何靜怡，舒騰云，蘇麗花，許 敏

（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500）

茵陳是中國(guó)傳統(tǒng)中藥中用于治療肝病的要藥，來(lái)源于菊科植物濱蒿Artemisia scoparia Waldst. et Kit.或茵陳蒿Artemisia capillaris Thunb. 的干燥地上部分。春季幼苗高6～10 cm 時(shí)采收或秋季花蕾長(zhǎng)成至花初開時(shí)采割，除去雜質(zhì)和老莖，曬干。春季采收的習(xí)稱“綿茵陳”，秋季采割的稱“花茵陳”[1]。茵陳味苦、辛，微寒。歸脾、胃、肝、膽經(jīng)。關(guān)于茵陳藥理活性的記載最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，謂其能除“熱結(jié)黃疸，久服輕身益氣耐老”。茵陳作為民間用于治療肝病單驗(yàn)方中使用頻次最多的中藥，中醫(yī)認(rèn)為其氣芳香，有清濕熱、退黃疸的功效，臨床上主要用來(lái)治療黃疸尿少、濕瘡瘙癢、黃疸型傳染性肝炎和肝內(nèi)膽汁淤積等癥狀[2-3]。

茵陳蒿作為抗肝病中藥茵陳的主要植物來(lái)源之一，除傳統(tǒng)的保肝利膽作用外，還具有抗炎抗病毒等多種功效，其藥理作用多樣，機(jī)制復(fù)雜[4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，茵陳蒿的藥理作用主要包括保肝[5-6]，利膽[7]，調(diào)脂降壓[8]，降血糖，抗動(dòng)脈粥樣硬化[9]，抗腫瘤[10-11]，抗氧化等。為闡明其活性成分，自20 世紀(jì)70年代以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行了大量研究，從中分離鑒定了香豆素[12]、黃酮[13]、烯炔類[14]、有機(jī)酸類化合物[15-16]等120 余個(gè)化合物，但是迄今為止依然無(wú)法解釋茵陳蒿作為治療肝病之要藥的科學(xué)依據(jù)，且現(xiàn)有文獻(xiàn)針對(duì)其萜類化合物的研究較少，缺乏對(duì)茵陳蒿中單體化合物抑制肝癌細(xì)胞活性的系統(tǒng)性研究。因此，為了進(jìn)一步研究茵陳蒿中化學(xué)成分及其藥理活性，探究中藥材茵陳蒿作為治療肝病之要藥的科學(xué)依據(jù)，該文應(yīng)用傳統(tǒng)的植物化學(xué)研究方法，對(duì)茵陳蒿的95%乙醇提取物中，萜類化合物含量最多的流份進(jìn)行了化學(xué)成分研究，經(jīng)分離純化共得到10 個(gè)單體化合物（圖1），分別鑒定為（R，Z）-deca-8-en-4，6-diyne-1，3-diol（1）；methyl（S）-8-（5-oxo-2，5-dihydrofuran-2-yl）octanoate（2）；gymnasterkoreayne A（3）；（S）-deca-4，6，8-triyne-1，3-diol（4）；dehydrovomifoliol（5）；loliolide（6）；（3S，5R，6S，7E）3，5，6-trihydroxy-7-megastigmen-9-one（7）；（6R，9R）-3-oxo-α-ionol（8）；trans-4-hydroxylinalool 3，6-oxide（9）；methyl（S）-9-hydroxy-10-undecenoate（10），其中化合物1和2 為新化合物。此外，采用MTT 法測(cè)定分離得到的化合物對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用，且基于前期文獻(xiàn)調(diào)研工作，發(fā)現(xiàn)茵陳蒿中炔類化合物具有一定抗HBV 活性[14]，本研究論文采用MTT 法和ELISA 法進(jìn)一步針對(duì)茵陳蒿中分離得到的炔類化合物進(jìn)行抗HBV 活性測(cè)試。

圖1 茵陳蒿中分離得到的化合物（1-10）

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 儀器 用Jasco P-1020 數(shù)字旋光儀測(cè)量旋光度；用KBr 微球在Thermo NICOLET iS10 上測(cè)定了紅外光譜；高分辨質(zhì)譜用Agilent 6500 系列Q-TOF液質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)；核磁共振光譜用Bruker DRX-600核磁共振波譜儀（Bruker Bio-Spin group，Germany）進(jìn)行測(cè)量，使用TMS 作為內(nèi)標(biāo)；分析型液相色譜儀Waters 2695/2996（Waters 公司，美國(guó)）；制備型液相色譜儀Waters 1525/2998（Waters 公司，美國(guó)）；多功能酶標(biāo)儀（Infinite M200Po，瑞士ECAN 公司）。

