鮮志芃,喻國(guó)凍,,張?zhí)?吳志敏,周方偉

(1.貴州醫(yī)科大學(xué),貴州 貴陽(yáng) 550004;2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科,貴州 貴陽(yáng) 550004)

鼻咽癌是一種起源于鼻咽黏膜內(nèi)層的上皮源性惡性腫瘤,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前認(rèn)為與EB 病毒 (epstein-barrvirus, EBV) 感染等多因素有關(guān)[1]。鼻咽癌發(fā)病較為隱匿,患者確診時(shí)往往已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。因此,探索鼻咽癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移分子機(jī)制對(duì)早期診斷、抑制或延緩鼻咽癌轉(zhuǎn)移、改善鼻咽癌患者預(yù)后具有重大意義。

Src同源成員和膠原同源物(Src homolog and collagen homolog,SHC)SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白1(SHC SH2-domain binding protein 1,SHCBP1)位于染色體 16q11.2[3]。研究發(fā)現(xiàn)SHCBP1是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞分裂中的重要蛋白質(zhì),參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、早期胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生和進(jìn)展[4]。目前有研究發(fā)現(xiàn)SHCBP1在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)過(guò)程中扮演了重要的角色,而EMT也被證實(shí)在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中極為重要,其可增強(qiáng)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲、放化療抵抗、腫瘤干性等能力[5-7]。同時(shí)也有研究指出EMT與腫瘤免疫浸潤(rùn)之間有著密切的聯(lián)系[8]。在滑膜肉瘤中SHCBP1高表達(dá)促進(jìn)了EMT過(guò)程的發(fā)生,從而使腫瘤的侵襲、遷移能力增強(qiáng)[9]。Liu等[10]發(fā)現(xiàn) 在肺癌中表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)可誘導(dǎo) SHCBP1高表達(dá),從而促進(jìn)β-catenin入核,促進(jìn)EMT過(guò)程發(fā)生,并可通過(guò)激活EGF-β-catenin通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖與侵襲能力。

目前有研究表明[11-12],在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中,特別是鼻咽癌的侵襲及轉(zhuǎn)移能力可能與EMT過(guò)程密切相關(guān)。前期我們利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù),發(fā)現(xiàn)SHCBP1在頭頸鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSC)中高表達(dá)。因此我們假設(shè)SHCBP1在鼻咽癌中表達(dá)量也增高,而目前未見(jiàn)關(guān)于SHCBP1在鼻咽癌EMT過(guò)程發(fā)生的研究,故本研究通過(guò)探究SHCBP1在鼻咽癌中的表達(dá)情況,以及構(gòu)建沉默SHCBP1表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞系穩(wěn)轉(zhuǎn)株,從而探究這一過(guò)程發(fā)生機(jī)制,同時(shí)分析了SHCBP1表達(dá)與HNSC患者生存率以及腫瘤免疫浸潤(rùn)間的關(guān)系,以期為鼻咽癌的治療提供新的基礎(chǔ)研究證據(jù)以及思路。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

從美國(guó)癌癥基因圖譜TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://portal.gdc.cancer.gov)獲取502例HNSC及44例正常組織的mRNA表達(dá)水平。利用R-4.1.2軟件整理、分析數(shù)據(jù),并使用edgeR包篩選差異基因,探究SHCBP1在HNSC中的表達(dá)情況。將HNSC患者按SHCBP1表達(dá)量的四分位分組,高于表達(dá)量75%為高表達(dá)組(SHCBP1-High),低于表達(dá)量25%為低表達(dá)組(SHCBP1-Low),分析SHCBP1表達(dá)量與總體生存率之間的關(guān)系,并利用單樣本基因集富集分析(single sample gene set enrichment analysis, ssGSEA)探究SHCBP1表達(dá)量與常見(jiàn)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性[13]。

