周 猛，洪 惠，羅永康，譚雨青

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

鱘（Acipenser sinensis）又稱鱘龍，是現(xiàn)存歷史最久遠(yuǎn)的魚類之一，2020 年中國(guó)鱘魚總產(chǎn)量達(dá)104 280 t[1]。鱘魚肉質(zhì)鮮美，蛋白質(zhì)豐富，無(wú)肌間刺和硬骨，冷凍及加工制品也便于運(yùn)輸，因此冷凍鱘魚及鱘魚加工制品的消費(fèi)群體尤為龐大。目前已嘗試以產(chǎn)籽鱘魚肉為原料進(jìn)行魚糜制品加工[2]，但鱘魚魚糜制品凝膠強(qiáng)度低的問(wèn)題亟待解決[3]。在魚糜制品加工中，原料種類、加熱條件、擂潰條件及內(nèi)源酶等均影響魚糜凝膠性能[4]，而內(nèi)源酶是極為重要的因素之一[5]。魚糜加工過(guò)程中，通過(guò)漂洗可有效提高鱘魚魚糜凝膠的凝膠性能[6]。但漂洗魚糜在50～60 ℃的升溫過(guò)程中依然出現(xiàn)凝膠劣化現(xiàn)象。

耐熱型且不易在漂洗過(guò)程中除去的肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶（Myofibril-bound serine proteinase，MBSP）是導(dǎo)致魚糜凝膠劣化的關(guān)鍵內(nèi)源酶[7]。研究表明，當(dāng)鱷蛇鯔（Saurida wanieso）肌原纖維蛋白與其MBSP在55～60 ℃下孵育時(shí)，肌球蛋白重鏈降解最為明顯[8]，鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）肌原纖維蛋白與其MBSP 孵育的最適降解溫度是50～60 ℃[7]。金線魚（Nemipterus virgatus）魚糜經(jīng)過(guò)6 次漂洗后MBSP 活力仍無(wú)顯著降低[9]。即使在冷凍鱷蛇鯔魚糜中，MBSP穩(wěn)定性仍很高，因此MBSP 對(duì)冷凍魚糜的品質(zhì)也造成巨大影響[10]，但目前對(duì)于鱘魚MBSP的研究較少。筆者研究鱘魚內(nèi)源絲氨酸蛋白酶對(duì)肌原纖維蛋白凝膠性的影響與作用機(jī)制，為鱘魚魚糜加工及其品質(zhì)提升提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活鱘魚購(gòu)自北京健翔橋農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。3 種蛋白酶抑制劑：絲氨酸蛋白酶抑制劑，4-(2-氨基乙基)-苯-磺酰氟（Pefabloc SC）；半胱氨酸蛋白酶抑制劑，E-64（L-trans-3-Carbo xyoxiran-2-carbonyl-L-leucylagmatine）、Pepstatin A(N-(3-methyl-1-oxobutyl)-L-valyl-L-valyl-(3S,4S)-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptanoyl-N-[(1S)-1-[(1S)-2-carboxy-1-hydroxyethyl]-3-methylbutyl]-Lalaninamide)；金屬蛋白酶抑制劑，乙二胺四乙酸（EDTA）。Pefabloc SC 購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，E-64、Pepstatin A、EDTA 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，所有抑制劑均溶解在0.6 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl 的緩沖液(pH 8.0)中。7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）、Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，Boc-Leu-Arg-Arg-MCA 購(gòu)自Peptide Inst，溴化鉀購(gòu)自阿拉丁試劑（上海）有限公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UV-2600 紫外分光光度計(jì)（上海美普達(dá)儀器有限公司）；F97pro 熒光分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）；Frontier傅里葉紅外光譜儀（帕金埃爾默股份有限公司）；TA DHR-2 流變儀[美國(guó)TA 儀器沃特世科技（上海）有限公司]。

1.3 蛋白酶抑制劑對(duì)蛋白質(zhì)降解的影響與粗酶制備

1.3.1 肌原纖維蛋白（Myofibrillar protein,MP）制備 根據(jù)曹敏杰等[11]方法并稍作調(diào)整，取魚肉，按質(zhì)量（g）體積（mL）比1∶4 加入20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，在10 000 r/min 速度下均漿1 min，在4 ℃、8 000g條件下離心15 min，轉(zhuǎn)速，收集沉淀。重復(fù)上述操作3 次后，所得沉淀按質(zhì)量（g）體積（mL）比1∶4 加入0.6 mol/L NaCl 的20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）溶解，進(jìn)一步均質(zhì)，得鱘魚MP 溶液。所有實(shí)驗(yàn)步驟如無(wú)特殊要求均在4 ℃下完成。

