顧茜蘭，吳敏曼，朱 丹，祁 燕，司怡然，徐 瑩，萬(wàn)春平

（云南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650021）

慢性腎功能衰竭（chronic renal failure，CRF）是由多種慢性腎臟疾病發(fā)展至晚期引起的腎小球?yàn)V過(guò)率下降（GFR<90 mL/min）以及腎臟其他功能損害，導(dǎo)致體內(nèi)代謝產(chǎn)物潴留、酸堿平衡失調(diào)和水電解質(zhì)代謝紊亂等臨床癥狀組成的綜合征[1]。該病復(fù)雜多變，已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的重大挑戰(zhàn)。中醫(yī)治療作為延緩慢性腎衰竭進(jìn)程的非透析療法逐漸引起人們的重視[2-3]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為慢性腎功能衰竭屬久病入絡(luò)，多因腎病日久，脾運(yùn)失調(diào)，濁毒不化所致，治療原則通常以補(bǔ)腎健脾、通絡(luò)降濁為法[4-5]。溫腎醒脾化濁方由大黃、炒草果仁、黃芪等16 味中藥組成，該方具有溫腎健脾、補(bǔ)腎固精、扶正祛邪、解毒化濁等功效，臨床廣泛應(yīng)用于慢性腎功能衰竭的治療。臨床觀察顯示，血肌酐在300 mmol/L 以內(nèi)的慢性腎衰患者治療有效率達(dá)80%。然而，目前尚未明確溫腎醒脾化濁方治療CRF的作用機(jī)制，因此有必要進(jìn)一步研究。

腎纖維化（renal fibrosis） 是所有慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）發(fā)展至終末期的共同途徑[6]，其病變主要以腎小球硬化與腎小管萎縮為主要病理表現(xiàn)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過(guò)度積累共同參與了腎纖維化的發(fā)病機(jī)制[7]?；诖?，本研究擬通過(guò)建立慢性腎衰竭大鼠模型，以腎纖維化為切入點(diǎn)，旨在揭示溫腎醒脾化濁方防治和延緩慢性腎衰竭作用的效應(yīng)機(jī)制，為溫腎醒脾化濁方臨床應(yīng)用于治療慢性腎功能衰竭提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 正常大鼠41 只，雌性，7～8 周齡，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2019-0010；動(dòng)物飼養(yǎng)在SPF 級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物最少飼養(yǎng)1 周后使用。溫度（22±1）℃，濕度55%±5%，12 h 光暗循環(huán)。飼料、水均在消毒后由動(dòng)物自由攝取。所有實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)條例進(jìn)行。

1.2 主要藥物與試劑 注射用鹽酸多柔比星即鹽酸阿霉素（深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H44024359，批號(hào)：2101E1）；尿酸檢測(cè)試劑盒、尿素氮檢測(cè)試劑盒和肌酐檢測(cè)試劑盒（羅氏診斷公司，批號(hào)分別為：53538501、53860001、53423001）；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ染料（大連Takara，批號(hào)：RR820A）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連Takara，批號(hào)：RR036A）；Trizol 裂解液（天根生化（北京）科技有限公司，批號(hào)：RK145）。

1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司；離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)賀利氏儀器公司；PCR 基因擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司；全自動(dòng)生化儀購(gòu)自美國(guó)羅氏公司；熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Aglient 公司；NANODROP 2 000 核酸蛋白檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

2 方法及評(píng)價(jià)

2.1 受試藥物浸膏的制備 溫腎醒脾化濁方由大黃、炒草果仁、黃芪等16 味中藥組成，由云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供，稱取配方中藥材1 940.4 g，粉碎、浸泡30 min 及以上，加入生藥體積10 倍、8 倍和6 倍的飲用水，各煎煮3 次，過(guò)濾，合并濾液，濃縮，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成浸膏，浸膏938.3 g，折合成浸膏，1 g 浸膏中相當(dāng)于含2.1 g 生藥，置于4℃冰箱中保存，備用。

