李佩佩，何鵬飛，嚴忠雍，方 益

（浙江省海洋水產(chǎn)研究所水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全研究室/浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點實驗室，浙江 舟山 316021）

氨基糖苷類化合物(Aminoglycosides,AGs) 雖然有一定的耳毒性、腎毒性和神經(jīng)肌肉阻滯作用[1,2]，但其價格低廉，因此在臨床和獸藥領(lǐng)域應用廣泛，是一類廣譜抗菌劑和促生長的飼料添加劑[3,4]。目前多個國家和組織建立了AGs 在動物源性食品中的相關(guān)限量標準[5-6]。AGs 分子中因富含氨基和羥基而呈強極性，在反相色譜中的保留性差，分子中缺少發(fā)色團和熒光團，在常規(guī)檢測器上沒有響應，因此動物源食品中AGs 的定量檢測比其他抗生素更復雜。目前，對AGs 的檢測方法主要有免疫分析法[7～9]、毛細管電泳法[10～13]、液相色譜法(LC)[14,15]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[16～19]等。免疫分析法易出現(xiàn)假陽性，重復性差，更適合初步篩查和半定量分析；毛細管電泳法分離度和檢測靈敏度低，分離柱壽命短；液相色譜熒光或者紫外檢測法需柱前或柱后衍生，衍生物產(chǎn)量低和穩(wěn)定性差，導致方法重現(xiàn)性差；HPLC-MS/MS 法由于定性定量準確，靈敏度高、分析種類多等特點而得到廣泛應用。動物源食品中AGs 的分析種類從一種發(fā)展到最多可同時檢測20多種[20]。

當前的研究多集中于牛奶[20～24]、雞蛋[25,26]、牛雞羊豬組織[27～28]等畜禽動物源食品以及蜂蜜[29～31]，對于水產(chǎn)品中多種氨基糖苷類藥物同時檢測的研究并不多見[32]。本研究選擇壯觀霉素、潮霉素B、雙氫鏈霉素、鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、安普霉素、妥布霉素、慶大霉素、新霉素10種典型和應用較多的氨基糖苷類藥物為代表物質(zhì)，建立同時檢測水產(chǎn)品中10 種氨基糖苷類藥物的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法，為水產(chǎn)品中多種AGs 藥物的殘留監(jiān)管提供分析方案。

1 材料與方法

1.1 材料與主要儀器

壯觀霉素(Spectinomycin，SPEC，純度97.3%)，潮霉素B(Hygromycin B，HYGRO，純度93.5%)，雙氫鏈霉素(Dihydrostrepmycin，DHSTREP，純度97.7%)，鏈霉素 (Streptomycin，STREP，純度89.8%)，丁胺卡 那霉素(Amikacin，AMIK，純度89.7%)，卡那霉素 (Kanamycin，KANA，純度96.1%)，安普霉素(Apramycin，APRA，純度80.4%)，妥布霉素(Tobramycin，TOBRA，純度82.2%)，慶大霉素(Gentamycin，GEN，純度87.4%)，新霉素(Neomycin，NEO，純度76.6%)均購自德國Dr.Ehrenstorfer 公司。磷酸二氫鉀、乙二胺四乙酸二鈉、三氯乙酸、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純，購自上海國藥集團化試劑有限公司。甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，購自德國Merck 公司。實驗用水為Milli-Q 制備一級水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)。

AcquityTM超高效液相色譜儀(UPLC)、Quattro Premier XE 串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(美國Waters 公司)；MS3 型旋渦 混合器(德 國IKA 公 司)；Centrifuge 5810高速離心機（德國Eppendorf公司）；N-EVAP112氮吹儀（美國Organomation 公司）；24 通道固相萃取裝置(美國Supelco 公司)。Waters Oasis HLB 固相萃取柱（200 mg/6mL，美國Waters 公司）。ME204E/02電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；SL502N 電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 從市場上采集魚、蝦、蟹、貝等樣品，按照SC/T 3016-2004《水產(chǎn)品抽樣方法》處理后于-18 ℃密封保存。使用前先解凍。魚，去鱗、去皮，沿脊背取肌肉；蝦，去頭、去殼、去腸腺，取肌肉部分；鱉、蟹和貝類，取可食部分，切成不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊，混勻，充分勻漿，于-18 ℃以下冷凍保存，備用。