1.3.2 蛋白酶抑制劑對(duì)蛋白降解的影響 抑制劑濃度選擇：根據(jù)不同抑制劑選擇有效抑制濃度范圍內(nèi)最高濃度與最低濃度[12]，E64中間加設(shè)10 mmol/L的濃度梯度，即Pefabloc SC，0.4、4.0 mmol/L；EDTA，1、10 mmol/L；E64，1、10、100 μmol/L；Pepstatin A，1、10 μmol/L。

實(shí)驗(yàn)方法：根據(jù)Takahashi 等[12]方法并稍作調(diào)整。取MP 溶液2 mL，分別與2 mL 不同濃度的3 種蛋白酶抑制劑溶液充分混合。將混合物在55 ℃水浴鍋中分別孵育2、4 h，立即在冰水中冷卻，與1 mL 150 mg/mL 預(yù)冷的三氯乙酸（TCA）混合，在冰水中放置30 min，離心（10 000g，4 ℃，15 min）。上清液中的TCA 可溶性肽含量通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，抑制率（%）計(jì)算：

式中，ρI為含蛋白酶抑制劑的加熱樣品上清液中TCA 可溶性肽質(zhì)量濃度（mg/mL）；ρC為不含蛋白酶抑制劑的加熱樣品上清液中TCA 可溶性肽質(zhì)量濃度（mg/mL）；ρB為不含蛋白酶抑制劑的未加熱樣品上清液中TCA可溶性肽質(zhì)量濃度（mg/mL）。

1.3.3 鱘魚內(nèi)源絲氨酸蛋白酶粗酶制備 根據(jù)Cao等[13]方法并稍作修改，取魚肉，按質(zhì)量（g）體積（mL）比1∶4 加入20 mmol/L Tri-HCl（pH 8.0），均漿1 min，在8 000g下離心20 min。取沉淀，按質(zhì)量（g）體積（mL）比1∶4加入去離子水，均質(zhì)，用1 mol/L HCl將均漿液pH調(diào)至6.0，離心，取沉淀，上述操作重復(fù)3次，以從MP中洗脫肌漿酶（收集洗脫4次的上清液，即為漂洗液）。按質(zhì)量（g）體積（mL）比1∶4加入去離子水，均質(zhì)，將勻漿液在沸水浴中加熱并攪拌，溫度達(dá)到55 ℃5 min 后迅速冷卻，離心，取最終的上清液并凍干。用去離子水溶解3 g凍干粉，定容至1 mL并均質(zhì)，用1 mol/L HCl調(diào)pH至4.0。離心，取上清液，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，得粗鱘魚內(nèi)源絲氨酸蛋白酶。

1.3.4 絲氨酸蛋白酶活力測(cè)定 以1.3.3 中4 次漂洗液、粗酶液以及粗酶液與Pefabloc SC 混合樣品為樣，Boc-Leu-Arg-Arg-MCA 為底物。在850 μL 50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）中，添加50 μL 樣品、100 μL 10 mmol/L底物，在55 ℃下反應(yīng)20 min，加入1.5 mL 終止劑（甲醇、正丁醇、去離子水體積比為35∶30∶35）停止反應(yīng)。用熒光分光光度計(jì)在380 nm激發(fā)波長(zhǎng)和450 nm 發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)量釋放的AMC熒光強(qiáng)度。酶活力定義為每min釋放0.1 nmol/L AMC的酶量為1單位（U）。

