石新燁 孫經(jīng)武 王佳森 劉振 劉婧玚 董文敬 張翠

中國(guó)心血管病患病率及死亡率處于上升階段，其中心血管病死亡率居首位，明顯高于腫瘤及其他疾病，占疾病死亡構(gòu)成的40%以上[1]，而存在各種心血管基礎(chǔ)性疾病的患者更容易發(fā)生心臟驟停。心臟驟停指人體心臟的射血功能突然停止，伴有心音與大動(dòng)脈波動(dòng)消失等癥狀，嚴(yán)重威脅患者的生命安全，其在使死亡率升高的同時(shí)還易引起相關(guān)并發(fā)癥，對(duì)患者生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。對(duì)心臟驟停患者應(yīng)用早期心肺復(fù)蘇在心臟驟停院前急救中發(fā)揮重要意義[2]。研究發(fā)現(xiàn)，自主循環(huán)恢復(fù)（Return of spontaneous circulation，ROSC）后患者主要死于全身缺血再灌注引起的心腦功能障礙[3]。心肌缺血再灌注損傷（Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）是指在冠狀動(dòng)脈發(fā)生完全或部分梗阻后，重新獲得血流時(shí)心肌組織的損傷反而會(huì)進(jìn)行性加重[4]。其涉及多種生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)傳導(dǎo)途徑，包括細(xì)胞內(nèi)氧自由基的大量產(chǎn)生[5]、鈣離子超負(fù)荷[6]、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放[7]、內(nèi)皮細(xì)胞功能受損[8]、過(guò)度炎癥反應(yīng)[9]及細(xì)胞凋亡等。近年有研究顯示細(xì)胞焦亡在MIRI 中發(fā)揮重要作用，MIRI 主要通過(guò)NOD 樣受體蛋白3/天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶1/焦孔素D（NLRP3/Caspase-1/GSDMD）信號(hào)通路介導(dǎo)心肌細(xì)胞焦亡，其特征是心肌缺血再灌注過(guò)程中被激活的Caspase 特異性剪切GSDMD[10]，將N-末端從具有自我抑制作用的C-末端中釋放出來(lái)，隨后GSDMD-N 與脂質(zhì)結(jié)合形成非選擇性孔隙，不依賴(lài)于增加滲透壓使細(xì)胞破裂。釋放出的細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，使心肌梗死面積擴(kuò)大，加重心肌功能障礙及結(jié)構(gòu)紊亂。既往研究表明，依達(dá)拉奉作為一種自由基清除劑，對(duì)MIRI 有保護(hù)作用，其可降低因自由基大量生成所導(dǎo)致的細(xì)胞膜損傷和蛋白質(zhì)核酸不可逆的破壞作用，也可以通過(guò)降低心臟驟停后的氧化應(yīng)激來(lái)改善心肌功能損傷[11]。本研究通過(guò)探討依達(dá)拉奉是否通過(guò)抑制細(xì)胞焦亡通路對(duì)心臟驟停心肺復(fù)蘇后MIRI 發(fā)揮保護(hù)作用，同時(shí)降低炎癥因子含量進(jìn)而減少對(duì)心肌的損傷，以期為心臟驟停心肺復(fù)蘇后MIRI 新的治療方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑實(shí)驗(yàn)儀器：多導(dǎo)生理信號(hào)記錄儀及配套生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），動(dòng)物呼吸機(jī)（成都儀器廠成都泰盟科技有限公司），心電圖機(jī)（飛利浦有限公司），電泳槽、電轉(zhuǎn)裝置、電泳儀（Bio-rad 公司），水平搖床（北京六一生物科技有限公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司），臺(tái)式低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（山東愛(ài)博科技貿(mào)易有限公司），光學(xué)相差顯微鏡（奧林巴斯公司），Microm Gmbh 切片機(jī)（德國(guó)Microm International GmbH 公司）。實(shí)驗(yàn)試劑藥品：戊巴比妥鈉（濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院），10%氯化鉀（中國(guó)大冢制藥有限公司），依達(dá)拉奉（先聲藥業(yè)有限公司），腎上腺素（北京市永康藥業(yè)有限公司）。SDSPAGE 凝膠配制試劑盒、PMSF、RIPA 裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液（武漢塞維爾生物科技有限公司），Anti-GAPDH antibody、Anti-NLRP3 antibody、Anti-IL-1βantibody、Anti-Caspase-1 antibody、Anti-GSDMD antibody（Abcam公司）、HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗（博士德生物工程有限公司）。大鼠特異性 ELISA 試劑盒IL-1β、IL-6、TNF-α（博士德生物工程有限公司）。EDTA 抗原修復(fù)液、SABC 免疫組化染色試劑盒、DAB 顯色試劑盒（博士德生物工程有限公司），HE 染色試劑盒（Solarbio 公司）。