1.2 組織樣本

收集貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院及貴州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院經(jīng)病理確診的初診鼻咽癌患者,所有患者確診前均未接受任何放化療,其中男18例,女13例;年齡31～60歲,平均年齡(46.19±8.46)歲。同期收集診治的疑似鼻咽癌但病理示慢性鼻咽炎的患者,其中男12例,女19例;年齡29～67歲,平均年齡(45.64±6.79)歲。所有標(biāo)本均由同一醫(yī)師獲取,所取組織離體后立即放入液氮中進(jìn)行保存。本研究獲得貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)倫理審查(倫理號(hào)2021倫審第81號(hào)),所取標(biāo)本及標(biāo)本用途均獲得患者及其家屬知情同意。

1.3 細(xì)胞及主要實(shí)驗(yàn)儀器、耗材

鼻咽癌細(xì)胞系5-8F、正常鼻咽部上皮NP69均購(gòu)自豐暉生物,引物由上海生工設(shè)計(jì)合成,慢病毒載體(LV-SHCBP1-shRNA-ZsGreen-PURO、LV- NC-ZsGreen-PURO)購(gòu)自上海漢恒生物。RPMI 160培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、Trizol均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司,Matrigel基質(zhì)膠、Transwell小室均購(gòu)自美國(guó)CORNING公司,逆轉(zhuǎn)錄及qPCR相關(guān)試劑購(gòu)自南京諾維贊生物科技有限公司,anti-SHCBP1(ab184467)購(gòu)自美國(guó)Abcam,anti-E-cadherin(#3195)、anti-N-cadherin(#13116)、anti-Vimentin(#5741)、anti-基質(zhì)金屬蛋白9(matrix metalloprotein,MMP9,#13667)均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.4 臨床樣本檢測(cè)與細(xì)胞系中SHCBP1表達(dá)情況

Trizol法分別提取臨床組織及細(xì)胞系總RNA后,使用Thermo Scientific Nano Drop 分光光度計(jì)測(cè)量所得RNA溶液濃度及純度,隨即按說(shuō)明書(shū)使用逆轉(zhuǎn)錄試劑(Takara,JP)制取cDNA。將所得部分cDNA稀釋3倍后用作實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè),剩余cDNA置于-80 ℃冰箱保存。按qPCR試劑盒(諾唯贊,南京)說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)體系及設(shè)置反應(yīng)條件,引物由上海生工公司合成。引物序列信息見(jiàn)表1,qPCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2,循環(huán)條件為預(yù)變性95 ℃,30 s;變性95 ℃,10 s,退火+延伸60 ℃,30 s,共循環(huán)40次。每個(gè)樣本設(shè)置2個(gè)復(fù)孔,分別獨(dú)立重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),結(jié)果以2-ΔΔct計(jì)算。

表1 引物序列

表2 PCR反應(yīng)體系

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒感染

將冷凍于液氮中的 5-8F 鼻咽癌細(xì)胞復(fù)蘇后,接種于含有10%胎牛血清和90% RIPM 1640的完全培養(yǎng)基的6孔板內(nèi),接種密度為3×10-4/孔,并置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后待細(xì)胞密度達(dá)30%～40%時(shí)使用慢病毒進(jìn)行感染(MOI=20),并分為NC組(空載慢病毒LV-ZsGreen-PURO-NC感染5-8F細(xì)胞)及SHCBP1-shRNA組(LV-SHCBP1-shRNA-ZsGreen-PURO沉默5-8F細(xì)胞SHCBP1表達(dá))。感染24 h后更換無(wú)病毒完全培養(yǎng)基,48～72 h后于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞綠色熒光表達(dá)情況,并加入嘌呤霉素(4 μg/mL)篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的NC組和SHCBP1-shRNA組細(xì)胞1 500/孔接種于96孔板內(nèi),每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,并重復(fù)3次。分別在0、24、48、72、96 h時(shí)分別在每孔中加入10 μL CCK-8溶液,并置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h后,利用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處吸光度。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的NC組和SHCBP1-shRNA組細(xì)以1×10-5/孔種于6孔板內(nèi),放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),待細(xì)胞長(zhǎng)滿6孔板后,使用200 μL槍頭垂直于6孔板底壁做劃痕,并使用PBS漂洗劃落細(xì)胞后加入無(wú)血清培養(yǎng)基,于0、12、24 h后采用顯微鏡在相同位置拍照。