1.4 內(nèi)源絲氨酸蛋白酶對(duì)MP凝膠的影響

1.4.1 MP 凝膠制備 1.3.1 中的均質(zhì)、離心步驟重復(fù)3次，取最終沉淀，分為對(duì)照組（C）、額外添加蛋白酶組（H），各組蛋白調(diào)到80 mg/mL。C 組：將MP 放入廚師機(jī)中4檔空斬1 min，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%加入NaCl，再擂潰9 min；H 組：在C 組的基礎(chǔ)上，加入鱘魚內(nèi)源絲氨酸蛋白酶粗酶液[m(MP)/V(粗酶液)=450 g/1 mL]。取擂潰后的MP 于50 mL 離心管，于1 000g條件下離心5 min 以排出空氣。在正常二段加熱（40 ℃30 min+90 ℃20 min）模式上，增設(shè)劣化二段加熱模式（55 ℃30 min+90 ℃20 min）。各組命名為：CC，正常加熱模式對(duì)照組；HC，正常加熱模式額外添加酶組；CM，劣化加熱模式對(duì)照組；HM，劣化加熱模式額外添加酶組。熱處理后迅速冰水浴降溫，置于2 ℃下24 h 后，分初始階段、第1 段加熱結(jié)束、第2段加熱結(jié)束3個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定以下指標(biāo)。

1.4.2 對(duì)MP 凝膠裂解水平的影響 以TCA 可溶性肽含量表征MP裂解程度，參照Benjakul等[14]方法測(cè)定TCA 可溶性肽含量并稍作修改。取1.0 g 樣品，加入5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液，均質(zhì)。于4 ℃、10 000g條件下離心10 min，取上清液，以考馬斯亮蘭法測(cè)蛋白濃度，結(jié)果表示為每克樣品的TCA可溶性肽質(zhì)量（mg/g）。

1.4.3 對(duì)MP 凝膠化學(xué)作用力的影響 參照Pérez-Mateos等[15]方法測(cè)定MP凝膠化學(xué)作用力。準(zhǔn)確稱取0.7 g 凝膠樣品，分別與7 mL 0.05 mol/L NaCl、0.6 mol/L NaCl、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L 尿素、0.6 mol/L NaC1+8 mol/L 尿素、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+0.05 mol/L β-巰基乙醇溶液混合（分別記為SA、SB、SC、SD、SE溶液），在10 000 r/min 條件下均質(zhì)1 min，在4 ℃條件下反應(yīng)1 h，在10 000g條件下離心15 min，取上清液，用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。化學(xué)作用力計(jì)算：

1.4.4 對(duì)MP 二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響 以傅里葉紅外光譜測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，測(cè)定條件參考柴智等[16]，將溴化鉀研磨細(xì)后，于120 ℃下烘干24 h。取2 mg 肌原纖維蛋白凍干粉與200 mg溴化鉀，研磨混合，壓片。利用PeakFit 軟件（v4.12）處理1 600～1 700 cm-1的圖譜，根據(jù)各子峰積分面積及其對(duì)應(yīng)關(guān)系計(jì)算蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量（%）。

1.4.5 對(duì)MP 儲(chǔ)能模量的影響 通過(guò)流變特性實(shí)驗(yàn)測(cè)定儲(chǔ)能模量（G＇），測(cè)定方法參照姜鵬飛等[17]并稍作修改。樣品蛋白質(zhì)量濃度為80 mg/mL，夾具直徑為40 mm，平板間距1.0 mm，在夾具周圍滴加二甲基硅油。采用變溫掃描，正常二段加熱模式設(shè)置溫度從25 ℃升至40 ℃，在40 ℃保持30 min，再?gòu)?0 ℃升至90 ℃，在90 ℃保持20 min；劣化二段加熱模式設(shè)置溫度從25 ℃升至55 ℃，在55 ℃保持30 min，再?gòu)?5 ℃升至90 ℃，在90 ℃保持20 min。升溫速率均為1 ℃/min。

1.4.6 對(duì)凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響 參考Zhou 等[18]方法并稍作修改，將凝膠（5 mm×5 mm×1 mm）在體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛中固定24 h，依次在體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、80%、90%的乙醇中脫水15 min。用100%乙醇脫水2 次，每次10 min。將樣品置于真空干燥器中干燥12 h。將干燥后的樣品噴金后，置于場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡下觀察魚糜凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 23.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），通過(guò)Duncan法分析差異的顯著性，置信區(qū)間為95%（P＜0.05）。所有圖表均用GraphPad Prism 8軟件繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 引起鱘魚MP降解的主要蛋白酶分析