1.2 動(dòng)物及分組選擇36 只250～300g 雄性 SD 大鼠，購(gòu)自濟(jì)南杰瑞康生物科技有限公司。每3 只合籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料購(gòu)自濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心。予以日常光照，不限食物和水。36 只SD 雄性大鼠隨機(jī)選擇12 只作為假手術(shù)組，只行頸外靜脈及尾動(dòng)脈置管、氣管插管、Ⅱ?qū)?lián)心電圖。其余大鼠制備心臟驟停后心肺復(fù)蘇模型，模型完成后隨機(jī)分為2 組，分別為生理鹽水組、依達(dá)拉奉組，每組12 只，ROSC 后依達(dá)拉奉組大鼠靜脈注射依達(dá)拉奉3mg/kg，生理鹽水組注射相同劑量的生理鹽水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 制作模型 本研究采用高鉀合并窒息方式制備心臟驟停后心肺復(fù)蘇大鼠模型，此法改良自Sharp 等[12]的制備方法。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12h，期間自由飲水。戊巴比妥鈉（30mg/kg）腹腔麻醉，行氣管插管連接呼吸機(jī)（參數(shù)：通氣頻率70 次/min，潮氣量6ml/min，呼吸比1:3），經(jīng)四肢皮下電極探針常規(guī)記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。右側(cè)頸靜脈置管以0.3ml/kg的劑量脈沖式注射10% KCl 溶液，注射時(shí)一次性給藥，給藥時(shí)間1s 左右。尾動(dòng)脈置管后連接多導(dǎo)生理信號(hào)記錄儀及配套生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)。待大鼠發(fā)生心臟驟停后，立刻關(guān)閉呼吸機(jī)使呼吸受抑制，計(jì)時(shí)5min 后，立即打開(kāi)呼吸機(jī)開(kāi)始心肺復(fù)蘇，胸外心臟按壓頻率180～200 次/min，按壓深度為大鼠胸廓前后徑的1/3，按壓放松時(shí)間比1:1，按壓時(shí)間3～5min，1min 后靜脈注射0.04mg/kg 腎上腺素，若無(wú)效于4min 后重復(fù)1 次，5min 自主循環(huán)仍未恢復(fù)則視為復(fù)蘇失敗。若心肺復(fù)蘇成功，ROSC 后生理鹽水組與依達(dá)拉奉組立即經(jīng)頸靜脈分別給予生理鹽水/依達(dá)拉奉（3mg/kg）。待大鼠自主呼吸恢復(fù)后即可拔除氣管插管。取材：誘導(dǎo)大鼠ROSC 6h 后處死，用手術(shù)剪沿胸骨下緣剪開(kāi)大鼠胸部以暴露心臟，左心室取血，離心后分裝血清于-80℃冰箱保存組織。分離心臟后一部分心肌組織用預(yù)冷的4℃PBS 漂洗干凈后，置于-80℃冰箱中保存，另一部分置于4%多聚甲醛緩沖液固定。

心臟驟停判斷標(biāo)準(zhǔn)：有創(chuàng)動(dòng)脈壓顯示動(dòng)脈搏動(dòng)波消失，且平均動(dòng)脈壓<20mmHg；心電圖顯示為無(wú)脈性電活動(dòng)、心室顫動(dòng)或呈一條直線。ROSC 標(biāo)準(zhǔn)：心電圖顯示出現(xiàn)室上性節(jié)律（包括竇性、房性或交界性）；平均動(dòng)脈血壓維持30mmHg 以上。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠心臟驟停實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的心電圖表現(xiàn)