1.8 集落形成實(shí)驗(yàn)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的NC組和SHCBP1-shRNA 1 000/孔接種于6孔板中,放入培養(yǎng)箱內(nèi),每隔2～3 d換液并于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況,待肉眼可見(jiàn)細(xì)胞集落時(shí),去除培養(yǎng)基,加入多聚甲醛固定20 min,加入結(jié)晶紫溶液染色20 min,并拍照、計(jì)數(shù)、分析數(shù)據(jù)。

1.9 Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的NC組和SHCBP1-shRNA制成5×10-4/mL無(wú)血清細(xì)胞懸液,并以200 μL/孔種入Transwell小室上室,并于下室內(nèi)加入600 μL含30% FBS完全培養(yǎng)基。24 h后取出Transwell小室,使用棉簽輕輕擦拭小室上室,將小室置于4%多聚甲醛內(nèi)固定20 min。固定完成后,使用PBS輕輕漂洗小室,并將小室置于結(jié)晶紫溶液中染色20 min。PBS輕輕漂洗小室后置于倒置顯微鏡下拍照、分析細(xì)胞遷移率。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)先于小室上室涂抹Matrigel基質(zhì)膠并放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)1 h使基質(zhì)膠凝固,其余步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.10蛋白免疫印跡檢測(cè)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的NC組、SHCBP1-shRNA組細(xì)胞接種于100 mm培養(yǎng)皿內(nèi)。細(xì)胞匯合度達(dá)90%時(shí),使用含有PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白。蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA法)進(jìn)行蛋白定量后,加入5×Loading buffer于蛋白樣品內(nèi)并充分混勻,置于100 ℃金屬浴上變性5 min,置于-80 ℃冰箱備用。按說(shuō)明書(shū)配制10% SDS-PADG凝膠,充分混勻變性蛋白樣品后上樣,上樣量為5 μg/孔。以恒壓方式進(jìn)行電泳,電泳結(jié)束后以恒流260 mA轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,取下PVDF膜置于5%脫脂牛奶內(nèi)室溫封閉1 h,加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜,回收一抗,TBST漂洗3次,10 min/次,加入二抗,室溫孵育1 h,回收二抗,TBST漂洗3次,10 min/次。配置新鮮ECL顯影液,將PVDF膜放入其中浸泡10 s左右后,放入凝膠成像儀內(nèi),采集熒光信號(hào)、拍照,并分析結(jié)果。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中SHCBP1在HNSC中的表達(dá)情況

分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中502例HNSC及44例正常組織的mRNA表達(dá)水平,得出SHCBP1的mRNA表達(dá)量在HNSC中明顯增高(P<0.05),見(jiàn)圖1A;Kaplan-Meier生存分析提示,SHCBP1高表達(dá)的患者生存率明顯低于SHCBP1低表達(dá)患者(P<0.05),見(jiàn)圖1B。

2.2 SHCBP1表達(dá)與腫瘤免疫浸潤(rùn)的關(guān)系

通過(guò)ssGSEA算法分析腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞與HNSC中SHCBP1表達(dá)量高低的關(guān)系發(fā)現(xiàn),在11種常見(jiàn)免疫細(xì)胞中,共有7種免疫細(xì)胞在HNSC中SHCBP1高表達(dá)組與SHCBP1低表達(dá)組中浸潤(rùn)程度的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖2A。通過(guò)對(duì)此7種免疫細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),Th2細(xì)胞的浸潤(rùn)程度與SHCBP1的表達(dá)量呈正相關(guān)(rs=0.422,P<0.05),而B(niǎo)細(xì)胞(rs=0.101,P=0.024)、T細(xì)胞(rs=0.148,P<0.001)、CD8+T細(xì)胞(rs=-0.151,P<0.001)、Tregs細(xì)胞(rs=0.146,P=0.001)、DC細(xì)胞(rs=0.169,P<0.001)的浸潤(rùn)程度與SHCBP1的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(圖2B)。