蛋白凝膠加熱時(shí)會(huì)經(jīng)過(guò)凝膠化、凝膠劣化和魚糕化3 個(gè)過(guò)程，而引起凝膠性能下降的主要集中凝膠劣化階段（55～70 ℃）[19]。通過(guò)漂洗等手段可去除魚肉中大部分肌漿酶，降低肌漿蛋白酶對(duì)凝膠性能的影響，但即使經(jīng)過(guò)6次漂洗，依然存在凝膠劣化現(xiàn)象[9]，引起凝膠劣化的原因可能與MP中結(jié)合的某種蛋白酶有關(guān)。

由表1 可見(jiàn)，各處理組中，低、高濃度的絲氨酸蛋白酶特異性抑制劑Pefabloc SC 對(duì)鱘魚MP 在55 ℃降解的抑制率均高于其他3 類抑制劑，而金屬蛋白酶抑制劑EDTA 也有一定的抑制效果。依據(jù)Cao 等[20]的研究，魚類骨骼肌中存在肌原纖維蛋白MBSP，且活力最適溫度條件約為55 ℃，其活力可隨Ca2+或Mg2+的額外加入而提升，亦可因EDTA 加入而被部分抑制。因此，絲氨酸蛋白酶是引起鱘魚MP在55 ℃降解的主要作用酶。

表1 在不同濃度和加熱條件下不同類型蛋白酶抑制劑對(duì)粗酶的抑制率Table 1 Inhibition rate of different types of protease inhibitors on the crude enzyme derived from Sturgeon under different concentrations and heating conditions

2.2 絲氨酸蛋白酶活力分析

經(jīng)過(guò)4 次漂洗，大部分肌漿絲氨酸蛋白酶已去除（表2）。經(jīng)過(guò)加熱、離心、凍干等步驟，絲氨酸蛋白酶最終為肌原纖維蛋白MBSP，每mg蛋白的粗酶活力為0.012 U。將Pefabloc SC 加入粗酶中，加入0.4 mmol/L Pefabloc SC 的酶活力為0.000 14 U/mL，加入4 mmol/L Pefabloc SC的酶活力為0 U/mL。

表2 漂洗液中絲氨酸蛋白酶活力Table 2 Serine proteinase activity of liquid for bleaching

2.3 內(nèi)源絲氨酸蛋白酶對(duì)鱘魚MP裂解水平的影響

TCA-可溶性肽含量是魚糜凝膠中小分子蛋白含量，反映蛋白質(zhì)在內(nèi)源性蛋白酶作用下的降解程度，與蛋白質(zhì)降解程度呈正相關(guān)[21]。表3 是凝膠形成過(guò)程中，TCA-可溶性肽含量變化。在第1 段加熱過(guò)程中，HC組TCA-可溶性肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)從1.26 mg/g增加到1.88 mg/g，而HM組則從1.26 mg/g 增加到3.15 mg/g，存在顯著差異（P ＜0.05），到第2 段加熱階段，HC組TCA-可溶性肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加0.83 mg/g，而HM組則增加1.00 mg/g。相比對(duì)照組，額外添加內(nèi)源絲氨酸蛋白酶組在正常加熱模式和劣化加熱模式下，隨著蛋白凝膠的形成，TCA-可溶性肽顯著上升（P ＜0.05），主要與額外添加MBSP降解MP有關(guān)。

表3 各組魚糜凝膠的三氯乙酸可溶性肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 3 TCA-soluble protein mass fraction of each surimi-gel group mg/g

2.4 內(nèi)源絲氨酸蛋白酶對(duì)鱘魚MP化學(xué)作用力的影響

維持蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的化學(xué)作用力主要為離子鍵、氫鍵、二硫鍵作用，疏水相互作用[22]，凝膠在加熱的過(guò)程中各化學(xué)作用力的變化，可能導(dǎo)致凝膠性能變化。圖1 是MP 凝膠加熱過(guò)程中離子鍵、氫鍵、二硫鍵作用及疏水相互作用的變化。

圖1(A)可見(jiàn)，初始階段，CC與CM組離子鍵為8.57 mg/mL，HC與HM組為10.74 mg/mL，表明離子鍵作用為維持蛋白結(jié)構(gòu)的主要作用力，占比最大；至第1 段加熱結(jié)束，各組離子鍵比例迅速下降（P ＜0.05），這是因?yàn)殡S著溫度的上升，疏水相互作用的增加，導(dǎo)致離子鍵斷裂[23]。