1.2.2 樣品前處理 稱取勻質(zhì)的樣品(2.0 ± 0.02 g)于50 mL 離心管，加入10 mL 10 mmol/L 磷酸二氫鉀緩沖溶液（磷酸二氫鉀1.36 g，乙二胺四乙酸二鈉0.15 g，三氯乙酸20.0 g，pH 4.0，定容至1 000 mL），渦旋振蕩提取5 min，以7 000 r/min離心5 min，取上清液至50 mL 離心管，殘渣用8 mL 10 mmol/L 磷酸二氫鉀緩沖溶液重復提取1 次，合并提取液，混勻，用10 和1.0 mol/L NaOH 調(diào)pH 值為6.8 ± 0.2，用水定容至20 mL，混勻，用快速濾紙過濾，待凈化。

HLB固相萃取柱預先用5 mL甲醇和5 mL水活化。準確吸取10 mL 提取液過柱，待樣液完全流出后，依次用5 mL水和5 mL體積分數(shù)5%的甲醇溶液淋洗，棄去全部流出液。擠干或者減壓抽干柱子，用5 mL 體積分數(shù)80%乙腈(含體積分數(shù)1%甲酸)洗脫。收集洗脫液于15 mL 離心管中，水浴氮吹濃縮至近干(溫度低于45 ℃)，用體積分數(shù)0.1%甲酸-乙腈(體積比2∶8)溶液定容至1.0 mL，經(jīng)0.22 μm 有機微孔濾膜過濾后供HPLC-MS/MS分析。

1.2.3 工作溶液配制及標準工作曲線制作 標準儲備溶液：稱取標準品5.00 mg，用甲醇溶解，定容至50.0 mL，按照各自硫酸鹽和純度計算得到質(zhì)量濃度約100 μg/mL的標準儲備液。

混合標準工作溶液：準確移取適量10種單標貯備液，用水定容至50 mL，配制成壯觀霉素、雙氫鏈霉素、鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素、慶大霉素分別為4.0 μg/mL，潮霉素B、安普霉素分別為10.0 μg/mL，新霉素為20.0 μg/mL 的混合標準溶液。

基質(zhì)匹配標準工作曲線：稱取6 份空白樣品于50 mL 離心管，按照樣品前處理方法處理后得到適量的復溶溶液，用0.22 μm 有機微孔濾膜過濾后代替流動相，分別移取適量的混合標準工作溶液，以過濾后的復溶液定容至1.0 mL，以各個濃度為橫坐標，各個濃度對應的質(zhì)譜響應值為縱坐標，制作基質(zhì)匹配工作曲線。

標準工作曲線：分別移取適量的混合標準工作溶液，用體積分數(shù)0.1%甲酸-乙腈（體積比2∶8）溶液定容至1.0 mL，以各個濃度為橫坐標，各個濃度對應的質(zhì)譜響應值為縱坐標，制作標準工作曲線。

在優(yōu)化的色譜質(zhì)譜儀器條件下，配制壯觀霉素、雙氫鏈霉素、鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素、慶大霉素質(zhì)量濃度為2、5、10、25、50、100 ng/mL，潮霉素B、安普霉素質(zhì)量濃度為5.0、12.5、25.0、62.5、125.0、50.0 ng/mL，新霉素質(zhì)量濃度為10、25、50、125、250、500 ng/mL 的基質(zhì)匹配標準工作溶液系列進UPLC-MS/MS 測定。以定量離子的峰面積對質(zhì)量濃度進行線性回歸，繪制標準曲線。

1.2.4 色譜及質(zhì)譜條件 色譜條件：SIELC Obelisc R 柱(100 mm ×2.1 mm,5 μm)；進樣量5 μL；樣品室溫度10 ℃，柱溫40 ℃；流動相A 為體積分數(shù)1%甲酸（含2 mmol/L 乙酸銨），B 為乙腈，梯度洗脫時流速為0.3 mL/min，程序如表1所示。

