陳佳樂,任順成

河南工業(yè)大學(xué) 河南省天然色素制備重點實驗室,河南 鄭州 450001

海南是我國水稻栽培起源地之一,具備生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)稻米的自然條件,其獨特的地理優(yōu)勢使得當(dāng)?shù)厮驹絹碓绞艿绞袌龅那嗖A[1]。目前,在我國有色稻米種質(zhì)資源中,紅米稻種占據(jù)首位[2],瓊北紅米作為我國有色稻種資源中不可或缺的一種,分布于海南北部,種植歷史悠久。

研究表明,有色稻米籽粒的果皮和種皮中聚集著豐富的色素[3],被認(rèn)為是功能性食品中最有價值的抗氧化劑來源。研究認(rèn)為,黑米中的主要著色劑是花色素苷,如花青素和飛燕草色素,而紅米中的主要著色劑是原花青素和黃烷-3-醇低聚物[4-6]。由于有色稻米中富含豐富的天然活性物質(zhì),因此食用有色稻米對人體健康有多種益處[7],如抗氧化、抗癌、抗糖尿病等方面。

天然植物色素的提取通常使用有機溶劑萃取,目前,溶劑浸提法因方法簡單、易操作被廣泛應(yīng)用,為了克服此方法產(chǎn)量以及效率低等問題,通常加以超聲波、酶解以及超臨界流體萃取法輔助提取,提高色素提取效率[8]。Yodkeeree等[9]研究發(fā)現(xiàn),原花青素是紅米乙醇提取物中的主要酚類物質(zhì),對膠原蛋白水解酶有強烈的抑制作用,能有效抑制皮膚老化,是一種天然的抗氧化劑。Yu等[10]通過提取荊州市和淮安市當(dāng)?shù)胤N植的有色稻米種皮活性物質(zhì)并測定其含量發(fā)現(xiàn),紅米提取物中總酚、黃酮和原花青素含量顯著高于普通稻米,同時有較高的清除DPPH和ABTS自由基的效果。

天然植物活性物質(zhì)因其具有較高的保健功效以及食用安全性成為近年來的研究熱點。因此,為提高瓊北紅米的應(yīng)用價值和進一步探究紅米色素的生物活性,本試驗在紅米色素提取單因素試驗的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化瓊北紅米色素提取工藝,利用大孔樹脂將其精制并初步鑒定紅米色素結(jié)構(gòu),分析其抗氧化活性。

1 材料與試劑

1.1 試驗材料

瓊北紅米：海南璟益農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司;乙醇、甲醇、香草醛,溴化鉀等：分析純,新豐化驗器材有限公司;大孔樹脂(HPD300、AB-8、NKA-9)：新豐化驗器材有限公司;兒茶素(>98%)、蘆丁(>95%)、沒食子酸(>95%)：上海源葉生物科技有限公司;DPPH、ABTS：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FW135高速萬能粉碎機：北京市光明醫(yī)療儀器有限公司;FA1004電子分析天平：上海上平儀器公司;FXB101-1電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海樹立儀器儀表有限公司;TDL-5A臺式低速離心機：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;UV-725紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司;RE-5旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠;PHS-3C雷磁酸度計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市華峰儀器有限公司;Tensor Ⅱ傅里葉紅外光譜儀：德國Bruker公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的處理

瓊北紅米→粉碎→過60目篩→石油醚脫脂→干燥→粉末待用。

1.3.2 基本成分的測定

水分：參照GB 5009.3—2016;灰分：參照GB 5009.4—2016;蛋白質(zhì)：參照GB 5009.5—2016;粗脂肪：參照GB 5009.6—2016;粗淀粉：參照GB/T 20378—2006;總酚：采用福林酚比色法;黃酮：采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法。

