安素妨，董薇，楊紅旗，余永亮，許蘭杰，梁慧珍

摘要：小孢子培養(yǎng)是創(chuàng)造單倍體和雙單倍體的重要途徑，對(duì)提高紅花的育種效率具有重要意義。為了研究紅花游離小孢子的高效培養(yǎng)體系，用20份紅花材料研究花藥及小孢子培養(yǎng)中影響愈傷組織生長(zhǎng)和胚發(fā)生的關(guān)鍵因素。結(jié)果表明，小孢子發(fā)育時(shí)期、紅花品種、基本培養(yǎng)基和激素濃度是影響紅花誘導(dǎo)愈傷組織的關(guān)鍵因素?；ㄋ幣囵B(yǎng)的愈傷及胚誘導(dǎo)率高于游離小孢子，且受基因型影響。單核靠邊期管狀花長(zhǎng)度為 0.45～0.50 cm時(shí)，誘導(dǎo)成功率達(dá)到68.32%。供試的20份紅花材料中，有11份誘導(dǎo)出了愈傷組織，有1份分化出了胚狀愈傷，誘導(dǎo)成功率為15.79%。分化培養(yǎng)最適培養(yǎng)基組合為1/2 MS+B5+ 6-BA 1.0 mg/L + NAA 1.0 mg/L；小孢子懸浮培養(yǎng)最適培養(yǎng)基激素濃度以添加6-BA 4.0 mg/L 和NAA 0.5 mg/L效果最好，誘導(dǎo)愈傷率為22.5%。

關(guān)鍵詞：紅花；花藥；小孢子；愈傷組織

中圖分類(lèi)號(hào)：S567.21? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：2097-2172（2023）04-0377-06

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2023.04.018

Study on the Microspore Culture and Embryoid Induction of

Safflower Lines

AN Sufang， DONG Wei， YANGHongqi，YU Yongliang， XU Lanjie， LIANG Huizhen

（Sesame Research Centre， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou Henan 450002， China）

Abstract： Microspore culture is an important way to create haploids and diploids， which is of great significance for improving the breeding efficiency of safflower. In order to study the efficient culture system of isolated microspores in safflower， factors affecting callus growth and embryogenesis in anther and microspore culture were studied through 20 genotypes. Results showed that the stage of microspore development， safflower varieties， culture medium， hormones concentrations were the key factors affecting microspore embryoid induction in safflower. The callus and embryo induction rates of anther culture were higher than those of isolated microspores， and were affected by genotypes. When the fruit diameter of late uninucleate microspore was 1.00 to 1.96 cm and the length of tube flower was 0.45 to 0.50 cm， the induction success rate reached 68.32%. Callus tissues were successfully induced in 11 out of 20 genotypes， embryoid callus was developed in one safflower genotype and the induction success rate was 15.79%. The optimal differentiation medium combination was 1/2 MS plus B5 plus 1.0 mg/L 6-BA plus 1.0 mg/L NAA. The optimal medium for microspore suspension culture was 4 mg/L 6-BA plus 0.5 mg/L NAA which had the callus induction rate of 22.5%.

Key words： Safflower; Anther; Microspore; Callus

紅花（Carthamus tinctorius L.），別名刺紅花，菊科紅花屬植物，具有特異香氣，在我國(guó)主產(chǎn)地為河南、湖南、四川、新疆、西藏等省區(qū)。紅花幼苗可食用，成熟紅花絲含有豐富的紅色素、黃色素，具有活血化瘀的功效，其中黃色素對(duì)于治療老年H型高血壓效果良好，可改善患者的HRV，并抑制左室舒張功能減低，其機(jī)制可能與抗炎、抗氧化應(yīng)激、保護(hù)血管內(nèi)皮功能及抗血液高凝狀態(tài)有關(guān)，且聯(lián)合二甲雙胍治療早期DN能夠有效改善患者免疫功能和生活質(zhì)量［1 - 2 ］。此外它還是一種天然的染料［3 ］。紅花種子可用作榨油，食用紅花油可以降低膽固醇，還可以加工成人造奶油、色拉醬等，是一種很好的食用油脂［4 ］。