表1 10種氨基糖苷類藥物的色譜梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures of 10 kinds of AGs

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；正離子掃描(ESI+)模式掃描；多反應監(jiān)測(MRM) 方式；毛細管電壓：3.5 kV；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：380 ℃；錐孔氣為高純氮氣，流量：50 L/h；脫溶劑氣為高純氮氣，流量：600 L/h。

1.2.5 上樣液pH 值的確定 實驗考察pH 值不同的上樣液中10 種AGs 在HLB 柱上的保留情況，以回收率表示。取4.0 μg/mL 混合標準溶液500 μL 加入到4 mL 10 mmol/L 磷酸二氫鉀緩沖溶液中，渦旋混勻提取后，調(diào)節(jié)溶液pH 值分別為5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，然后將提取液全部過柱，采用相同淋洗條件淋洗，氮吹復溶過膜后進質(zhì)譜檢測10種AGs含量，計算回收率，每個pH值做3個平行。

1.2.6 洗脫液組成的確定 向10 mL 磷酸二氫鉀緩沖溶液中加入一定體積的混合標準溶液，調(diào)節(jié)pH值為6.8，全部過固相萃取柱，分別用體積分數(shù)80%乙腈溶液(含體積分數(shù)1%甲酸)、體積分數(shù)1%甲酸甲醇、體積分數(shù)80%甲醇溶液(含體積分數(shù)1%甲酸)等3 種不同洗脫液洗脫，氮吹至近干后用體積分數(shù)0.1%甲酸溶液-乙腈(體積比2∶8) 定容至1.0 mL。上機檢測比較10 種AGs 回收率，比較3 種洗脫液對10種AG的洗脫效果。

1.2.7 基質(zhì)效應的計算 分別選擇草魚（Ctenopharyngodon idella）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）作為空白樣品基質(zhì)，經(jīng)樣品前處理后，得到空白樣品基質(zhì)復溶液，用于配制魚、蝦和蟹類的基質(zhì)匹配工作溶液。將3種基質(zhì)匹配標準溶液和試劑標準工作溶液分別進行HPLC-MS/MS 分析，得到各組分的峰面積。以峰面積為縱坐標，標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線，采用基質(zhì)匹配工作曲線和試劑工作曲線的斜率差計算基質(zhì)效應。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件

AGs 化合物結(jié)構(gòu)中含有羥基，有強極性和親水性，樣品宜先用親水性有機溶劑或酸溶液脫蛋白和提取。三氯乙酸溶液、磷酸二氫鉀緩沖溶液、乙酸銨緩沖溶液是3 類常用的提取液[33]。AGs 的提取效率與其分子結(jié)構(gòu)中氨基官能團的數(shù)量有某種程度的反相關(guān)性，鄰近的氨基基團可與多電荷離子形成螯合物而降低提取效率[16]。因此，常需添加離子螯合劑乙二胺四乙酸二鈉，以抑制螯合物的形成，提高分析物提取效率。本研究采用含有乙二胺四乙酸二鈉的磷酸二氫鉀緩沖溶液進行提取。由于提取液中加入三氯乙酸，可有效沉淀蛋白，基本不會造成過柱堵塞現(xiàn)象。

AGs 提取液凈化時所用固相萃取柱主要有C18柱，HLB 柱，CBX、SCX、MCX、AmberliteIRC-50 等陽離子交換柱等，也會用專用性更強的分子印跡(MIP) 固相萃取柱[34]。其中HLB 柱更適于多種類AGs 凈化，通用性強，結(jié)果穩(wěn)定，且比MIP 的性價比高。本研究采用HLB 柱進行凈化，重點考察上樣液的pH 值和洗脫液的組成對水產(chǎn)品中10種AGs回收率的影響。

