羅菲,郭建宏,竇玉玉,唐漢慶,王謹(jǐn)瑩,張旭清

(右江民族醫(yī)學(xué)院,廣西 百色 533000)

伊立替康是一種半合成喜樹堿衍生物[1]。其活性代謝物SN-38通過肝臟中的葡萄糖醛酸化代謝為伊立替康葡萄糖醛酸化(SN-38G),然后經(jīng)膽汁排泄進(jìn)入小腸,但是腸道中的細(xì)菌產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶(GUS),會將SN-38G分解回其活性形式SN-38,其對腸上皮細(xì)胞有毒[2-3]。即使是低度腹瀉也會明顯干擾抗癌治療效果,嚴(yán)重腹瀉則會導(dǎo)致嚴(yán)重脫水、電解質(zhì)失衡和營養(yǎng)不足,這與癌癥患者的早期死亡有關(guān)。目前,伊立替康引起的腹瀉治療是基于飲食調(diào)整和使用止瀉藥物,如洛哌丁胺、生長抑素類似物奧曲肽等。然而,這些療法往往會惡化現(xiàn)有的慢性胃腸道癥狀或誘發(fā)其他副作用[4-5]。因此本實(shí)驗(yàn)主要研究的是中成藥附子理中丸對于伊立替康引起腹瀉的干預(yù)作用,并通過NF-κB途徑探討其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級8周齡Wistar雄性大鼠56只,體質(zhì)量(180±20) g,購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司[實(shí)驗(yàn)動物許可證號:SCXK(湘)2019-0013]。大鼠飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學(xué)院SPF級動物實(shí)驗(yàn)中心,本實(shí)驗(yàn)的開展得到了右江民族醫(yī)學(xué)院倫理委員會的認(rèn)可。

1.2藥物與試劑 伊立替康(CPT-11)(MedChemExpress,批號:#106771,#120150);附子理中丸(河南省濟(jì)源市濟(jì)世藥業(yè)有限公司,批號:國藥準(zhǔn)字 Z41020010);小檗堿(北京索萊寶科技有限公司,批號:No.924L022);IKK-β抑制劑(MedChemExpress,批號:#24441);HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號:No.20201215);TNF-α ELISA試劑盒(Elabscience,批號:AK05PD281092);TGF-β1 ELISA試劑盒(Elabscience,批號:AK02R28F7339);IL-4 ELISA試劑盒(Elabscience,批號:AK064FLN1874);IL-10 ELISA試劑盒(Elabscience,批號:AK042LPD0309);超純RNA提取試劑盒(愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司,批號:06421KD1);cDNA第一鏈合成試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司,批號:No.072522220912);實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒(翊圣生物科技有限公司,批號:H9001120);p65、p50和IKK-β引物(上海捷瑞生物工程有限公司);兔抗鼠GAPDH多克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,批號:00092829);兔抗鼠p65多克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,批號:23002238);兔抗鼠p50多克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,批號:00117644);兔抗鼠IKK-β多克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,批號:00072558)。

1.3儀器 CK41-32PH型顯微鏡(日本Olympus公司);TGEM Plus型微量紫外分光光度儀(北京天根生化科技有限公司公司);ME204E型電子天平(奧豪斯電子儀器有限公司);5424R小型臺式高速冷凍離心機(jī)(上海艾本德國際貿(mào)易有限公司);酶標(biāo)儀(河北慧采科技有限公司);Tanon-5200 multi型全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析儀;LightCycler96型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)系統(tǒng)(上海羅氏制藥有限公司)。