2.2 腎功能衰竭大鼠模型的建立、分組及給藥 選取41 只SPF 級(jí)健康成年雌性SD 大鼠，隨機(jī)分成5組，即正常組、模型組、溫腎醒脾化濁方低劑量組（1.49 g/kg）、中劑量組（2.98 g/kg）和高劑量組（5.95 g/kg）。采用1 次性尾靜脈注射鹽酸阿霉素構(gòu)建腎功能衰竭大鼠模型，具體方法如下：造模大鼠按照6 mg/kg 劑量經(jīng)尾靜脈1 次性注射鹽酸阿霉素，正常組大鼠經(jīng)尾靜脈1 次性注射等體積生理鹽水。于造模當(dāng)天開(kāi)始給藥，溫腎醒脾化濁方低、中、高劑量組分別灌胃給予溫腎醒脾化濁方1.49g/kg、2.98g/kg 和5.95 g/kg，1 次/d，連續(xù)灌胃27 d。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 CRF 大鼠24 h 尿蛋白檢測(cè) 觀察點(diǎn)時(shí)，大鼠禁食但不禁水，采用代謝籠收集24 h 尿液，記錄尿量后取1 mL，離心去除沉淀，參照考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定尿蛋白，檢測(cè)方法如下：標(biāo)準(zhǔn)品和離心后尿液加入96 孔板中后再加入200 μL 稀釋考馬斯亮藍(lán)工作液，室溫放置5 min，酶標(biāo)儀595 nm 測(cè)定OD 值，計(jì)算各組大鼠24 h 尿蛋白含量。

24 h 尿蛋白含量=檢測(cè)值×尿量

2.3.2 CRF 大鼠血清腎功能生化指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥后，按5 mg/100 g 體質(zhì)量，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min，離心15 min，分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）和尿酸（UA）水平。

2.3.3 H＆E 染色檢測(cè)腎臟的病理?yè)p傷程度 處死后，用生理鹽水主動(dòng)脈灌注后，右腎臟橫切一半，放于10%福爾馬林固定，用于病理組織切片檢測(cè)。H＆E 染色如下：將固定好的腎組織通過(guò)75%、85%、95%、100%濃度梯度乙醇進(jìn)行脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成4 μm 薄片，蘇木素-伊紅（H＆E）染色，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織病理?yè)p傷程度。

2.3.4 Real-time PCR 檢測(cè)腎纖維化相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平 分析天平稱取50 mg 腎組織，加入1 mL Trizol 裂解液，用勻漿器冰上勻漿，采用Trizol 試劑盒抽提總RNA，然后將總RNA 定量為1 000 ng。RT-PCR 法逆轉(zhuǎn)成cDNA，取同1 個(gè)cDNA 為模板，按實(shí)時(shí)定量PCR 試劑盒說(shuō)明書，以GAPDH 為內(nèi)參基因，進(jìn) 行TGF-β1、MMP-9、Col4a2R、Fn1、TIMP-1 mRNA 表達(dá)檢測(cè)，結(jié)果以Ct 值顯示。目的基因表達(dá)的相對(duì)差異量用2-△△Ct法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。特異基因引物序列如下：

2.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0 軟件，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，若方差齊，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）統(tǒng)計(jì)，若方差不齊，采用LSD 法分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果P<0.05、P<0.01、P<0.001 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察 與正常組比較，模型組大鼠出現(xiàn)行動(dòng)遲緩，精神狀態(tài)較萎靡等狀況，并出現(xiàn)死亡情況，取腎臟并進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)與正常組比較，模型組大鼠腎臟體積明顯增大，腎臟包膜泛白，皮質(zhì)變?。慌c模型組比較，溫腎醒脾化濁方干預(yù)組行動(dòng)、精神狀態(tài)均有所改善，未出現(xiàn)死亡情況，腎臟體積減少。

3.2 溫腎醒脾化濁方對(duì)CRF 大鼠24 h 尿蛋白含量和腎體質(zhì)量的影響 與正常組比較，病理模型組大鼠24 h 尿蛋白、尿體積、腎體質(zhì)量、腎臟指數(shù)顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示腎功能衰竭大鼠模型制備成功。與模型組比較，溫腎醒脾化濁方低、中和高劑量組24 h 尿蛋白、尿液含量劑量依耐性地減少，其中，中、高劑量組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。溫腎醒脾化濁方藥物干預(yù)顯著抑制CRF 大鼠腎體質(zhì)量、腎臟指數(shù)；提示溫腎醒脾化濁方對(duì)CRF 具有較好的療效。見(jiàn)表1。