圖1(B)可見(jiàn)，與其他3 組氫鍵逐漸下降趨勢(shì)不同，HC組氫鍵初始為1.21 mg/mL，經(jīng)過(guò)40 ℃加熱30 min后增加至3.91 mg/mL，差異顯著（P ＜0.05），第2段加熱結(jié)束后方降至0.49 mg/mL（P ＜0.05），可能與額外添加的粗酶有關(guān)，該條件的凝膠形成過(guò)程中，額外添加的粗酶阻止了蛋白質(zhì)分子分散，氫鍵雖在蛋白質(zhì)受熱變性時(shí)發(fā)生斷裂，但在魚糜凝膠冷卻后會(huì)重新形成[19]。

在凝膠加熱的過(guò)程中，疏水氨基酸的暴露導(dǎo)致疏水相互作用快速增加。圖1(C)表明，在第1 段加熱結(jié)束后，CC、CM、HM組疏水相互作用增加（P ＜0.05），而HC組疏水相互作用力從2.24 mg/mL 僅增至2.50 mg/mL，差異不顯著（P ＞0.05），這是由蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)未完全暴露出來(lái)所致；HM組雖同樣添加了額外的粗酶，但較高的溫度會(huì)導(dǎo)致更多的疏水基團(tuán)暴露，疏水相互作用力從2.24 mg/mL 增至5.61 mg/mL，這也是與HC組存在顯著差異（P ＜0.05）的原因之一。由于MBSP 最適溫度在55～60 ℃，屬于耐熱型蛋白酶[8]，在此條件下，蛋白酶可降解部分蛋白，使更多的疏水性基團(tuán)暴露出來(lái)，這也與表3結(jié)果相一致。

圖1 加熱過(guò)程中化學(xué)鍵含量變化Fig.1 Change of chemical bond content during heating

圖1(D)表明，各組在加熱過(guò)程中，隨著加熱溫度的提升，二硫鍵作用增加（P ＜0.05），但相同加熱模式的2 組之間差異不顯著（P ＞0.05）。這是因?yàn)槎蜴I作用為主要的共價(jià)作用力，主要與溫度有關(guān)[4]，更高的溫度促使二硫鍵的形成，而粗酶的添加對(duì)二硫鍵形成無(wú)顯著作用。

2.5 內(nèi)源絲氨酸蛋白酶對(duì)鱘魚MP二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

光譜中吸收最強(qiáng)的區(qū)域?yàn)轷０稩區(qū)（1 600～1 700 cm-1）[24]，這是蛋白質(zhì)肽鍵的特征振動(dòng)模式之一，可定量分析而獲得各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。圖2可見(jiàn)，初始階段各組α-螺旋含量偏低，這是由添加NaCl和擂潰作用所致[4]，在加熱過(guò)程中，H組相比C 組的α-螺旋結(jié)構(gòu)破壞更為明顯，HC、HM組α-螺旋比例分別從13.7% 降至10.7%，從13.7% 降至10.5%，而CM、CM組則分別從13.9%降至12.7%，從13.9%降至11.7%。凝膠形成的過(guò)程中，主要支撐天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的α-螺旋結(jié)構(gòu)遭到破壞，含量逐漸減少，這與袁凱等[25]研究結(jié)論相一致。

圖2 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化Fig.2 Secondary structure changes of proteins

在第1 段加熱后，CM、HM組的β-折疊含量相比于CC、HC組增加更為明顯，但HC組在第一段加熱結(jié)束β-折疊含量從22.6%增加到27.7%，而CC組則是從21.2%增加到25.0%。說(shuō)明溫度是β-折疊形成主要因素，較高的溫度會(huì)削弱氫鍵的相互作用，溫度導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、α-螺旋結(jié)構(gòu)解旋展開、β-折疊形成[26]，但內(nèi)源絲氨酸蛋白酶會(huì)在一定程度上促進(jìn)該過(guò)程。結(jié)合圖1 的結(jié)果，在第一段加熱結(jié)束后，HC、HM組維持凝膠結(jié)構(gòu)的非共價(jià)鍵氫鍵存在顯著差異（P ＜0.05），HC組氫鍵顯著高于HM組，但氫鍵主要存在于β-折疊部分，其形成主要受溫度影響，HC組在該階段下β-折疊含量卻低于HM組。所以造成HC組第1加熱階段結(jié)束后，氫鍵增加、疏水相互作用未明顯增加的原因，更可能是在40 ℃下，由于額外添加內(nèi)源絲氨酸蛋白酶降解了某些關(guān)鍵蛋白基團(tuán)，阻止蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，且凝膠冷卻后重新形成氫鍵。而在第2 加熱階段，相比HC組，HM組的疏水相互作用顯著增加（P ＜0.05），這是因?yàn)樵?5 ℃條件下，高溫使蛋白質(zhì)分子充分變性，大部分氫鍵遭到破壞，且在凝膠冷卻后不再重新生成，α-螺旋遭到破壞，疏水基團(tuán)暴露，疏水相互作用相比正常加熱模式組顯著增加（P ＜0.05）。