1.4動物分組、造模與給藥 將56只Wistar雄性大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為對照組、模型組、小檗堿組、IKK-β抑制劑組,附子理中丸低劑量組、附子理中丸中劑量組、附子理中丸高劑量組,每組8只大鼠。除對照組外,其余大鼠按照 125 mg/kg體質(zhì)量給予腹腔注射伊立替康溶液,連續(xù)5 d,對照組大鼠則腹腔注射等容量生理鹽水。其間每日觀察記錄大鼠腹瀉情況2次。在給藥結(jié)束48 h內(nèi),除對照組外,其余組大鼠均發(fā)生不同程度的腹瀉。造模成功后,陽性藥物組給予10∶1水溶液灌胃,給藥量為50 mg/kg;IKK-β抑制劑組給予1∶1水溶液灌胃,給藥量為2 mg/kg;將附子理中丸研磨成細(xì)粉狀后,加入1倍蒸餾水煮20 min,配制成 0.3 g/mL的混懸液,附子理中丸低劑量組、附子理中丸中劑量組、附子理中丸高劑量組分別給予10 g/kg、20 g/kg、40 g/kg附子理中丸混懸液灌胃[6];其余組則是給予等容量的蒸餾水灌胃;連續(xù)灌胃30 d。隨后取材檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.5HE染色 將大鼠結(jié)腸組織石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各20 min,然后依次放入無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各15 min,之后放入75%的乙醇5 min,然后用自來水沖洗,再放入蘇木素染液中浸染5 min,用分化液分化和返藍(lán)液返藍(lán)后將切片放入梯度酒精中各5 min,然后將切片稍晾干后用中性樹膠封固,最后用顯微鏡觀察并進(jìn)行圖像采集分析。

1.6透射電子顯微鏡 將組織固定后漂洗、脫水、浸透、包埋、修塊、切片及染色后,用透射電子顯微鏡觀察并進(jìn)行圖像采集分析。

1.7ELISA法 使用相對應(yīng)的ELISA試劑盒檢測,具體操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。檢測結(jié)腸組織中炎性因子TNF-α、TGF-β1、IL-4及IL-10的含量。

1.8實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測大鼠結(jié)腸組織中p65、p50以及IKK-β mRNA的表達(dá)情況 首先按照試劑盒說明書提取總RNA,檢測RNA濃度以及純度OD260/OD280比值在1.8～2.1范圍內(nèi)的RNA樣本可逆轉(zhuǎn)錄。然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,其條件為42 ℃孵育60 min,80 ℃孵育10 min。最后將cDNA進(jìn)一步擴(kuò)增,目的基因擴(kuò)增所需的條件是95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火/延伸30 s,整個(gè)過程40個(gè)循環(huán)。目的基因引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成,以GAPDH為內(nèi)參,各目的mRNA用2-△△Ct計(jì)算其相對表達(dá)量。引物序列見表1。

1.9蛋白免疫印跡法檢測大鼠結(jié)腸組織中p65、p50以及IKK-β蛋白的表達(dá)情況 將大鼠結(jié)腸組織蛋白質(zhì)提取完成后收集管內(nèi)上清液;按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書測定總蛋白濃度,加入5×蛋白上樣緩沖液,放入100 ℃水浴變性10 min。對變性好的總蛋白進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育,應(yīng)用自動化學(xué)發(fā)光圖像分析儀顯影,最后將p65、p50以及IKK-β蛋白的條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)水平。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)的變化 與對照組相比,模型組大鼠腸黏膜杯狀細(xì)胞缺失,隱窩減少或缺失,腺體組織紊亂,黏膜和黏膜下層被炎性細(xì)胞浸潤,上皮細(xì)胞間間隙明顯擴(kuò)大;與模型組相比,小檗堿組與IKK-β抑制劑組、附子理中丸低劑量組、附子理中丸中劑量組、附子理中丸高劑量組結(jié)腸黏膜相對光滑,杯狀細(xì)胞形態(tài)正常,隱窩表面相對規(guī)則,腺體排列整齊,單層柱狀上皮細(xì)胞形態(tài)正常但有些缺失,炎性細(xì)胞浸潤減少;與小檗堿組相比,IKK-β抑制劑組,附子理中丸低劑量組、附子理中丸中劑量組、附子理中丸高劑量組腸黏膜變化不太明顯。見圖1。

