01），Transwell 實驗結果表明，相比于對照組，雙歧桿菌可以顯著抑制結腸癌細胞DLD-1 的侵襲能力（P<0.01）。見圖2、3。

圖2 雙岐桿菌對結腸癌細胞DLD-1 遷移能力的影響

圖3 雙岐桿菌對結腸癌細胞DLD-1 侵襲能力的影響

3 討論

結腸癌是常見的消化道腫瘤。近年來，我國結腸癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升，均位列我國惡性腫瘤前5 位[10]，局部的復發(fā)和轉移是治療失敗的主要原因。結腸癌發(fā)病機制復雜，受多種因素影響。有研究顯示，腸道菌群在結腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[11]。人類腸道中包含大量的微生物菌群，腸道菌群的變化對宿主的生理有重要影響，比如腸道菌群能影響免疫系統(tǒng)發(fā)育及調控腸道相關代謝功能等[11]。

雙歧桿菌和乳酸桿菌是人類腸道菌群中重要的益生菌，具有增強免疫力和抗腫瘤功能。大多數結腸癌患者存在腸道菌群失調的現象，其腸道有益菌如雙歧桿菌及乳酸桿菌等較健康人群減少[12]。一項關于益生菌預防腸癌的作用機制的研究發(fā)現，腸道菌群是影響腸癌進展的最關鍵風險因素，它能夠平衡腸道菌群，減緩腸癌進展。2017年，Hibberd等[13]研究發(fā)現益生菌能干預腸癌患者的腸道微生物菌群，對腸癌患者的治療有潛在的作用。

作為一種重要的益生菌，雙歧桿菌對腸道健康有重要影響，可抑制吸附于腸道上皮細胞的病原體的生長，其主要代謝物乳酸和乙酸均能降低腸道內的pH 值，進而抑制許多有害微生物的生長。因此，通過調節(jié)腸道內的pH 值是雙歧桿菌發(fā)揮腸道益生菌功能的重要機制之一。此外，還有多項研究表明雙歧桿菌能影響結腸癌的進展。Foo 等[14]通過細胞實驗表明，雙歧桿菌具有抑制抗凋亡蛋白表達，增強促凋亡蛋白表達的作用，進而誘導結腸癌細胞凋亡，抑制結腸癌的進展。大鼠實驗數據表明，與未服用雙歧桿菌的大鼠相比，服用雙歧桿菌的大鼠結腸癌的癌前病變可以降低25%左右。另一項結腸癌大鼠模型實驗結果表明，雙歧桿菌等益生菌的混合物可以調節(jié)平衡大鼠腸道微生物的組成，進而下調結腸癌的發(fā)生率[15]。Liang 等[16]研究了益生菌對直腸癌患者的影響，結果表明雙歧桿菌三活膠囊對直腸癌患者癥狀有顯著改善作用。

本研究主要通過CCK8、劃痕及Transwell 實驗探究雙歧桿菌對結腸癌細胞DLD-1增殖、侵襲及遷移的影響。結果表明，雙歧桿菌可以顯著抑制結腸癌細胞DLD-1增殖、侵襲及遷移能力。本研究相關內容可以為結腸癌的臨床治療和預防提供一定的理論參考。