圖1 SHCBP1在HNSC中的表達(dá)情況 A:柱狀圖(***P<0.001); B:HNSC患者Kaplan-Meier生存曲線(P=0.036) 注:HNSC(頭頸鱗狀細(xì)胞癌)。

2.3 RT-qPCR分析臨床樣本及細(xì)胞系中SHCBP1表達(dá)情況

SHCBP1在鼻咽癌中mRNA相對(duì)表達(dá)量1.58±0.37高于慢性鼻咽炎組織中mRNA相對(duì)表達(dá)量0.53±0.19(t=11.729,P<0.001,圖3A);在5-8F細(xì)胞中mRNA相對(duì)表達(dá)量1.75±0.27高于NP69細(xì)胞中mRNA的表達(dá)量,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.895,P=0.001,圖3B)。

2.4 慢病毒感染5-8F細(xì)胞及感染效率

倒置熒光顯微鏡下觀察慢病毒感染后的5-8F細(xì)胞中熒光蛋白的表達(dá),在72 h后熒光蛋白表達(dá)率高于80%(圖4A)。RT-qPCR檢測(cè)提示SHCBP1-shRNA組SHCBP1相對(duì)表達(dá)量0.25±0.03明顯低于NC組(t=49.099,P<0.001,圖4B),免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)SHCBP1在NC組相對(duì)表達(dá)量1.05±0.32明顯高于SHCBP1 shRNA組0.34±0.40(t=23.984,P<0.001,圖4C、D),證明SHCBP1-shRNA慢病毒載體能有效沉默5-8F中SHCBP1的表達(dá)。

2.5 沉默SHCBP1對(duì)5-8F細(xì)胞增殖能力的影響

使用酶標(biāo)儀測(cè)量各組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)在450 nm處的吸光度(表3),結(jié)果顯示NC組在24、48、72、96 h的吸光度均高于SHCBP1-shRNA組,這說(shuō)明沉默5-8F細(xì)胞SHCBP1表達(dá)后可明顯抑制5-8F細(xì)胞增殖(圖5A)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)提示,SHCBP1-shRNA組細(xì)胞克隆數(shù)量31.00±12.05明顯低于NC組283.43±41.43(t=15.478,P<0.001,圖5B、C)。

圖2 免疫細(xì)胞在SHCBP1高表達(dá)組與低表達(dá)組中的浸潤(rùn)程度差異 A:11種免疫細(xì)胞; B:B細(xì)胞、T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Treg細(xì)胞、DC細(xì)胞浸潤(rùn)程度與HNSC中SHCBP1表達(dá)量的關(guān)系(*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001)

圖3 臨床樣本及細(xì)胞系中SHCBP1的表達(dá)情況 A:鼻咽癌組織中mRNA相對(duì)表達(dá)量高于慢性鼻咽炎組織(***P<0.001); B:SHCBP1在NP69及5-8F中表達(dá)情況(***P<0.001)

表3 各組450nm處吸光度

圖4 慢病毒感染5-8F細(xì)胞 A:倒置熒光顯微鏡下觀察 (×200); B:慢病毒沉默SHCBP1 mRNA表達(dá)效率(***P<0.001); C、D:慢病毒沉默SHCBP1蛋白表達(dá)效率(***P<0.001)