由于培養(yǎng)一個(gè)新品種不僅耗時(shí)長(zhǎng)，還需大量的人力和物力，嚴(yán)重制約了紅花良種育種及其在生產(chǎn)科研上的進(jìn)一步利用。游離小孢子的培養(yǎng)是紅花獲得單倍體植株的重要途徑之一，通過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)能生成純合的二倍體植株，即可加快紅花遺傳改良，也為紅花的苗木繁育、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和形態(tài)發(fā)生學(xué)等研究提供穩(wěn)定的材料。研究者最初從油菜的小孢子培養(yǎng)中獲得小孢子植株? ? 后［5 ］，小孢子培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展迅速，陸續(xù)在白菜類(lèi)、辣椒、蘿卜、蕓薹屬蔬菜、大麥等作物中廣泛應(yīng)用并獲得成功［6 - 10 ］，但花藥和小孢子培養(yǎng)技術(shù)在紅花中未見(jiàn)報(bào)道。我們借鑒其他植物花藥和小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系，通過(guò)對(duì)不同小孢子發(fā)育時(shí)期、不同品系的紅花以及培養(yǎng)基條件進(jìn)行探索，以期獲得紅花胚狀體，為獲得紅花培養(yǎng)單倍體植株提供技術(shù)支撐。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗(yàn)材料

選用不同類(lèi)型和來(lái)源的20份紅花材料（表1），其中C01～C04為河南省衛(wèi)紅花農(nóng)家種變異株系，C05～C08為云南紅花農(nóng)家種變異株系，C09～C12為新疆紅花農(nóng)家種變異株系，C13～C16為四川紅花農(nóng)家種變異株系，C17～C20為印度紅花種質(zhì)選系。供試材料種植于河南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)研究基地，7：00 — 9：00時(shí)分批采集現(xiàn)蕾5～7 d的帶莖紅花花苞，插入清水中備用。

1.2? ?試驗(yàn)方法

1.2.1? ? 預(yù)處理? ? 為提高胚狀體的誘導(dǎo)率，需對(duì)紅花花苞進(jìn)行預(yù)處理。將取回的紅花花苞置4 ℃冰箱低溫處理24 h。用自來(lái)水沖洗干凈，在超凈工作臺(tái)環(huán)境下用70%乙醇滅菌1 min，10%次氯酸鈉滅菌5 min，無(wú)菌水沖洗5～6次，用吸水紙吸干水分。

1.2.2? ? 篩選紅花小孢子最佳發(fā)育時(shí)期? ? 根據(jù)許蘭杰等［11 ］的方法，選取不同的紅花小孢子發(fā)育時(shí)期，分別為四分體期、單核早中期、單核靠邊期、雙核期。在MS固體培養(yǎng)基中測(cè)試愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.3? ? 小孢子分離純化? ? 選取易產(chǎn)生愈傷組織的材料C02、C09，各選取30個(gè)花蕾。經(jīng)預(yù)處理后的花蕾，取出花絲置于玻璃管中，加入MS+蔗糖60 g/L（未加激素和瓊脂）液體培養(yǎng)基1 mL。用玻璃棒研磨使之小孢子散出，導(dǎo)入過(guò)濾器過(guò)濾，將濾液盛入10 mL離心管，放入1 000 r/min離心機(jī)離心3 min，棄上清液，加入懸浮培養(yǎng)液使沉淀的小孢子再次懸浮后，再次放入1 000 r/min離心機(jī)離心3 min，重復(fù)3次。

1.2.4? ? 小孢子培養(yǎng)? ? 將沉淀的小孢子分別轉(zhuǎn)移至含有6-BA、IAA不同濃度的懸浮培養(yǎng)液培養(yǎng)皿中，按正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在24 ℃溫度下黑暗培養(yǎng)，形成愈傷組織后轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上，置于22 ℃、10 000 lx光照16 h、黑暗8 h下繼代培養(yǎng)14 d。每激素處理40個(gè)花蕾。

1.2.5? ? 花藥培養(yǎng)? ? 將處理過(guò)的紅花花苞用無(wú)菌鑷子去掉外層苞片，剝開(kāi)花絲取出花藥，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+ NAA 1 mg/L + 6-BA 1.0 mg/L + KT 2 mg/L + Agar（瓊脂粉） 5 g/L內(nèi)， 3次重復(fù)，每個(gè)100 mm×20 mm培養(yǎng)皿接種4個(gè)花蕾的花藥。接種后，將培養(yǎng)皿置于溫度24 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2 d，再轉(zhuǎn)入22 ℃、 10 000 lx光照16 h、黑暗8 h下誘導(dǎo)愈傷組織。長(zhǎng)出愈傷組織后轉(zhuǎn)移至10種分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。