1.3.3 紅米色素紫外全波長掃描

參考Wang等[11]的方法提取紅米色素,適當(dāng)稀釋提取液,在200～700 nm進行紫外全波長掃描。

1.3.4 紅米色素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制2.0 mg·mL-1兒茶素甲醇溶液,分別吸取0.25、1、2、3、4、5 mL于10 mL容量瓶中定容,再各吸取1 mL與5 mL 2%香草醛甲醇溶液混合,振蕩搖勻后加入1 mL濃鹽酸,以1 mL甲醇為空白,30 ℃避光水浴5 min后于500 nm處測吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo),兒茶素濃度為橫坐標(biāo)進行線性擬合,得到紅米色素標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：Y=0.661X-0.005 2,R2=0.998 1。

1.3.5 紅米色素提取工藝單因素試驗

參考Wang等[11]的方法確定初始提取條件：50 ℃、1 h、1∶10 g·mL-1、80%乙醇。分別考察提取時間(30、60、90、120、150 min),水浴溫度(30、40、50、60、70 ℃),料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g·mL-1),乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%),將提取液定容補齊后,計算紅米色素得率,試驗重復(fù)測定3次。

1.3.6 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上,采用 Design-Expert 8.0 試驗設(shè)計軟件中的Box-Behnken模型,計算紅米色素得率,優(yōu)化提取工藝條件。

1.3.7 紅米色素的精制及純度的測定

參考Yang等[12]的方法對3種不同極性大孔樹脂進行預(yù)處理,根據(jù)Shen等[13]的方法計算3種樹脂對紅米色素的吸附率和解析率,篩選出分離精制效果最優(yōu)的樹脂。參考Musdzalifah等[14]的方法進行精制：水洗體積2 BV,洗脫液70%乙醇,洗脫體積3 BV,除去色素中的蛋白、糖類、脂類等雜質(zhì)。將精制后的樣品溶液濃縮凍干成粉,-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

將精制后的紅米色素溶液濃縮凍干后參照馬燁[15]的方法,計算紅米色素精制物的純度。

式中：C0為吸附前溶液中色素質(zhì)量濃度,mg·mL-1;C1為吸附后溶液中色素質(zhì)量濃度,mg·mL-1;C2為解吸液中色素質(zhì)量濃度,mg·mL-1。

1.3.8 紅米色素的鑒定

參考Esquivel-Alvarado等[16]的方法,將KBr與純化后的紅米色素粉末按照2%(質(zhì)量比)混合,研磨成均勻的粉末后進行壓制,使用KBr純品壓片掃描背景,然后在4 000～400 cm-1下對樣品進行掃描。

參考紀(jì)秀鳳[17]的方法,配制合適濃度的紅米色素和兒茶素溶液,使用香草醛-鹽酸法,按照1.3.4中方法,在400～600 nm進行全波長掃描。

1.3.9 紅米色素抗氧化性研究

1.3.9.1 DPPH自由基清除作用

參照Peanparkdee等[18]的方法并做修改。將2 mL不同質(zhì)量濃度(5、10、20、50、100、200 μg·mL-1)的紅米色素溶液與3 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液混合,振蕩均勻,室溫避光反應(yīng)30 min后,在517 nm處測定吸光度,用相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸(Vc)為參照。將DPPH溶液替換為等量乙醇溶液作為樣品對照組,將樣品溶液替換為等量蒸餾水作為空白組。計算DPPH自由基清除率。

式中：A1、A2、A3分別為樣品組、樣品對照組、空白組在517 nm處的吸光度。

1.3.9.2 ABTS自由基清除作用

參照張燕等[19]的方法并做修改。將25 mL 7 mmol/L ABTS溶液與等體積的2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液混合,室溫避光放置14～16 h,在使用之前,用磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L、pH 6.86)將其稀釋,當(dāng)稀釋液在734 nm處的吸光度為0.7～1.2即可使用。將1 mL不同質(zhì)量濃度(5、10、20、50、100、200 μg·mL-1)的樣品溶液與4 mL現(xiàn)配的ABTS工作液混合,振蕩均勻,常溫避光反應(yīng)6 min,在734 nm處測定吸光度,用相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸(Vc)為參照;將ABTS溶液替換為等量蒸餾水作為樣品對照組,將樣品溶液替換為等量蒸餾水作為空白組。計算ABTS自由基清除率。

