王飛，張小蕾，李含章，李亞楠，胡夢妮，馬駿△

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其特征是黑質(zhì)致密部位多巴胺能神經(jīng)元的進行性變性和神經(jīng)元內(nèi)包涵體（路易體）的形成。酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）是一種合成多巴胺的關(guān)鍵酶，其表達減少可增加PD 的發(fā)生率［1］。α-突觸核蛋白（αsynuclein，α-syn）是路易體的主要組成部分，α-syn的異常積聚是PD 發(fā)生的重要環(huán)節(jié)之一［2-3］。然而，PD的確切發(fā)病機制尚不清楚。相關(guān)研究表明，線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬功能障礙和鈣超載等因素均可導(dǎo)致PD 的發(fā)生與進展［4］。已有研究證實，自噬功能障礙在包括PD、阿爾茨海默病等的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中非常重要［5］。據(jù)報道，多巴胺神經(jīng)元的自噬受PD相關(guān)基因和神經(jīng)毒素的影響，進而引發(fā)α-syn的異常積聚［6］。由于自噬是參與αsyn降解的主要過程之一，因此上調(diào)自噬可能是減輕α-syn 聚集性的一種值得探究的策略。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of Rapamycin，mTOR）途徑是一條經(jīng)典的自噬途徑［7］。已有研究報道，PI3K/Akt/mTOR信號通路異常參與了PD的發(fā)生發(fā)展［8］。1-甲基-4-苯基吡啶離子（1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+）是一種1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine，MPTP）在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，主要用于建立SH-SY5Y細(xì)胞PD 模型［8］1612。本研究使用MPP+建立PD 模型，探討PI3K/Akt/mTOR 信號通路在PD 發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與主要試劑 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞購自美國ATCC；DEME培養(yǎng)基、青-鏈霉素、胎牛血清購自美國Thermo Fisher Scientific；CCK-8 細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒購自北京康瑞納；PI3K/Akt 激活劑胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1，純度≥97%）、PI3K/Akt 抑制劑LY294002（純度99.87%）購自美國MCE；Annexin VFITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海Fuyuanbio；MPP+（純度≥98%）、吖啶橙（acridine orange，AO）購自美國Sigma-Aldrich；添加PMSF 的RIPA 裂解液購自廣州Applygen；兔抗人α-syn、TH、p62、微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3B（microtubuleassociated protein 1 light chain 3B，LC3B）、p-mTOR、mTOR、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt和β-actin抗體及山羊抗兔IgG二抗購自英國Abcam。

1.1.2 主要儀器 ELx808TM光吸收酶標(biāo)儀購自美國Biotek；FACSCalibur流式細(xì)胞儀購自美國BD Biosciences；BX43生物顯微鏡購自日本Olympus。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y 細(xì)胞在含有10%胎牛血清、100 U/mL 青-鏈霉素的DEME 培養(yǎng)基中生長，置于37 ℃、5%CO2、濕度70%~80%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.2.2 CCK-8 檢測細(xì)胞存活率 將SH-SY5Y 細(xì)胞接種于96 孔板（5×104個/孔）中，使用不同濃度（0.25、0.5、0.75、1.0 mmol/L）的MPP+處理SH-SY5Y 細(xì)胞24 h。加入CCK-8（10 μL/孔）溶液培養(yǎng)2 h。使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處檢測吸光度，細(xì)胞存活率=（實驗組吸光度/對照組吸光度）×100%。

1.2.3 細(xì)胞分組 通過顯微鏡觀察細(xì)胞，當(dāng)其融合度達70%~80%時細(xì)胞處于對數(shù)生長期，說明生長狀態(tài)良好。將此時的SH-SY5Y 細(xì)胞接種于96 孔板，依次分為：Control 組（不做任何處理）、MPP+組（0.5 mmol/L MPP+處理）、IGF-1 組（0.1 mg/L IGF-1 處理）［9］、LY294002 組（10μmol/L LY294002處理）［8］和MPP++LY294002 組（0.5 mmol/L MPP+和10μmol/L LY294002 處理）。各組細(xì)胞均處理24 h。參照1.2.2 方法對各組SH-SY5Y細(xì)胞存活率進行檢測。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將SH-SY5Y細(xì)胞接種于6 孔板，如1.2.3 分組處理后，收集細(xì)胞（5×105個/孔），然后每孔中添加500 μL 的Annexin V 結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞（1×106個/mL），吸取100 μL 懸浮液于流式管中，添加5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI 溶液，室溫下遮光孵育10 min。使用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm 處對每個樣本進行分析。使用BD CellQuest Pro 軟件對結(jié)果進行分析。