愈傷組織誘導(dǎo)率=（產(chǎn)生愈傷組織的花藥數(shù)/接種花藥數(shù)）×100%，

胚狀體誘導(dǎo)率=（胚狀體數(shù)/接種花藥總數(shù)）×100%。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?不同發(fā)育時(shí)期的小孢子誘導(dǎo)效果

不同發(fā)育時(shí)期的小孢子，愈傷組織誘導(dǎo)效果不同（表2）。四分體時(shí)期（管狀花長(zhǎng)度為 0.20～0.40 cm）的誘導(dǎo)率為1.67%，單核早中期（管狀花長(zhǎng)度為 0.42～0.45 cm）的誘導(dǎo)率為6.11%，單核靠邊期（管狀花長(zhǎng)度為0.45～ 0.50 cm）的誘導(dǎo)率為37.22%，雙核期（管狀花長(zhǎng)度為 0.60～0.90 cm）的誘導(dǎo)率為17.78%。由此可見(jiàn)，單核靠邊期是花藥誘導(dǎo)愈傷的最佳時(shí)期，這一結(jié)果與對(duì)多數(shù)植物小孢子誘導(dǎo)的研究結(jié)果一致［12 - 14 ］。紅花小孢子單核靠邊期長(zhǎng)出的愈傷組織堅(jiān)硬、綠色、長(zhǎng)勢(shì)較好（圖1），因此，在小孢子懸浮培養(yǎng)中，單核靠邊期均為誘導(dǎo)愈傷最適宜的時(shí)期。直接選取管狀花長(zhǎng)度為 0.5 cm的花藥進(jìn)行組織培養(yǎng)，可節(jié)約選材時(shí)間。

2.2? ?不同紅花材料花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)效果

花藥和小孢子在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中約培養(yǎng)7 d，可見(jiàn)透明水珠狀膨大的愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)至14～20 d，愈傷組織顏色由透明逐漸變成乳白色。轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基14 d后愈傷組織變綠，不同品種的花藥和小孢子，其培養(yǎng)效果不同。20份供試紅花材料中，有13份誘導(dǎo)出愈傷組織，分別為C01、C02、C04、C05、C08、C09、C10、C12、C14、C15、C19，其中C02、C09愈傷誘導(dǎo)率較高，分別為63.33%、57.67%。由此可見(jiàn)，在相同的培養(yǎng)條件下，不同材料的花藥愈傷誘導(dǎo)率受基因型的影響較大（表3）。

2.3? ?不同激素配比對(duì)紅花小孢子誘導(dǎo)率的影響

由表4可知，供試材料經(jīng)過(guò)不同激素不同濃度配比處理后，愈傷誘導(dǎo)率為2.5%～22.5%，產(chǎn)生的愈傷組織為淡綠色，松散。7號(hào)培養(yǎng)基（MS+ 6-BA 4 mg/L + NAA 0.5 mg/L）中，C02、C09等2份材料愈傷誘導(dǎo)率最高，為22.5%，其他處理愈傷誘導(dǎo)率均較低。7號(hào)培養(yǎng)基的激素配比為紅花小孢子培養(yǎng)愈傷組織的最佳濃度。

2.4? ?不同材料的胚狀體分化效果

以11份紅花材料誘導(dǎo)出的愈傷組織分別轉(zhuǎn)移至10種分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)胚狀體，均出現(xiàn)不同顏色的膨大組織（表5），其中在10號(hào)分化培養(yǎng)基組合1/2MS+B5+6-BA 1.0 mg/L + NAA 1.0 mg/L中 ，紅花材料C02愈傷組織為深綠色，且長(zhǎng)勢(shì)較好，能誘導(dǎo)出胚狀愈傷，接種19個(gè)愈傷出現(xiàn)3個(gè)胚狀體（圖2），誘導(dǎo)率為15.79%（表6）。初步判斷1/2MS培養(yǎng)基較有其他培養(yǎng)基更易誘導(dǎo)出胚狀愈傷，組合10為誘導(dǎo)紅花花藥胚狀體較佳組合。小孢子的液體培養(yǎng)基雖然能誘導(dǎo)出愈傷組織，但在10種分化培養(yǎng)基中并未獲得胚狀體，其誘導(dǎo)率為0。可見(jiàn)紅花小孢子分化培養(yǎng)與花藥分化培養(yǎng)的原理可能不同，這有待進(jìn)一步探索。