2.1.1 上樣液的pH 值 10 種氨基糖苷類分析物分子中分別含有不同數(shù)量的氨基和羥基，在不同pH值下每種分析物pKa值有多種，進而影響其在HLB柱上的保留。本研究表明，丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素、慶大霉素、新霉素在所測pH 值范圍內(nèi)回收率變化不大，均可達到在80%以上，其他5種AGs 的變化情況如圖1 所示。由圖1 可見，5 種AGs在pH 值6.0～7.0 時回收率變化幅度小，略有上升，且回收率均在70%以上。當pH 低于6.0 或大于7.0時，安普霉素、潮霉素和雙氫鏈霉素回收率變化幅度較大。因此，為保證10 種AGs 回收率均達較高，在固相萃取上樣前應將提取液的pH 值調(diào)節(jié)至6.6～7.0。先用10 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)，再用1 mol/L NaOH微調(diào)。

圖1 pH對水產(chǎn)品中5種氨基糖苷類藥物加標回收率的影響Fig.1 Effect of pH on recoveries of 5 AGs in aquatic products

2.1.2 洗脫液的組成 AGs極性強，洗脫液宜含有一定比例的水溶液，而非純有機相。結(jié)果顯示，采用體積分數(shù)1%甲酸甲醇洗脫后，壯觀霉素，妥布霉素和新霉素的回收率低于50%；體積分數(shù)80%甲醇溶液(含體積分數(shù)1%甲酸)洗脫后，壯觀霉素，妥布霉素和新霉素的回收率有所升高，大于60%，但是10種AGs 的回收率均在80%以下。10 種AGs 在體積分數(shù)80%乙腈溶液(含體積分數(shù)1%甲酸)洗脫液下回收率均可達80%以上。這與氨基糖苷類藥物本身的化學結(jié)構(gòu)和所帶基團以及乙腈的洗脫能力等多種因素相關(guān)。因此，選擇體積分數(shù)80%乙腈水溶液(含體積分數(shù)1%甲酸)作為洗脫液。

2.2 色譜條件優(yōu)化

AGs 分子結(jié)構(gòu)中含有氨基糖和氨基環(huán)醇，是一類強極性的堿性藥物，在常用的C18、C8等反相色譜柱上保留很弱，為實現(xiàn)液相色譜的有效保留和分離，一是在流動相中加入揮發(fā)性的七氟丁酸(HFBA)、三氟乙酸(TFA)、五氟丙酸(PFA)等離子對試劑，使其與AGs 結(jié)合，形成疏水型離子對，延長AGs 在反相色譜柱上的保留時間；二是直接用可保留AGs 的親水作用色譜柱(HILIC)。

HILIC 色譜柱的固定相種類很多，包括硅膠、氨基、氰基、氨基甲酸酯、磺酸甜菜堿型兩性離子以及其他的極性鍵合硅膠固定相[34-35]。由于AGs 的極性官能團可在硅膠表面上和硅羥基之間形成氫鍵或離子交換，傳統(tǒng)的裸硅膠柱對極性化合物有強烈的靜電吸附作用，從而導致AGs 峰太寬，峰形矮胖，有雙峰，不尖銳[36]。不同柱填料的親水作用色譜對于AGs 的吸附和分離效果有很大影響，兩性離子柱Obelisc R，ZIC-HILIC 在AGs 的分離效率和檢測靈敏度方面最佳[37-38]。

用C18為色譜柱時，離子對試劑會對質(zhì)譜離子源和色譜分離系統(tǒng)造成一定損害。為避免使用離子對試劑，選擇兩性離子柱Obelisc R 為分離柱，其在分離時可形成一“液態(tài)分離池”，實現(xiàn)在低濃度緩沖鹽條件下有效分離多種AGs。本研究比較體積分數(shù)1%甲酸溶液(含2 mmol/L 乙酸銨溶液)-乙腈、體積分數(shù)1%甲酸溶液(含2 mmol/L乙酸銨溶液)-體積分數(shù)1%甲酸乙腈) 和體積分數(shù)1%甲酸溶液-體積分數(shù)1%甲酸乙腈對10種AGs的分離效果。結(jié)果表明，乙腈中加入甲酸對于分離度無明顯提升，而乙酸銨的加入使新霉素和潮霉素B 的峰形變得更為尖銳、對稱。通過優(yōu)化梯度洗脫程序，所有分析物在6 min 內(nèi)完全出峰，10種分析物分離良好，峰形尖銳，響應值較高。