1.2.5 AO 染色觀察自噬空泡 將SH-SY5Y 細(xì)胞接種于24孔板，如1.2.3 分組處理后，每孔中添加2 mL AO（5 g/L）染色25 min，使用顯微鏡獲取圖像。紅色熒光即表示為自噬空泡，統(tǒng)計有自噬空泡的細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比。

1.2.6 Western blot 檢測PI3K/Akt/mTOR 信號通路相關(guān)蛋白表達水平 使用添加PMSF 的RIPA 裂解液裂解各組處理的SH-SY5Y 細(xì)胞，取上清液進行Western blot 分析。裂解產(chǎn)物經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離后，于4 ℃下轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。使用5%牛血清白蛋白封閉1 h。然后添加α-syn、TH、p62、LC3B、p-mTOR、mTOR、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt 和β-actin一抗（1∶1 000）孵育。使用HRP標(biāo)記的IgG二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測。通過Image J軟件對灰度值進行量化。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值評估目的蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，然后進行Tukey事后檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MPP+對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響 0、0.25、0.5、0.75、1.0 mmol/L MPP+處理后，SH-SY5Y 細(xì)胞存活率（%）分別為100.00±0.00、78.36±5.23、55.29±4.68、42.83±5.99、35.27±4.64，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=6，F(xiàn)=199.553，P＜0.05）。與0 mmol/L MPP+相比，0.25、0.5、0.75、1.0 mmol/L MPP+明顯降低SH-SY5Y 細(xì)胞存活率，且呈劑量依賴性下降。與0 mmol/L MPP+相比，0.5 mmol/L MPP+作用24 h 后，細(xì)胞存活率下降約50%，故以0.5 mmol/L MPP+作為后續(xù)研究濃度。

2.2 抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與Control 組比較，MPP+組和IGF-1組細(xì)胞存活率降低，凋亡率增高（P＜0.05），LY294002 組細(xì)胞存活率增高，凋亡率降低（P＜0.05）。與MPP+組比較，MPP++LY294002 組細(xì)胞存活率增高，凋亡率降低（P＜0.05）；與LY294002組比較，MPP++LY294002組細(xì)胞存活率降低，凋亡率增高（P＜0.05）。而MPP+組和IGF-1組細(xì)胞存活率和凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1、表1。

Fig.1 Apoptosis of SH-SY5Y cells detected by flow cytometry圖1 流式細(xì)胞儀檢測SH-SY5Y細(xì)胞凋亡情況

Tab.1 Comparison of survival rate and apoptosis rate of SH-SY5Y cells between the five groups表1 各組SH-SY5Y細(xì)胞存活率、凋亡率比較（n=6，%，±s）

Tab.1 Comparison of survival rate and apoptosis rate of SH-SY5Y cells between the five groups表1 各組SH-SY5Y細(xì)胞存活率、凋亡率比較（n=6，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與Control 組比較，b與MPP+組比較，c與LY294002 組比較，P＜0.05；表2—4同。

組別Control組MPP+組IGF-1組LY294002組MPP++LY294002組F細(xì)胞存活率100.00±0.00 52.64±3.25a 58.69±4.15a 136.29±8.34ab 78.24±7.52bc 226.163＊＊細(xì)胞凋亡率9.36±0.98 23.48±3.07a 19.67±3.24a 4.19±0.45ab 16.35±2.18bc 70.666＊＊

Tab.2 Comparison of autophagic vacuoles ratio,expression levels of p62 and LC3B proteins between the five groups表2 各組SH-SY5Y細(xì)胞自噬空泡比例及p62、LC3B蛋白表達水平比較 （n=6，±s）

Tab.2 Comparison of autophagic vacuoles ratio,expression levels of p62 and LC3B proteins between the five groups表2 各組SH-SY5Y細(xì)胞自噬空泡比例及p62、LC3B蛋白表達水平比較 （n=6，±s）

組別Control組MPP+組IGF-1組LY294002組MPP++LY294002組F自噬空泡比例（%）75.36±9.36 24.36±2.58a 26.47±2.64a 89.89±9.08ab 61.51±5.59bc 119.538＊＊p62 0.45±0.03 1.28±0.09a 1.15±0.10a 0.24±0.02ab 0.79±0.06bc 256.787＊＊LC3BⅡ/Ⅰ0.89±0.09 0.24±0.03a 0.17±0.02a 1.28±0.11ab 0.57±0.05bc 267.938＊＊

Fig.2 Effects of inhibiting PI3K/Akt/mTOR signaling pathway on autophagy of SH-SY5Y cells treated with MPP+圖2 抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路對MPP+處理的SH-SY5Y細(xì)胞自噬的影響