3? ?討論與結(jié)論

花藥和小孢子培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)在育種中得到廣泛應(yīng)用。賈俊香通過(guò)白菜小孢子培養(yǎng)獲得了多頭、葉色油亮純和的菜心DH系203份，其植株分蘗力強(qiáng)，產(chǎn)量高，抗病能力增強(qiáng)［15 ］。有學(xué)者利用小孢子培養(yǎng)的DH群體獲得了甘藍(lán)枯萎病候選基因，并對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)，促進(jìn)了抗枯萎甘藍(lán)新品種選育進(jìn)程［16 ］。譚舒心等［17 ］首次開(kāi)展了白菜小孢子超低溫凍存研究，建立了白菜小孢子超低溫凍存復(fù)蘇體系，使小孢子供體植株不受生長(zhǎng)季節(jié)、生長(zhǎng)期影響，可長(zhǎng)期持續(xù)的獲取高生活力的白菜小孢子。

花粉和小孢子培養(yǎng)誘導(dǎo)出胚受多種因素影響。小孢子的發(fā)育時(shí)期是影響小孢子培養(yǎng)的一個(gè)關(guān)鍵因素，并不是整個(gè)的發(fā)育期都可以培養(yǎng)，在許多作物中，以小孢子單核靠邊期至雙核初期誘導(dǎo)胚狀體為最佳［18 - 20 ］。研究發(fā)現(xiàn)，小孢子的每個(gè)發(fā)育時(shí)期與花器官外部形態(tài)極為相關(guān)，針對(duì)不同的作物可根據(jù)花器官形態(tài)特征來(lái)判斷小孢子的發(fā)育時(shí)期［11， 21 ］。本研究發(fā)現(xiàn)，紅花誘導(dǎo)愈傷最佳時(shí)期為小孢子單核靠邊期。同一品種不同的變異株系之間愈傷組織及胚狀體的誘導(dǎo)率相差很大，大多研究中都是只有一部分組織獲得了胚狀體［22 - 23 ］。也有材料全部培養(yǎng)出胚狀體，如在青梗菜游離小孢子培養(yǎng)中，10個(gè)品種全部獲得了胚狀體，但基因型不同其胚胎的發(fā)生能力差異很大［24 ］，所以合適基因型的選擇也是花藥和小孢子培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素?；A(chǔ)培養(yǎng)基只有配合使用適當(dāng)濃度的激素才能誘導(dǎo)愈傷組織的生長(zhǎng)以及胚狀體的分化，不同物種需要的激素組合有差別。在瓜類(lèi)中被認(rèn)為6-BA配合2，4-D和KT效果最佳［25 ］，蕓薹屬中常用的激素組合為NAA和6-BA［26 - 27 ］，除此之外，在小麥和水稻小孢子上的研究表明麥芽糖、2，4-D和 PEG 濃度會(huì)對(duì)愈傷組織率和綠苗分化率產(chǎn)生影響［28 - 30 ］。小孢子胚狀體的產(chǎn)生受多種因素的影響。有研究者對(duì)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行4 ℃冷處理、熱激處理后發(fā)現(xiàn)，小孢子的出胚率均有明顯的提高［31 - 33 ］。此外，除了加入植物激素，研究人員通常會(huì)在培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭提高胚狀體的產(chǎn)生［34 - 36 ］。這些因素是否有利于誘導(dǎo)紅花小孢子產(chǎn)生胚狀體有待進(jìn)一步研究。

研究結(jié)果表明，小孢子發(fā)育時(shí)期、紅花品種、基本培養(yǎng)基和激素濃度是影響紅花誘導(dǎo)愈傷組織的關(guān)鍵因素?；ㄋ幣囵B(yǎng)的愈傷及胚誘導(dǎo)率高于游離小孢子，且受基因型影響。單核靠邊期管狀花長(zhǎng)度為 0.45～0.50 cm時(shí)誘導(dǎo)成功率達(dá)到68.32%。供試的20份紅花材料中，有11個(gè)誘導(dǎo)出了愈傷組織，僅C02分化出了胚狀愈傷，誘導(dǎo)成功率為15.79%。分化培養(yǎng)最適分化培養(yǎng)基組合為1/2 MS+B5+ 6-BA 1.0 mg/L + NAA 1.0 mg/L；小孢子懸浮培養(yǎng)最適培養(yǎng)基激素濃度以添加6-BA 4.0 mg/L 和NAA 0.5 mg/L效果最好，誘導(dǎo)愈傷率為22.5%。

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