2.6 沉默SHCBP1表達(dá)可降低5-8F細(xì)胞遷移及侵襲能力

NC組及SHCBP1-shRNA組12、24h內(nèi)遷移率見(jiàn)表4,SHCBP1-shRNA組較NC組遷移能力顯著降低(P<0.05,圖6)。Tranwell遷移實(shí)驗(yàn)提示NC組24h內(nèi)細(xì)胞遷移數(shù)量明顯高于SHCBP1-shRNA組(P<0.05);Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)同樣顯示,NC組細(xì)胞24h內(nèi)侵襲數(shù)量明顯高于SHCBP1-shRNA組(P<0.05)(表5、圖7)。

2.7 沉默SHCBP1表達(dá)可抑制5-8F細(xì)胞EMT過(guò)程激活

免疫印跡實(shí)驗(yàn)提示,SHCBP1-shRNA組E-cadherin表達(dá)明顯高于NC組(t=6.271,P=0.003),SHCBP1-shRNA組N-cadherin、Vimentin、MMP9表達(dá)明顯低于NC組(t=11.470/4.080/10.970,P<0.05),這說(shuō)明了沉默SHCBP1后,可明顯抑制5-8F細(xì)胞EMT過(guò)程(圖8)。

圖5 CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力 A:各組不同時(shí)間段5-8F細(xì)胞增殖情況(*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001); B:集落克隆形成實(shí)驗(yàn); C:兩組集落克隆數(shù)量柱狀圖(***P<0.001)

表4 NC組與SHCBP1-shRNA組不同時(shí)間遷移率比較

表5 NC組與SHCBP1-shRNA組 Transwell遷移及侵襲比較 (個(gè),

圖6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力 A:5-8F細(xì)胞遷移能力 (×200); B:5-8F細(xì)胞遷移率柱狀圖(**P<0.01)

圖8 免疫印跡實(shí)驗(yàn) A:5-8F細(xì)胞沉默SHCBP1后EMT相關(guān)蛋白變化; B:柱狀圖顯示SHCBP1-shRNA組N-cadherin、MMP9、Vimentin表達(dá)低于NC組,E-cadherin表達(dá)高于NC組(***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05) 注:MMP9(基質(zhì)金屬蛋白9)。

圖7 Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn) A: NC組與SHCBP1-shRNA組比較 (結(jié)晶紫 ×200); B:檢測(cè)5-8F細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)量柱狀圖(***P<0.001); C:檢測(cè)5-8F細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)量柱狀圖(***P<0.001)

3 討論

鼻咽癌是一種常見(jiàn)的上皮來(lái)源的頭頸部惡性腫瘤,好發(fā)于東南亞國(guó)家以及我國(guó)的福建、廣東、廣西等地區(qū)[14],其發(fā)病原因主要與EBV感染、遺傳、飲食、環(huán)境等因素相關(guān),并且有明顯的家族聚集性[14-15]。目前鼻咽癌以放療為主要治療方式,特別是近期調(diào)強(qiáng)放療的興起,大大提高了鼻咽癌的治療效率[16-17],但是因其發(fā)病部位隱蔽,早期無(wú)明顯臨床癥狀,大多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)了局部淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,從而使得患者的遠(yuǎn)期生存率明顯降低[17]。所以尋找鼻咽癌局部淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)制以及NPC發(fā)病的特異性靶點(diǎn)就顯得尤為重要。