注:A.對照組;B.模型組;C.小檗堿組;D.IKK-β抑制劑組;E.附子理中丸低劑量組;F.附子理中丸中劑量組;G.附子理中丸高劑量組。

2.2大鼠結(jié)腸組織超微結(jié)構(gòu)的變化 與對照組相比,模型組腸黏膜上皮細(xì)胞損傷相對明顯,細(xì)胞膜局部破損,細(xì)胞器明顯腫脹,微絨毛(Mv)大面積退化,細(xì)胞間隙局部明顯增寬(箭頭),線粒體(M)數(shù)量豐富,大多明顯腫脹、變大,基質(zhì)變淡,嵴斷裂、減少;與模型組相比,小檗堿組與IKK-β抑制劑組、附子理中丸低劑量組、附子理中丸中劑量組、附子理中丸高劑量組腸黏膜上皮細(xì)胞輕微水腫,細(xì)胞膜完整,個(gè)別細(xì)胞器輕微腫脹,微絨毛(MV)個(gè)別細(xì)胞退化,線粒體(M)數(shù)量豐富,膜完整,嵴存在,部分局部基質(zhì)變淡;與小檗堿組相比,IKK-β抑制劑組、附子理中丸低劑量組、附子理中丸中劑量組、附子理中丸高劑量組腸黏膜超微結(jié)構(gòu)變化不太明顯。見圖2。

注:A.對照組;B.模型組;C.小檗堿組;D.IKK-β抑制劑組;E.附子理中丸低劑量組;F.附子理中丸中劑量組;G.附子理中丸高劑量組。

2.3ELISA法檢測TNF-α、TGF-β1、IL-4及IL-10的含量 與對照組相比,模型組大鼠結(jié)腸組織TNF-α、TGF-β1含量明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組相比,小檗堿組、IKK-β抑制劑組、附子理中丸各劑量組的TNF-α、TGF-β1含量降低,炎癥有緩減的趨勢,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與小檗堿組相比,IKK-β抑制劑組、附子理中丸各劑量組的TNF-α、TGF-β1含量升高或降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與對照組相比,模型組大鼠結(jié)腸組織IL-4、IL-10含量明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組相比,小檗堿組、IKK-β抑制劑組、附子理中丸各劑量組的IL-4、IL-10含量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與小檗堿組相比,IKK-β抑制劑組、附子理中丸各劑量組的IL-4、IL-10含量升高或降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2、表3。

表2 各組大鼠結(jié)腸組織TNF-α、TGF-β1的含量 (n=5)

表3 各組大鼠結(jié)腸組織IL-4、IL-10的含量 (n=5)

2.4實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測p65、p50以及IKK-β mRNA的相對表達(dá)量 與對照組相比,模型組大鼠結(jié)腸組織p65、p50以及IKK-β mRNA相對表達(dá)量明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組相比,小檗堿組、IKK-β抑制劑組、附子理中丸各劑量組的p65、p50以及IKK-β mRNA相對表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);與小檗堿組相比,IKK-β抑制劑組、附子理中丸各劑量組的p65、p50以及IKK-β mRNA相對表達(dá)量升高或降低,部分組別差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見圖3。

2.5蛋白免疫印跡法檢測p65、p50以及IKK-β蛋白的表達(dá)水平 與對照組相比,模型組大鼠結(jié)腸組p65、p50以及IKK-β蛋白的表達(dá)水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組相比,小檗堿組、IKK-β抑制劑組、附子理中丸各劑量組的p65、p50以及IKK-β蛋白的表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);與小檗堿組相比,IKK-β抑制劑組、附子理中丸各劑量組的p65、p50以及IKK-β蛋白的表達(dá)水平升高或降低,部分組別差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表4、圖4。

注:與對照組比較:#P<0.05,##P<0.01; 與模型組比較:*P<0.05,**P<0.01;與小檗堿組比較:△P<0.05,△△P<0.01。

表4 各組大鼠結(jié)腸組織p65、p50、IKK-β蛋白表達(dá)水平 n=3)