2.3 抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞自噬能力的影響 與Control組比較，MPP+組和IGF-1組細(xì)胞中自噬空泡減少，LC3BⅡ/Ⅰ降低，p62 蛋白水平增高（P＜0.05）；LY294002 組細(xì)胞自噬空泡增多，LC3BⅡ/Ⅰ升高，p62 蛋白水平降低（P＜0.05）。與MPP+組比較，MPP++LY294002 組細(xì)胞自噬空泡增多，LC3BⅡ/Ⅰ升高，p62 蛋白水平降 低（P＜0.05）；與LY294002 組 比 較，MPP++LY294002 組細(xì)胞自噬空泡減少，細(xì)胞中LC3BⅡ/Ⅰ降低，p62 蛋白水平增高（P＜0.05）。而MPP+組和IGF-1 組細(xì)胞中自噬空泡比例、LC3BⅡ/Ⅰ以及p62蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2、圖2。

2.4 抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞PD 特征蛋白表達的影響 與Control組比較，MPP+組和IGF-1 組的SH-SY5Y 細(xì)胞中TH蛋白水平降低，α-syn 蛋白水平增高（P＜0.05）；LY294002組SH-SY5Y細(xì)胞中TH蛋白水平增高，αsyn 蛋白水平降低（P＜0.05）。與MPP+組比較，MPP++LY294002組SH-SY5Y細(xì)胞中TH蛋白水平增高，α-syn 蛋白水平降低（P＜0.05）；與LY294002 組比較，MPP++LY294002 組SH-SY5Y 細(xì)胞中TH 蛋白水平降低，α-syn蛋白水平增高（P＜0.05）。而MPP+組和IGF-1 組SH-SY5Y 細(xì)胞中TH 和α-syn 蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3、表3。

Fig.3 TH and α-syn protein expression in SH-SY5Y cells of each group detected by Western blot assay圖3 Western blot檢測各組SH-SY5Y細(xì)胞中TH和α-syn蛋白表達

Tab.3 Comparison of TH and α-syn protein levels in SH-SY5Y cells of each group表3 各組SH-SY5Y細(xì)胞中TH和α-syn蛋白水平比較（n=6，±s）

Tab.3 Comparison of TH and α-syn protein levels in SH-SY5Y cells of each group表3 各組SH-SY5Y細(xì)胞中TH和α-syn蛋白水平比較（n=6，±s）

組別Control組MPP+組IGF-1組LY294002組MPP++LY294002組F TH 0.73±0.07 0.22±0.03a 0.24±0.04a 0.98±0.10ab 0.48±0.04bc 167.842＊＊α-syn 0.34±0.03 0.78±0.08a 0.75±0.06a 0.16±0.02ab 0.56±0.05bc 154.391＊＊

2.5 抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR 信號通路相關(guān)蛋白表達的影響 與Control 組比較，MPP+組和IGF-1組細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt與p-mTOR/mTOR增高（P＜0.05）；LY294002 組細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 與p-mTOR/mTOR 降 低（P＜0.05）。與MPP+組比較，MPP++LY294002 組細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 與p-mTOR/mTOR 降低（P＜0.05）；與LY294002 組比較，MPP++LY294002 組細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 與p-mTOR/mTOR 增高（P＜0.05）。而MPP+組和IGF-1 組細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 與p-mTOR/mTOR 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4、圖4。

Tab.4 Analysis of p-PI3K/PI3K,p-Akt/Akt and pmTOR/mTOR ratios in SH-SY5Y cells in each group表4 各組SH-SY5Y細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比較 （n=6，±s）

Tab.4 Analysis of p-PI3K/PI3K,p-Akt/Akt and pmTOR/mTOR ratios in SH-SY5Y cells in each group表4 各組SH-SY5Y細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比較 （n=6，±s）

組別Control組MPP+組IGF-1組LY294002組MPP++LY294002組F p-PI3K/PI3K 0.44±0.05 0.81±0.07a 0.85±0.06a 0.26±0.04ab 0.60±0.06bc 114.574＊＊p-Akt/Akt 0.31±0.04 0.79±0.08a 0.84±0.06a 0.14±0.01ab 0.53±0.05bc 192.190＊＊p-mTOR/mTOR 0.35±0.04 0.76±0.06a 0.79±0.05a 0.11±0.02ab 0.59±0.05bc 235.189＊＊

Fig.4 The p-PI3K,PI3K,p-Akt,Akt,p-mTOR and mTOR protein expression in SH-SY5Y cells of each group detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測各組SH-SY5Y細(xì)胞中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR蛋白表達