SHCBP1能特異性結(jié)合SHC SH2結(jié)構(gòu)域,目前研究證實(shí)SHCBP1是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞分裂的重要蛋白,其參與了細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、腫瘤發(fā)生發(fā)展。一項(xiàng)關(guān)于胰腺癌的研究發(fā)現(xiàn),SHCBP1可抑制E-cadherin的表達(dá),進(jìn)而激活EMT過(guò)程,促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[18]。在肺癌中SHCBP1可通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路,從而促進(jìn)肺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及侵襲[19]。另一項(xiàng)關(guān)于非小細(xì)胞肺癌的研究發(fā)現(xiàn)[10],SHCBP1可以促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移,并且SHCBP1的表達(dá)量與NSCLC患者的中位生存時(shí)間和無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間有密切關(guān)系。在前列腺癌[20]中SHCBP1高表達(dá)與前列腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移能力相關(guān),同時(shí)SHCBP1表達(dá)量與前列腺癌的臨床分期呈正相關(guān)。神經(jīng)膠質(zhì)瘤中SHCBP1同樣可以促進(jìn)EMT過(guò)程,進(jìn)而增強(qiáng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲能力[21]。Feng等[22]發(fā)現(xiàn)SHCBP1在乳腺癌中表達(dá)增高,并且SHCBP1的表達(dá)量與乳腺癌臨床分期有明顯的相關(guān)性,通過(guò)對(duì)分子機(jī)制的研究,研究人員發(fā)現(xiàn)SHCBP1可能通過(guò)激活A(yù)KT信號(hào)通路,從而調(diào)節(jié)乳腺癌的增殖及凋亡。在滑膜肉瘤中SHCBP1高表達(dá)促進(jìn)了EMT過(guò)程的發(fā)生,從而使腫瘤的侵襲、遷移能力增強(qiáng)[9]。EMT是一種細(xì)胞由上皮表型向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)變的連續(xù)變化的生物學(xué)過(guò)程,從而使細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移、侵襲能力[23]。近年來(lái)多個(gè)研究已證實(shí)EMT在多種惡性腫瘤具有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲、耐藥性的作用[24]。E-cadherin與N-cadherin是EMT過(guò)程發(fā)生的兩種重要標(biāo)志性分子。近年來(lái)有許多研究表明[11-12],在鼻咽癌發(fā)展過(guò)程中,鼻咽癌細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)被抑制,這便造成了腫瘤細(xì)胞間的緊密黏附失效,從而腫瘤細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)。

因此本研究首先通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)SHCBP1在HNSC中表達(dá)明顯增高,并且SHCBP1的表達(dá)量與HNSC患者的總體生存率相關(guān)。同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道SHCBP1在CD4+T細(xì)胞的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用[25],而CD4+T細(xì)胞的激活及分化在腫瘤浸潤(rùn)免疫中有著重要的作用。因此我們分析了SHCBP1的表達(dá)量與幾種常見(jiàn)免疫細(xì)胞之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)SHCBP1的表達(dá)量與HNSC中Th2細(xì)胞的浸潤(rùn)量呈正相關(guān),這意味著SHCBP1可能也參與了HNSC的免疫浸潤(rùn)。隨后我們通過(guò)對(duì)臨床鼻咽癌樣本的分析以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SHCBP1在鼻咽癌組織及鼻咽癌細(xì)胞系中表達(dá)量均明顯增高。緊接著在沉默鼻咽癌細(xì)胞中SHCBP1表達(dá)后,細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)以及檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量也出現(xiàn)了變化,這提示SHCBP1可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及激活鼻咽癌的EMT過(guò)程的發(fā)生。

綜上所述,SHCBP1在鼻咽癌中作為一種促癌基因,可以促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力,同時(shí)也能激活EMT過(guò)程。然而目前關(guān)于SHCBP1激活鼻咽癌的EMT過(guò)程所涉及的具體信號(hào)通路等仍然不明確,還有待進(jìn)一步探究。與此同時(shí),本研究也發(fā)現(xiàn)SHBCP1的表達(dá)量與HNSC中Th2細(xì)胞的浸潤(rùn)呈正相關(guān),這是否意味著,SHCBP1也參與了HNSC的腫瘤免疫浸潤(rùn),同時(shí)也影響了鼻咽癌 EMT過(guò)程的激活。但是由于鼻咽癌中僅有一部分屬于角化型癌,僅僅通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)HNSC的分析,還不足以說(shuō)明這一點(diǎn)。所以還有待進(jìn)一步探究SHCBP1在鼻咽癌腫瘤免疫浸潤(rùn)中的作用。同時(shí)由于SHCBP1作為一種重要的與細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳遞有關(guān)的蛋白,這預(yù)示著SHCBP1有望成為一種鼻咽癌治療的新靶點(diǎn)。