正相柱層析采用的材料有200～300 和500～800目的硅膠（青島海洋化工廠）；反向柱層析采用的材料有MCI-gel-CHP-20P（75～150 μm，三菱化學(xué)工業(yè)有限公司）；ODS-A（40～63 μm，日本）；薄層色譜采用硅膠板（青島海洋化工有限公司），顯色劑為10%H2SO4-EtOH 溶液；半制備柱采用ACE C18-PFP 和Waters sunfire-C18 色譜柱（5 μm，250 mm × 10 mm）。

1.2 材料 茵陳蒿于2020 年10 月采自中國(guó)山西省運(yùn)城縣，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)吳之坤博士鑒定，確定為茵陳蒿（Artemisia capillaris Thunb.）藥材，植物標(biāo)本已存放在昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，標(biāo)本編號(hào)為KMUST-BS-0116。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取與分離 茵陳蒿全草100 kg，粉碎后用95%的乙醇室溫提取3 次，提取時(shí)間分別為3 h、2 h、1 h。將該提取物（20 kg）經(jīng)減壓濃縮后懸浮于水中，用乙酸乙酯萃取3 次，經(jīng)濃縮，得到乙酸乙酯萃取物5 kg。采用D101 大孔樹脂柱層析進(jìn)行分離，分別用水、30%、50%、70%、90%、100%甲醇洗脫，得到7 個(gè)流份Fr.A～Fr.G。為進(jìn)一步促進(jìn)茵陳蒿中萜類化合物的研究進(jìn)展，本文結(jié)合薄層色譜TLC 顯色結(jié)果和LC-MS 數(shù)據(jù)，選取萜類化合物較多的流份Fr.E 作進(jìn)一步分離純化研究工作。

Fr.E（113 g）經(jīng)硅膠柱色譜進(jìn)行分離，用二氯甲烷和甲醇系統(tǒng)梯度洗脫（100 ∶0-0 ∶1），得到13 個(gè)流份Fr.E1-Fr.E13。Fr.E5（1.34 g）經(jīng)ODS 柱層析進(jìn)行分離，用甲醇-水系統(tǒng)梯度洗脫（30%～70%），得到11 個(gè)流份Fr.E5-1～Fr.E5-11。Fr.E5-4（500 mg）經(jīng)半制備HPLC（乙腈-水25%）分離得到化合物5（2.5 mg，tR=17 min），6（5 mg，tR=20 min），7（5 mg，tR=25 min）。Fr.E5-5（76 mg）經(jīng)半制備HPLC（乙腈-水30%）分離得到化合物4（2.8 mg，tR=10 min），9（3 mg，tR=16 min）。Fr.E6（2.6 g）經(jīng)硅膠柱層析進(jìn)行分離，用石油醚和乙酸乙酯系統(tǒng)梯度洗脫（30 ∶1-0 ∶1），得到23 個(gè)流份Fr.E6-1～Fr.E6-23。Fr.E6-12（100 mg） 經(jīng)半制備HPLC（乙腈-水45%）分離得到化合物2（4 mg，tR=17 min）。Fr.E6-17（189 mg）經(jīng)半制備HPLC（乙腈-水18%）分離得到化合物1（3 mg，tR=27 min），3（2 mg，tR=29 min），8（7 mg，tR=32 min）。Fr.E7（2.8 g）經(jīng)硅膠柱層析進(jìn)行分離，用石油醚和乙酸乙酯系統(tǒng)梯度洗脫（40 ∶1-0 ∶1），得到14 個(gè)流份Fr.E7-1～Fr.E7-14。Fr.E7-7（102 mg）經(jīng)半制備HPLC（乙腈-水38%）分離得到化合物10（16 mg，tR=14 min）。

2.2 肝癌細(xì)胞活性測(cè)試 采用MTT 法測(cè)定分離得到的10 個(gè)化合物對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2 的抑制作用。用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液（DMEM）配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔3 000～15 000 個(gè)細(xì)胞接種到96 孔板，每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液，在37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h，使細(xì)胞貼壁。吸去舊培養(yǎng)基后，待測(cè)化合物用DMSO 溶解，30 μM 為初篩濃度加入板中，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育72 h。吸去培養(yǎng)基，加入配好的MTT 溶液（5 mg/mL），每孔加入20 μL，培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后每孔加入200 μL DMSO（二甲基亞砜）避光震搖12 min，使用酶標(biāo)儀在490 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度值，記錄結(jié)果。紫杉醇作為陽(yáng)性對(duì)照化合物。按公式計(jì)算細(xì)胞抑制率：細(xì)胞抑制率=（[空白組－實(shí)驗(yàn)組）/空白組]×100%。