3 討論

PD是一種在老年人中常見的疾病，患病率隨著人口老齡化而上升［10］。目前，通過藥物及深部腦刺激（DBS）手術(shù)治療，可明顯減輕PD 癥狀、改善生活質(zhì)量，部分患者開期時癥狀可完全消失，但長期使用藥物往往會伴隨一系列的不良反應(yīng)，DBS 手術(shù)也存在一些不良反應(yīng)，而且費用較高［11-12］。PD的運動癥狀為僵硬、運動遲緩、體位不穩(wěn)和靜息性震顫，這是由黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元的漸進性喪失引起的［13］。因此，了解PD 的發(fā)病機制對尋找針對PD 的治療藥物具有重要的臨床意義。本研究以具有多巴胺神經(jīng)元特性的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y 細(xì)胞作為研究對象，結(jié)果顯示，隨著MPP+濃度的增加，SHSY5Y 細(xì)胞存活率呈劑量依賴性下降，說明MPP+具有神經(jīng)毒性，能夠誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞建立PD模型，且最適濃度為0.5 mmol/L。

自噬在PD 的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用［5］。αsyn主要通過自噬降解［14］。PD相關(guān)基因的失調(diào)可能會破壞自噬，從而促進PD 的發(fā)展［6］。有研究表明，A30P 突變體、α-syn 可導(dǎo)致腹側(cè)中腦神經(jīng)元自噬功能障礙［15］。此外，在魚藤酮誘導(dǎo)的PD 小鼠模型中，自噬被顯著抑制，導(dǎo)致α-syn 的異常積聚［16］。在MPP+處理的SH-SY5Y細(xì)胞和MPTP 處理的小鼠中，自噬減少導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的凋亡和退化［17］。本研究結(jié)果顯示，在MPP+處理的SH-SY5Y 細(xì)胞中，細(xì)胞存活率降低，凋亡率增高，表明MPP+預(yù)處理可誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡。另外，本研究結(jié)果表明MPP+干預(yù)后細(xì)胞中自噬空泡減少，LC3BⅡ/Ⅰ顯著降低，而p62 的表達增加，與上述研究結(jié)果一致，說明MPP+預(yù)處理可減少SH-SY5Y 細(xì)胞自噬。因此，尋找保護細(xì)胞免受凋亡損傷，并促進細(xì)胞自噬的方法對PD的治療至關(guān)重要。

有研究報道，PI3K/Akt/mTOR 信號通路的失調(diào)是PD 患者多巴胺能神經(jīng)元丟失的原因［18］。mTOR是自噬過程的主要調(diào)節(jié)因子，PI3K 和Akt 是mTOR上游的2 個重要調(diào)節(jié)因子。PI3K/Akt/mTOR 信號通路是mTOR 依賴的自噬途徑中的重要信號通路，參與清除異常積聚蛋白，在PD等神經(jīng)退行性疾病中起著重要的自噬調(diào)節(jié)作用［19］。研究表明，在魚藤酮誘導(dǎo)的PD 動物模型中，抑制mTOR 可增加α-syn 的降解［16］。同樣，錳誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)障礙和α-syn 的異常聚集也可通過mTOR 抑制得到改善［20］。在MPTP預(yù)處理的PD小鼠模型中，激 活PI3K/Akt/mTOR 信號通路能導(dǎo)致自噬受損，從而觸發(fā)了炎癥小體的形成［21］。艾灸可以抑制mTOR，促進自噬，從而提高魚藤酮誘導(dǎo)的PD大鼠黑質(zhì)致密部中多巴胺能神經(jīng)元的存活率［22］。本研究表明，MPP+可能通過激活PI3K/Akt/mTOR 信號通路抑制自噬，促進凋亡，進而誘導(dǎo)PD 細(xì)胞損傷。既往研究顯示，AKT/AMPK、Parkin/Ambra1 等信號通路均與自噬相關(guān)，且參與調(diào)控PD 細(xì)胞損傷［23-24］，但這些信號通路與PI3K/Akt/mTOR信號通路是協(xié)同作用還是冗余關(guān)系，還需要進一步驗證。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路可激活自噬，減少凋亡，進而減輕MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷。

綜上所述，抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路可減輕MPP+對SH-SY5Y 細(xì)胞的毒性作用，提示PI3K/Akt/mTOR信號通路的抑制劑可用于PD的治療。今后還需進一步探討PI3K/Akt/mTOR信號通路干預(yù)后對原代多巴胺能神經(jīng)元和PD活體模型的影響。