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

氨基糖苷類化合物的結(jié)構(gòu)中含有氨基環(huán)醇、羥基和伯胺或仲胺基團等，呈強極性和弱堿性，適合電噴霧正離子掃描模式。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表2，10種AGs的MRM圖見圖2。

圖2 質(zhì)量濃度為25.0 ng/mL 的10種AGs混合標準溶液的MRM圖Fig.2 MRM chromatograms of 10 kinds of AGs mixed standard solution with mass concentration of 25.0 ng/mL

表2 10種氨基糖苷類藥物的多反應監(jiān)測實驗條件Table 2 Conditions of multiple reaction monitoring for 10 kinds of AGs

2.4 基質(zhì)效應

氨基糖苷類化合物質(zhì)譜檢測時有較大的基質(zhì)效應，有必要考察10種AGs在不同種類水產(chǎn)品中的基質(zhì)效應。圖3 表明，在草魚、凡納濱對蝦中，10 種AGs 的基質(zhì)效應較為一致，蝦的基質(zhì)效應略低于魚；三疣梭子蟹的基質(zhì)效應低于魚和蝦。壯觀霉素、潮霉素B、卡那霉素的基質(zhì)效應較高。因此，水產(chǎn)品中AGs 含量測定時應制作空白基質(zhì)標準曲線以抵消基質(zhì)效應，且不同種類的水產(chǎn)品需分別制作對應空白基質(zhì)曲線，以更準確定量。

圖3 三類水產(chǎn)品中10種AGs藥物的基質(zhì)效應評價結(jié)果Fig.3 Matrix effect evaluation results of 10 AGs drugs in three types of aquatic product

2.5 線性范圍、檢出限和定量限

表3表明，壯觀霉素、雙氫鏈霉素、鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素、慶大霉素在2.0～100 ng/mL，潮霉素B、安普霉素在5.0～250 ng/mL，新霉素在10～500 ng/mL 范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.999，滿足儀器分析的需要。以信噪比（S/N）≥3 確定的檢出限，以S/N≥10 確定的定量限（Limit of quantification，LOQ）見表3。

表3 10種AGs的回歸方程、線性范圍、方法檢出限和定量限Table 3 Calibration equation,linear range,limit of detection(LOD)and limit of quantification(LOQ)for 10 kinds of AGs

2.6 方法回收率和精密度

為考察方法的準確度和精密度，以草魚、凡納濱對蝦和三疣梭子蟹樣品為空白基質(zhì)進行添加回收實驗，表4 表明，10 種AGs 藥物的平均回收率為74.8%～104.5%，相對標準偏差(RSD)為4.5%～12.6%，方法的精密度和準確度可滿足分析檢測要求。

表4 空白試樣添加回收率和精密度測定結(jié)果（n=6）Table 4 Results of recovery and precision of spiked samples

2.7 實際樣品檢測

為考察方法的適用性和實用性，選取2022 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全城市例行監(jiān)測和2022 年舟山市初級水產(chǎn)品質(zhì)量安全專項監(jiān)測任務的部分代表性樣品70 份，包括草魚（C.idella）、大黃魚Larimichthys crocea、黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）、烏鱧（Channa argus）、鱖（Siniperca）、凡納濱對蝦（L.vannameiBoone）、哈氏仿對蝦（Parapenaeopsis hardwickii）、中華管鞭蝦（Solenocera melantho）、梭子蟹（Portunus trituberculatus）等，采用本研究建立的方法測定10 種AGs 藥物的殘留量。檢測結(jié)果顯示以上水產(chǎn)品中不含10 種AGs 類藥物。

3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定水產(chǎn)品中10 種AGs 藥物的方法。通過選擇合適的固相萃取上樣液pH 和合適的洗脫液，可確保分析物的有效提取和富集，10種AGs藥物的平均回收率為74.8%～104.5%，相對標準偏差為4.5%～12.6%；通過選擇適宜的梯度洗脫條件，聯(lián)合色譜的高效分離和串聯(lián)質(zhì)譜的高選擇性，成功實現(xiàn)10種物質(zhì)的快速有效分離和準確定量。方法靈敏度高，回收率和精密度良好，適用于水產(chǎn)品中10種AGs藥物的同時測定。