2.3 HBV 活性測(cè)試 采用MTT 法測(cè)定化合物1，3 和4 對(duì)HepG2.2.15 細(xì)胞的毒性，用ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞上清液中的HBeAg 和HBsAg 抗原分泌。HepG2.2.15細(xì)胞接種于48 孔板，3×104細(xì)胞每孔，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁。吸除原培養(yǎng)基，將稀釋好的樣品加入板中，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育72 h。用MTT 法檢測(cè)藥物細(xì)胞毒性，用ELISA 法測(cè)定樣品對(duì)HBeAg 和HBsAg 抗原分泌抑制率，以拉米夫定作為陽(yáng)性對(duì)照。按公式計(jì)算細(xì)胞存活率和抗原抑制率：細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組/空白組）×100%；抗原抑制率=（[空白組－實(shí)驗(yàn)組）/空白組]×100%。

2.4 結(jié)構(gòu)鑒定 化合物1：淡黃色油狀。[α]2D3-20.0（c 0.10，MeOH）。ESI-MS m/z：187.0729 [M+Na]+（計(jì)算值為187.0735 [M+Na]+），推測(cè)分子式為C10H12O2，不飽和度為5。紅外光譜（KBr）顯示有羥基信號(hào)（3403 cm-1），炔基信號(hào)（2230 cm-1）和碳-碳雙鍵信號(hào)（1613 cm-1）。紫外光譜（λmax：239，252，267，283 nm）與烯炔類化合物的紫外吸收吻合。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.21（dq，J=10.8，6.9 Hz，1H，H-9），5.55（d，J=10.8 Hz，1H，H-8），4.60（t，J=6.3 Hz，1H，H-3），3.71 （m，2H，H-1），1.89 （d，J=6.9 Hz，3H，H-10），1.89（m，2H，H-2）。13C-NMR 數(shù)據(jù)見表1，顯示10 個(gè)碳信號(hào)，包括4 個(gè)季碳，3 個(gè)次甲基，3 個(gè)亞甲基，與化合物gymnasterkoreayne A[17]對(duì)比1H-NMR，13C-NMR 數(shù)據(jù)基本一致，除了H-8 和H-9 之間耦合常數(shù)由15.8 Hz 變?yōu)?0.8 Hz，故判斷8 位雙鍵的構(gòu)型為Z 型。由于該化合物具有一個(gè)手性碳（C-3），為進(jìn)一步判定其絕對(duì)構(gòu)型，我們對(duì)其比旋光度進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果為 [α]23D-20.0（c 0.10，MeOH），與原文獻(xiàn)[α]2D3-14.0（c 0.1，MeOH）基本吻合，綜上所述，化合物1 鑒定為（R，Z）-deca-8-en-4，6-diyne-1，3-diol.

化合物2：無(wú)色油狀。[α]2D44.30（c 0.25，CHCl3）。ESI-MS m/z：263.1247 [M+Na]+（計(jì)算值為263.1259[M+Na]+），推測(cè)分子式為C13H20O4，不飽和度為4。紅外光譜（KBr）顯示有羰基信號(hào)（1756 cm-1）和碳-碳雙鍵信號(hào)（1601 cm-1）。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δH：7.72（dd，J=5.8，1.5 Hz，1H，H-3），6.13（d，J=5.8 Hz，1H，H-2），5.14（m，1H，H-4），3.65（s，3H，H-13），2.32（t，J=7.4 Hz，2H，H-11），1.86-1.29（m，12H，H-5-H-10）。13C-NMR 數(shù)據(jù)見表1，顯示13 個(gè)碳信號(hào)，包括2個(gè)季碳，3 個(gè)次甲基，7 個(gè)亞甲基，1 個(gè)甲氧基，與化合物maritolide[18]對(duì)比1H-NMR，13C-NMR 數(shù)據(jù)基本一致，主要區(qū)別在于化合物2 少了一個(gè)連氧亞甲基信號(hào)，出現(xiàn)了一個(gè)甲氧基信號(hào)。HMBC 譜中OMe（δH3.65）與C-12（δC175.7）相關(guān)，進(jìn)一步支持上述推測(cè)。為進(jìn)一步判定C-4 位的絕對(duì)構(gòu)型，我們對(duì)其比旋光度進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果為[α]2D4+4.30（c 0.3，CHCl3），與原文獻(xiàn)[α]2D4-3.4（c 0.2，CHCl3）相反，從而確定其絕對(duì)構(gòu)型為4S。綜上所述，化合物2 鑒定為methy（lS）-8-（5-oxo-2，5-dihydrofuran-2-yl）octanoate。