式中：A1、A2、A3分別為樣品組、樣品對照組、空白組在517 nm處的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Design-Expert 8.0軟件進行方差分析,使用Origin 2018軟件進行繪圖,使用OMNIC 8軟件進行標(biāo)峰處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅米成分分析

由表1可知：瓊北紅米含有豐富的粗淀粉,含量達到了62.92%;瓊北紅米的蛋白質(zhì)以及粗脂肪含量分別為11.28%和2.67%;還含有多酚、黃酮類生物活性物質(zhì)。因此,瓊北紅米是一種有較高食用價值和保健功效的谷物。

表1 瓊北紅米的成分Table 1 Composition of red rice

2.2 紅米色素紫外可見掃描

以往的研究發(fā)現(xiàn)原花青素沉積在紅色稻米的種皮上,紅米籽粒以原花青素的存在為特征[3,20]。對瓊北紅米色素粗提物進行紫外全波長掃描得圖1。由圖1可知,紅米色素在280 nm處有最大吸收峰,在530 nm處并未出現(xiàn)吸收峰,這與市售井岡山紅米的紫外光譜圖一致[21],表明瓊北紅米是以原花青素為主要呈色物質(zhì)的有色稻米。

圖1 紅米色素全波長掃描Fig.1 Full wavelength scanning of red rice pigment

2.3 紅米色素提取工藝單因素試驗

2.3.1 提取時間

提取時間對紅米色素得率的影響如圖2(a)所示,紅米色素得率隨時間的延長呈先增加后降低的趨勢,在90 min時,紅米色素得率達到最大,隨著提取時間的延長,紅米色素得率略有下降。這可能是因為長時間受熱條件下紅米色素不穩(wěn)定,被分解或氧化[22]。因此,選擇提取時間為90 min。

2.3.2 提取溫度

提取溫度對紅米色素得率的影響如圖2(b)所示,紅米色素得率隨時間的延長呈先增加后降低的趨勢,提取溫度為50 ℃時,紅米色素的得率達到最大,當(dāng)溫度高于50 ℃時,紅米色素得率顯著下降。這可能是因為在較低溫度下,升高溫度加速了溶劑的滲透,而過高的溫度破壞了紅米色素的結(jié)構(gòu)[23]。因此,選擇提取溫度為50 ℃。

2.3.3 提取料液比

提取料液比對紅米色素得率的影響如圖2(c)所示,隨著料液比的增大,紅米色素的得率也不斷增大,當(dāng)料液比小于1∶20 g·mL-1,紅米色素的得率增加緩慢。這可能是因為減小料液比能夠使紅米色素與溶劑充分接觸,當(dāng)達到一定比例后,紅米色素已基本溶出[22]?？紤]經(jīng)濟效益,因此,選擇提取料液比為1∶20 g·mL-1。

2.3.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)

乙醇體積分?jǐn)?shù)對紅米色素得率的影響如圖2(d)所示,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,紅米色素得率先增大后降低,在70%時紅米色素得率最大,隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增大,紅米色素得率呈下降趨勢。這可能是因為70%乙醇的極性與紅米色素相似,利于紅米色素的溶出[22]。因此,選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.4 響應(yīng)面試驗方案設(shè)計和結(jié)果分析

圖2 提取時間、提取溫度、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)對紅米色素得率的影響Fig.2 Effects of extraction time, extraction temperature, ratio of material to liquid, and ethanol concentration on the yield of red rice pigment

表2 Box-Behnken 試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of the Box-Behnken design

根據(jù)單因素試驗結(jié)果,考慮到料液比對紅米色素得率影響相對較小,且未出現(xiàn)下降拐點,只選取提取時間(A)、提取溫度(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)為考察因素,進行響應(yīng)面試驗,試驗因素及水平編碼見表2。