1.3.2 大鼠血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè) 經(jīng)四肢皮下電極探針常規(guī)記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖后，監(jiān)測(cè)心率（HR）、收縮壓、舒張壓，生理鹽水組及依達(dá)拉奉組在ROSC 30min后再次經(jīng)尾動(dòng)脈記錄HR、收縮壓、舒張壓。

1.3.3 蛋白印跡法（Western Blot）檢測(cè)各組大鼠細(xì)胞焦亡信號(hào)通路表達(dá)情況 取暫存于-80℃冰箱的大鼠心肌組織，勻漿，提取蛋白，依次進(jìn)行蛋白變性、蛋白定量、電泳、轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2h，洗膜并加入Caspase-1、GSDMD 及IL-1（1:1 000）抗體，以GAPDH（1:5 000）為內(nèi)參，4℃孵育過(guò)夜，洗膜加二抗室溫孵育2h，顯像，采用凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白相對(duì)內(nèi)參表達(dá)量。

1.3.4 HE 染色 心肌組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇脫水，蘇木素溶液、伊紅溶液染色，乙醇再次脫水，封片后光鏡下觀察各組心肌組織病理變化。

1.3.5 免疫組化 心肌組織切片置于60℃溫箱中烤片2h，脫蠟、水化后，EDTA 熱抗原修復(fù)，3% H2O2室溫孵育20min，PBS 液漂洗（3 次×5min）后加山羊血清封閉液，室溫下放置15min 后加入NLRP3、Caspase-1、GSDMD 抗體（1:100）4℃過(guò)夜。次日PBS漂洗后滴加生物素標(biāo)記山羊抗大鼠抗體，37℃孵育30min，PBS 漂洗后DAB 顯色2min，自來(lái)水充分沖洗后蘇木素復(fù)染3min，梯度酒精脫水、二甲苯透明、樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察圖像并拍照，每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野，通過(guò)ImageJ 軟件分析圖像。

1.3.6 ELISA 檢測(cè)炎癥因子 將采集的大鼠血液在4℃離心機(jī)中以3 000r/min 離心15min，獲取血清，使用ELISA 試劑盒檢測(cè)血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm 處吸光度值，計(jì)算各因子含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血流動(dòng)力學(xué)比較造模前各組大鼠的體重、HR、收縮壓、舒張壓差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。ROSC 后30min，與假手術(shù)組相比，生理鹽水組大鼠HR 增快，生理鹽水組及依達(dá)拉奉組大鼠收縮壓與舒張壓大幅度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與生理鹽水組相比，依達(dá)拉奉組大鼠HR 減慢，收縮壓及舒張壓位于正常范圍內(nèi)且平穩(wěn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表1 三組實(shí)驗(yàn)前基線水平比較（±s）

表1 三組實(shí)驗(yàn)前基線水平比較（±s）

分組HR（次/min）收縮壓（mmHg） 舒張壓（mmHg）體重（g）假手術(shù)組233.91±14.91105.12±11.1298.53±12.22263.72±9.65生理鹽水組246.50±18.77108.05±10.55102.74±9.40249.91±16.80依達(dá)拉奉組241.17±22.29107.46±10.68101.38±12.08266.36±15.90 F 1.2640.2400.4290.413 P 0.2960.7880.6540.666

表2 三組ROSC 30min 后HR、血壓水平比較（±s）

表2 三組ROSC 30min 后HR、血壓水平比較（±s）

注:與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與生理鹽水組比較，#P<0.05，##P<0.01

分組HR（次/min）收縮壓（mmHg） 舒張壓（mmHg）假手術(shù)組233.91±14.92105.12±11.1298.53±12.22生理鹽水組 281.46±36.02**53.47±7.79**50.10±9.99**依達(dá)拉奉組 239.83±37.34#82.27±15.88**## 77.14±14.39**##F 8.27856.07047.032 P 0.0010.0000.000