注:A.對照組;B.模型組;C.小檗堿組;D.IKK-β抑制劑組;E.附子理中丸低劑量組;F.附子理中丸中劑量組;G.附子理中丸高劑量組。

3 討論

附子理中丸是由張仲景《傷寒論》中名方理中丸加附子組方而成,2020年版《中華人民共和國藥典》記載附子理中丸的功效為溫中健脾,可用于脾胃虛寒,脘腹冷痛,嘔吐泄瀉以及手足不溫[7-8]。目前附子理中丸具有抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫以及抗腫瘤等作用,但其主要還是作用在消化系統(tǒng)疾病方面[9]。另有研究表明附子理中丸可以通過降低NF-κB1(p50)、RelA (p65)、TNF-α因子,來減輕炎癥反應(yīng)[10]。

伊立替康是一種常用的化療藥物,據(jù)報(bào)道[11-12],伊立替康作為二線療法可以提高晚期癌癥患者的總體生存率,其在1996年被食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于治療晚期結(jié)直腸癌。已有研究表明[13-14],伊立替康會導(dǎo)致嚴(yán)重的腸屏障破壞,而屏障功能障礙與腹瀉之間存在關(guān)聯(lián),但目前屏障功能障礙導(dǎo)致腹瀉的機(jī)制尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)通過建立伊立替康誘導(dǎo)大鼠腹瀉模型,用中成藥附子理中丸去干預(yù),旨在探討附子理中丸通過NF-κB途徑的抗炎止瀉作用。腹瀉以及炎癥反應(yīng)都會破壞腸黏膜屏障,因此通過HE染色以及透射電子顯微鏡兩種實(shí)驗(yàn)觀察腸黏膜的結(jié)構(gòu)變化,以及超微結(jié)構(gòu)細(xì)胞器的改變。結(jié)果表明,附子理中丸對于腸黏膜有一定的改善作用。大多數(shù)情況下,促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子同時(shí)釋放,并同樣作用于有效的免疫應(yīng)答[15]。腫瘤壞死因子TNF超家族通常是膜結(jié)合蛋白,都能激活細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)超家族可以參與炎癥和修復(fù)反應(yīng)的調(diào)節(jié),IL-4與IL-10通常被認(rèn)為是一種抗炎細(xì)胞因子,具有多種作用[16]。通過對TNF-α、TGF-β1、IL-4及IL-10炎性因子的檢測,可以表明伊立替康誘導(dǎo)了腸道發(fā)生炎癥反應(yīng),并且附子理中丸對于該反應(yīng)有一定的調(diào)節(jié)作用。NF-κB是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族,包括哺乳動物中的NF-κB1(p50/p105)、NF-κB2(p52/p100)、RelA(p65)、RelB和c-Rel[17-18]。內(nèi)源性炎癥刺激(如細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β)或病原體衍生物質(zhì)通過“經(jīng)典”或“非經(jīng)典”NF-κB途徑激活普遍存在的p65和p50同源/異源二聚體,其在胞質(zhì)中與抑制蛋白ⅠκB結(jié)合形成了三聚體復(fù)合物而處于失活狀態(tài)[19]。通過對NF-κB途徑相關(guān)因子p65、p50、IKK-β mRNA以及蛋白水平的檢測,表明附子理中丸可能是通過調(diào)節(jié)NF-κB途徑來減輕腸道的炎癥反應(yīng),并且改善其免疫功能。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明附子理中丸具有抗炎止瀉的作用。其機(jī)制可能是附子理中丸通過調(diào)節(jié)NF-κB途徑的上游以及下游因子,來改善腸道損傷。具體機(jī)制是降低促炎因子和升高抗炎因子來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),并且通過抑制p65、p50和IKK-β因子來干預(yù)NF-κB途徑,進(jìn)一步減輕腸道腹瀉與炎癥。