化合物3：淡黃色油狀。MS m/z：187.1 [M+Na]+，分子式：C10H12O2。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.30（dq，J=16.3，6.9 Hz，1H，H-9），5.59 （d，J=16.3 Hz，1H，H-8），4.57（t，J=6.9 Hz，1H，H-3），3.79（t，J=5.6 Hz，2H，H-1），1.94（m，2H，H-2），1.72（d，J=6.9 Hz，3H，H-10）。13C-NMR 數(shù)據(jù)見表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物3 為gymnasterkoreayne A。

化合物4：無(wú)色油狀。MS m/z：185.1 [M+Na]+，分子式：C10H10O2。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：4.57（td，J=6.1，5.8 Hz，1H，H-3），3.74（m，2H，H-1），1.97（s，3H，H-10），1.87（m，2H，H-2）。13C-NMR 數(shù)據(jù)見表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物4 為（S）-deca-4，6，8-triyne-1，3-diol。

化合物5：無(wú)色油狀。MS m/z：245.1 [M+Na]+，分子式：C13H18O3。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.00（d，J=15.8 Hz，1H，H-7），6.44（d，J=15.8 Hz，1H，H-8），5.94（s，1H，H-4），2.62（d，J=17.1 Hz，1H，H-2a），2.31（s，3H，H-10），2.28（d，J=17.1 Hz，1H，H-2b），1.89（s，3H，H-13），1.06（s，3H，H-11），1.02（s，3H，H-12）。13C-NMR 數(shù)據(jù)見表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物5 為dehydrovomifoliol。

化合物6：淡黃色油狀。MS m/z：219.1 [M+Na]+，分子式：C11H16O3。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：5.76（s，1H，H-7），4.22（m，1H，H-3），2.42（dd，J= 13.5，2.6 Hz，1H，H-4a），1.99（dd，J=14.4，2.6 Hz，1H，H-2a），1.76（s，3H，H-10），1.74（dd，J=13.5，2.6 Hz，1H，H-4b），1.53（dd，J=14.4，2.6 Hz，1H，H-2b），1.47（s，3H，H-9），1.28（s，3H，H-11）。13C-NMR 數(shù)據(jù)見表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物6為loliolide。

化合物7：無(wú)色油狀。MS m/z：265.1 [M+Na]+，分子式：C13H22O4。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.18（d，J=15.8 Hz，1H，H-8），6.18（d，J=15.8 Hz，1H，H-7），3.76（m，1H，H-3），2.31（dd，J=14.3，9.2 Hz，1H，H-4a），2.29（s，3H，H-10），1.65（dd，J=14.3，9.2 Hz，1H，H-4b），1.58（m，1H，H-2a），1.27（m，1H，H-2b），1.19（s，3H，H-11），1.18 （s，3H，H-13），0.96 （s，3H，H-12）。13C-NMR 數(shù)據(jù)見表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物7 為（3S，5R，6S，7E）3，5，6-trihydroxy-7-megastigmen-9-one。

化合物8：無(wú)色油狀。MS m/z：231.1[M+Na]+，分子式：C13H20O2。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：5.89（s，1H，H-4），5.69 （dd，J=15.3，6.0 Hz，1H，H-8），5.58（dd，J=15.3，9.3 Hz，1H，H-7），4.28 （m，1H，H-9），2.66（d，J=9.3 Hz，1H，H-6），2.42（d，J=16.8 Hz，1H，H-2a），2.05（d，J=16.8 Hz，1H，H-2b），1.96（s，3H，H-13），1.24（d，J=6.5 Hz，3H，H-10），1.03（s，3H，H-11），0.96（s，3H，H-12）。13C-NMR 數(shù)據(jù)見表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物8 為（6R，9R）-3-oxo-α-ionol。