2.2 三組心肺復(fù)蘇后大鼠心肌組織形態(tài)的變化HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞無(wú)水腫，心肌纖維條理清晰呈束狀排列，細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)正常。生理鹽水組細(xì)胞排列紊亂，且部分細(xì)胞斷裂，伴有周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)，依達(dá)拉奉組上述情況緩解。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織HE 染色（×40）

2.3 三組炎癥因子表達(dá)情況與假手術(shù)組相比，生理鹽水組IL-1β、IL-6、TNF-α 表達(dá)量明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），依達(dá)拉奉組IL-1β、IL-6、TNF-α 表達(dá)量稍下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與生理鹽水組相比，依達(dá)拉奉組IL-1β、IL-6、TNF-α 顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 三組大鼠血清中炎癥因子水平比較（pg/ml，±s）

表3 三組大鼠血清中炎癥因子水平比較（pg/ml，±s）

注:與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與生理鹽水組比較，#P<0.05，##P<0.01

分組IL-1βIL-6TNF-α假手術(shù)組67.09±12.7838.32±23.4076.58±7.67生理鹽水組 122.14±33.37*112.57±20.56*145.92±58.96**依達(dá)拉奉組 61.68±12.81##36.82±9.22##67.77±6.73##F 11.64231.98010.594 P 0.0020.0000.001

2.4 三組心肌細(xì)胞焦亡信號(hào)通路情況比較Western blot 及免疫組織化學(xué)分析檢測(cè)細(xì)胞焦亡通路關(guān)鍵蛋白在大鼠心肌中表達(dá)情況顯示：與假手術(shù)組相比，生理鹽水組中NLRP3、Caspase-1、GSDMD 蛋白含量在ROSC 后均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與生理鹽水組相比，依達(dá)拉奉組上述蛋白含量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Western blot 檢測(cè)IL-1β：與假手術(shù)組相比，生理鹽水組中IL-1β 蛋白表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與生理鹽水組相比，依達(dá)拉奉組蛋白表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖3、4，表4。

表4 三組大鼠心肌組織中NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)情況（%，±s）

表4 三組大鼠心肌組織中NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)情況（%，±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與生理鹽水組比較，#P<0.05，##P<0.01

分組NLRP3Caspase-1GSDMD假手術(shù)組1.38±0.291.67±0.931.20±0.36生理鹽水組44.74±5.03**15.95±2.72**13.50±6.71**依達(dá)拉奉組8.18±1.53#5.70±0.59**##2.44±1.15#F 175.87762.65214.794 P 0.0000.0000.010

圖3 Western blot 檢測(cè)各組焦亡細(xì)胞通路蛋白的表達(dá)情況

圖4 免疫組化檢測(cè)各組焦亡細(xì)胞通路蛋白的表達(dá)情況

3 討論

本研究通過(guò)制作大鼠心臟驟停后心肺復(fù)蘇造成MIRI 模型，ROSC 后給予依達(dá)拉奉，觀察藥物對(duì)細(xì)胞焦亡通路蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)而研究對(duì)心肌的保護(hù)作用機(jī)制。

炎癥反應(yīng)是機(jī)體針對(duì)有害刺激的重要生理反應(yīng)，在免疫反應(yīng)中起重要作用。有研究證明[13，14]，心肺復(fù)蘇后全身缺血再灌注損傷誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)激活，多種炎癥因子及炎癥介質(zhì)釋放可直接抑制循環(huán)和心肌功能，最終導(dǎo)致心肌梗死、纖維化及心力衰竭等不良后果。炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞募集到心肌缺血區(qū)域，釋放大量炎癥因子，包括IL-1β、TNF-α 及IL-6 等，其中TNF-α 是較早釋放的具有多種生物效應(yīng)的重要促炎細(xì)胞因子，可誘發(fā)“次級(jí)”炎癥因子IL-6 的產(chǎn)生，再通過(guò)IL-6 刺激各種細(xì)胞群在身體防御中發(fā)揮核心作用[15]，是炎癥介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示心臟驟停后心肺復(fù)蘇模型生理鹽水組的炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平較假手術(shù)組均升高。Wallert 等[16]應(yīng)用維生素E 最強(qiáng)的抗氧化形式α-生育酚（α-TOH）對(duì)大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎60min 后制備MIRI 模型，結(jié)果證明α-TOH 通過(guò)抑制MIRI 誘導(dǎo)的氧化和炎癥反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)保護(hù)心功能。西紅花素可以通過(guò)Nrf2 減輕炎癥和未折疊蛋白，在心臟保護(hù)機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]?；诩韧芯考氨緦?shí)驗(yàn)研究證明，抗炎是治療心臟驟停心肺復(fù)蘇后MIRI 的一種策略。