2.6 內(nèi)源絲氨酸蛋白酶對(duì)鱘魚MP儲(chǔ)能模量的影響

圖3(A、B)表明，隨著溫度從25 ℃上升到40 ℃，各組凝膠的G＇ 均迅速提高，在溫度40～55 ℃區(qū)間內(nèi)急速下降，而HC、HM組在60 ℃后的升溫過(guò)程中，G＇升高趨勢(shì)均分別低于CC、CM組，這可能與在第1段恒溫加熱時(shí)期有關(guān)。經(jīng)模擬凝膠二段式加熱過(guò)程，G＇從小到大依次為：HM（35 198 Pa）組、HC組（50 046 Pa）、CM組（65 100 Pa）、CC組（84 495 Pa）。圖3(C、D)表明，90 ℃恒溫加熱階段，HM組與HC的G＇相比于同種加熱模式下的CM組、CC組均增加緩慢。這是由于額外添加內(nèi)源絲氨酸蛋白酶在40 ℃恒溫加熱的條件下可能使部分關(guān)鍵蛋白降解[5]，肌球蛋白頭部與部分螺旋形尾部結(jié)構(gòu)相連的部分肽鏈解離不完全[27]，且包埋的疏水基團(tuán)未能完全暴露，導(dǎo)致在后續(xù)的升溫過(guò)程中，蛋白質(zhì)分子不夠分散，不能形成較好的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，G＇上升緩慢，降低了最終的凝膠流變性能。而在劣化加熱模式下，由于55 ℃加熱30 min 條件，使得MP 分子充分變性并伴隨著內(nèi)源絲氨酸蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)降解作用，使得H組與C組在55～75 ℃升溫區(qū)間內(nèi)相比于正常加熱模式，G＇增加緩慢，甚至HM組在此溫度區(qū)間內(nèi)G＇出現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖3 儲(chǔ)能模量（G＇）變化Fig.3 Change of the stored modulus(G＇)

2.7 內(nèi)源絲氨酸蛋白酶對(duì)鱘魚MP 凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖4 表明，在正常加熱模式下，圖4(C)中孔徑比圖4(A)變大。這是由于MP 在加熱的過(guò)程中，初始時(shí)肌球蛋白頭部通過(guò)二硫鍵聚集，而在凝膠化的后續(xù)階段，則因肌球蛋白尾部的疏水相互作用而形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，達(dá)到凝膠形成的目的[19]。相比劣化加熱模式，正常加熱模式凝膠分子團(tuán)更大，且更為聚集。在兩種加熱模式下，蛋白酶粗酶的額外添加，均會(huì)導(dǎo)致凝膠結(jié)構(gòu)更為松散，三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)松散。

圖4 凝膠微觀結(jié)構(gòu)變化Fig.4 Microstructure of myofibrillar protein gels treated with different concentrations of endogenous serine protease

3 結(jié)論

鱘魚內(nèi)源絲氨酸蛋白酶引起肌原纖維蛋白在55 ℃條件下降解的主要蛋白酶，金屬蛋白酶對(duì)蛋白降解也有一定作用。在肌原纖維蛋白凝膠形成的過(guò)程中，由于內(nèi)源絲氨酸蛋白酶作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解。在凝膠化階段，伴隨疏水相互作用與氫鍵發(fā)生變化，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使得此階段中儲(chǔ)能模量增幅緩慢，最終導(dǎo)致凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)疏松。