利用Design-Expert 8.0軟件統(tǒng)計表3中的數(shù)據(jù)并進行方差分析,結(jié)果如表4所示,得到各因素回歸擬合方程：

Y=6.11+0.080A-0.085B+0.12C-0.17AB-0.047AC+0.11BC-0.31A2-0.57B2-0.20C2(Y為紅米色素得率)。

表3 響應(yīng)面法試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Experimental design and results of response surface method

調(diào)整實際工藝參數(shù)：提取時間95 min,提取溫度50 ℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)75%,料液比1∶20 g·mL-1。驗證試驗結(jié)果為紅米色素得率(6.22±0.13) mg·g-1,與模型值相比較誤差為1.47%,證明了此提取工藝的可靠性和有效性。馬燁[15]通過浸提法提取哈爾濱中和鎮(zhèn)紅米色素,得到的紅米色素得率為(4.37±0.02)mg·g-1,低于本試驗的結(jié)果。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

圖3 各因素交互作用響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface diagram of the interaction of various factors

2.5 紅米色素的精制

由表5可知,3種型號的樹脂中,AB-8對紅米色素的吸附率與解吸率均為最大,表明其對紅米色素有較好的精制效果,故選擇AB-8用于精制紅米色素的大孔樹脂。按照1.3.7中的工藝進行紅米色素的精制,脫去多糖、蛋白等雜質(zhì)。通過測定可知,經(jīng)過大孔樹脂精制后紅米色素的純度為74.53%±2.79%,表明精制效果較好。

表5 3種大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸效果Table 5 Static adsorption and desorption effects of three macroporous resins

2.6 紅米色素的鑒定

2.7 紅米色素抗氧化性研究

從圖5可以看出,當(dāng)紅米色素和 Vc質(zhì)量濃度為0～200 μg·mL-1時,其對DPPH和ABTS自由基的清除能力均隨質(zhì)量濃度的增加而提高。當(dāng)質(zhì)量濃度大于50 μg·mL-1時,紅米色素和Vc對DPPH自由基的清除率趨于平穩(wěn),且均達到90%以上,二者的IC50分別為6.48、4.44 μg·mL-1。當(dāng)質(zhì)量濃度大于50 μg·mL-1時,紅米色素和Vc對ABTS自由基的清除率趨于平穩(wěn),且均達到95%以上,二者的IC50分別為7.38、7.50

圖4 紅米色素傅里葉紅外和紫外鑒定圖譜Fig.4 Fourier transform infrared and ultraviolet identification spectra of red rice pigment

圖5 紅米色素、Vc對DPPH自由基清除作用和ABTS自由基清除作用Fig.5 Scavenging effects of red rice pigment and Vc on DPPH radical and ABTS radical

μg·mL-1。瓊北紅米色素具有較強的抗氧化能力,這與色素中含有豐富的原花青素、酚酸以及黃酮等酚類物質(zhì)密切相關(guān)[9-10],這些化合物具有單個或多個酚羥基結(jié)構(gòu),能夠釋放出H+,同時與自由基競爭性結(jié)合,具有較強的抗氧化能力。因此,抗氧化研究初步表明瓊北紅米色素可以作為一種清除人體內(nèi)自由基的天然抗氧化劑。

3 結(jié)論

由紫外全波長掃描可知,紅米色素在280 nm處有最大吸收峰,與原花青素紫外最大吸收峰相似。通過紅米色素提取工藝單因素和響應(yīng)面試驗確定最佳提取工藝為提取時間95 min,提取溫度50 ℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)75%,料液比1∶20 g·mL-1,此提取條件下紅米色素得率為(6.22±0.13) mg·g-1。將紅米色素經(jīng)AB-8型大孔樹脂精制后,通過紅外和紫外光譜鑒定可知紅米色素中的原花青素是以(表)兒茶素為結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成的原花青定聚合物,同時紅米色素對DPPH以及ABTS自由基均有較強的清除能力,其IC50分別為6.48、7.38 μg·mL-1,表明瓊北紅米相較于常規(guī)稻米具有更好的保健功效,具有成為新型功能性食品的潛力。