在心肌缺血的情況下，線粒體功能障礙和溶酶體不穩(wěn)定會(huì)增加鉀離子外流，從而激活NLRP3 炎癥小體，促進(jìn)細(xì)胞焦亡[18]。NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的無(wú)菌性炎癥貫穿MIRI 整個(gè)過(guò)程，其引起大量炎癥介質(zhì)釋放至細(xì)胞外，大量促炎刺激信號(hào)引起中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及其他類(lèi)型白細(xì)胞持續(xù)向炎癥部位募集。炎癥體衍生的細(xì)胞因子IL-1β 誘導(dǎo)大鼠釋放活性IL-18 介導(dǎo)左室收縮功能障礙，加重MIRI[19]。同時(shí)有研究[20]發(fā)現(xiàn)，MIRI 模型中使用藥物抑制NLRP3 炎性小體，可限制大鼠心肌缺血再灌注后繼發(fā)性炎癥損傷和梗死面積；Yue 等[21]發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶的沉默可通過(guò)抑制NLRP3/ASC/Caspase-1 軸的激活來(lái)改善MIRI 所致的心肌功能障礙。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞焦亡通路相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)，NLRP3、Caspase-1、GSDMD 蛋白在大鼠心臟驟停心肺復(fù)蘇后心肌組織中的含量均增加，與上述研究結(jié)果相同，表明細(xì)胞焦亡參與心臟驟停心肺復(fù)蘇后MIRI。

依達(dá)拉奉是一種具有抗炎、抗氧化、改善缺血再灌注損傷的藥物[22]，臨床上用于急性腦梗死的治療，可降低腦缺血再灌注損傷。隨著對(duì)其研究深入，其在臨床上的應(yīng)用范圍呈現(xiàn)逐漸擴(kuò)展趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)對(duì)于心肌缺血再灌注保護(hù)同樣具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉組血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α 炎癥因子較生理鹽水組均下降，同時(shí)通過(guò)Western blot 檢測(cè)心肌組織中IL-1β 的表達(dá)也驗(yàn)證MIRI 過(guò)程中有大量IL-1β 炎癥因子釋放，同時(shí)表明依達(dá)拉奉能夠減輕炎癥因子介導(dǎo)的MIRI，從而改善微循環(huán)保護(hù)心肌細(xì)胞。有研究表明[23]依達(dá)拉奉治療急性心肌梗死行CABG 術(shù)的患者，通過(guò)有效控制血清TNF-α、IL-6、NO 水平，從而保護(hù)心肌細(xì)胞，改善心功能，提高臨床療效；林菁等[24]發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉能有效降低心臟驟停心肺復(fù)蘇成功后患者的血清TNF-α、IL-1β 等促炎性細(xì)胞因子水平，均與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)中Western blot 檢測(cè)依達(dá)拉奉組細(xì)胞焦亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)量較生理鹽水組均有所下降，在免疫組化中再次驗(yàn)證結(jié)果相同。因此，依達(dá)拉奉可能通過(guò)抑制細(xì)胞焦亡通路蛋白的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)大鼠心臟驟停心肺復(fù)蘇后MIRI發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，依達(dá)拉奉對(duì)大鼠心臟驟停心肺復(fù)蘇后MIRI 起保護(hù)作用，可能機(jī)制是通過(guò)控制級(jí)聯(lián)放大炎癥反應(yīng)，降低NLRP3、Caspase-1、GSDMD 蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞焦亡有關(guān)。