化合物9：無(wú)色油狀。MS m/z：209.1 [M+Na]+，分子式：C10H18O3。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：5.88（dd，J=17.3，10.8 Hz，1H，H-2），5.25（dd，J=17.3，1.8 Hz，1H，H-1a），5.04（dd，J=10.8，1.8 Hz，1H，H-1b），3.82（m，1H，H-4），3.83（dd，J=9.4，3.4 Hz，1H，H-6），2.22（ddd，J=14.0，9.4，5.5 Hz，1H，H-5a），1.87 （ddd，J=13.5，5.5，3.4 Hz，1H，H-5b），1.27（s，3H，H-8），1.24（s，3H，H-10），1.14（s，3H，H-9）。13C-NMR 數(shù)據(jù)見表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物9 為trans-4-hydroxylinalool-3，6-oxide。

表1 化合物1-10 的13C-NMR 數(shù)據(jù)

化合物10：黃色油狀。MS m/z：237.1 [M+Na]+，分子式：C12H22O3。1H-NMR（600 MHz，CDCl）3δ：5.86（ddd，J=16.9，10.4，6.3 Hz，1H，H-2），5.21 （dt，J=16.9，1.4 Hz，1H，H-1a），5.10（dt，J=10.4，1.4 Hz，1H，H-1b），4.09（m，1H，H-3），3.66（s，3H，H-12），2.30（t，J=7.5 Hz，2H，H-10），1.61（m，2H，H-9），1.52（m，2H，H-4），1.30（m，8H，H-5-H-8）。13C-NMR 數(shù)據(jù)見表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物10為methy（lS）-9-hydroxy-10-undecenoate。

2.5 抗肝癌活性 本文對(duì)茵陳蒿中分離得到的化合物進(jìn)行抗肝癌活性測(cè)試，以濃度為3 μM 的紫杉醇作為陽(yáng)性對(duì)照，細(xì)胞毒活性如表2 所示，研究結(jié)果表明，在30 μM 濃度下，上述化合物對(duì)肝癌細(xì)胞株（HepG2）未顯示出抑制活性。

表2 化合物1-10 對(duì)HepG2 的細(xì)胞毒活性

2.6 抗HBV 活性 本文對(duì)茵陳蒿中分離得到的烯炔類化合物（1，3，4）進(jìn)行抗HBV 活性測(cè)試，以濃度為30 μM 的拉米夫定作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果如表3 所示，研究結(jié)果表明，在30 μM 和100 μM 濃度下，化合物1，3，4 均未顯示出抗HBV 活性。

表3 化合物1，3，4 在30 μM 和100 μM 濃度下抗HBV 活性

3 結(jié)論與討論

肝病是我國(guó)高發(fā)病率的病種，常見的肝病有肝炎、肝纖維化、脂肪肝、肝癌等?；谇捌谖墨I(xiàn)調(diào)研顯示，茵陳蒿是傳統(tǒng)抗肝病中藥茵陳的主要植物來(lái)源之一，臨床上用于治療各種肝膽疾病的復(fù)方方劑中均含有茵陳蒿，例如茵陳蒿湯可通過(guò)抑制JAK2/STAT3 信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞死亡，從而發(fā)揮抗肝癌作用[25]，茵陳蒿湯加味臨床上可用于治療慢性乙型肝炎[26]。但目前有關(guān)茵陳蒿中化學(xué)成分及其活性研究大多集中于有機(jī)酸類，黃酮類和香豆素類化合物[27]，針對(duì)萜類化合物的研究較少，且缺乏茵陳蒿中單體化合物對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的研究報(bào)道。本文從茵陳蒿的95%乙醇提取物中，萜類化合物含量最多的流份里分離出10 個(gè)化合物，并對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，包括5 個(gè)萜類，3 個(gè)烯炔類，2 個(gè)脂肪酸類化合物，其中化合物1 和2 為新化合物。體外抗肝癌活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這些化合物對(duì)HepG2 細(xì)胞無(wú)顯著抑制作用。此外，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，茵陳蒿中烯炔類化合物具有一定抗HBV 活性[14]，本研究論文針對(duì)分離得到的烯炔類化合物1，3，4 進(jìn)行抗HBV活性檢測(cè)，結(jié)果表明這三個(gè)化合物均無(wú)抗HBV 活性?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，茵陳蒿湯還具有抗肝硬化，肝纖維化等活性[28]，后續(xù)將對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行抗肝病相關(guān)活性測(cè)試，并對(duì)活性化合物的作用機(jī)制進(jìn)行解析，為其治療肝病的藥用價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)和基礎(chǔ)。本研究豐富了茵陳蒿的化學(xué)成分，并為其藥理學(xué)研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。