表1 溫腎醒脾化濁方對(duì)腎功能衰竭大鼠24 h 尿蛋白含量和腎體質(zhì)量的影響（±s）

表1 溫腎醒脾化濁方對(duì)腎功能衰竭大鼠24 h 尿蛋白含量和腎體質(zhì)量的影響（±s）

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

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3.3 溫腎醒脾化濁方對(duì)CRF 大鼠腎功能的影響 腎功能檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組大鼠比較，模型組大鼠血清肌酐、尿素氮和尿酸水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，溫腎醒脾化濁方低、中、高劑量組肌酐劑量依耐性地減少，其中，中、高劑量組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；溫腎醒脾化濁方各劑量干預(yù)后，顯著減少尿素氮的產(chǎn)生，其中，低、高劑量組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；溫腎醒脾化濁方各給藥組血清尿酸水平低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示溫腎醒脾化濁方對(duì)慢性腎功能衰竭具有顯著的腎功能保護(hù)效應(yīng)。見(jiàn)表2。

表2 溫腎醒脾化濁方對(duì)腎功能衰竭大鼠腎功能指標(biāo)的影響（±s）

表2 溫腎醒脾化濁方對(duì)腎功能衰竭大鼠腎功能指標(biāo)的影響（±s）

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

尿酸/（mmol·L-1）正常組 6 - 28.17±2.56* 4.88±0.50* 39.80±5.74**模型組 9 - 39.63±10.77 6.69±1.74 75.65±12.25低劑量組 8 1.49 32.88±3.64 4.99±0.82* 62.48±10.06*中劑量組 9 2.98 30.13±3.04* 5.31±0.77 59.50±9.72*高劑量組 9 5.95 29.86±2.41* 4.99±0.84* 58.01±11.26*組別 n給藥劑量/（g·kg-1）肌酐/（μmol·L-1）尿素氮/（mmol·L-1）

3.4 溫腎醒脾化濁方對(duì)CRF 大鼠腎臟組織病理?yè)p傷的影響 H＆E 染色結(jié)果可見(jiàn)，正常組大鼠腎小球和腎小管排列整齊、形態(tài)完整，間質(zhì)無(wú)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與纖維病變；腎功能衰竭大鼠腎小管排列無(wú)規(guī)則、出現(xiàn)不同程度的擴(kuò)張，伴有大量棕褐色代謝產(chǎn)物沉積，腎小球變形萎縮，數(shù)量減少，腎間質(zhì)大量炎性浸潤(rùn)，伴纖維化增生。溫腎醒脾化濁方各劑量組干預(yù)后，CRF 大鼠腎組織的炎性浸潤(rùn)、纖維化增生以及腎小球變形萎縮等病變均有所改善。見(jiàn)圖1。

圖1 溫腎醒脾化濁方對(duì)CRF 大鼠腎臟組織病理變化的影響

3.5 溫腎醒脾化濁方對(duì)CRF 大鼠腎組織纖維化信號(hào)通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響 為進(jìn)一步揭示溫腎醒脾化濁方對(duì)CRF 大鼠腎纖維化通路的影響，我們以最有效劑量溫腎醒脾化濁方高劑量與模型組進(jìn)行比較，采用熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)腎纖維化信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA 表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與病理模型組比較，溫腎醒脾化濁方高劑量組腎組織TGFβ1、Fn1、TIMP-1、Col4a2R mRNA 顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而MMP-9 mRNA 表達(dá)明顯上調(diào)，MMP-9/TIMP-1 比值顯著增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2。

圖2 溫腎醒脾化濁方對(duì)CRF 大鼠腎組織腎纖維化信號(hào)通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響

4 討論

阿霉素腎病大鼠是一種經(jīng)典的慢性腎臟病模型，主要早期表現(xiàn)為腎小球微小病變，而后期表現(xiàn)為腎小球局灶階段性硬化為主，最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化和慢性腎功能衰竭，伴有尿蛋白、肌酐和尿素氮明顯異常[8]。其發(fā)病臨床表現(xiàn)和病理特征與臨床慢性腎病的病理特征極為相似，具有模型方法簡(jiǎn)便、病變穩(wěn)定、發(fā)病率高、觀察指標(biāo)改變明顯等優(yōu)點(diǎn)。因此是研究慢性腎病理想的疾病動(dòng)物模型。利用此模型，本研究采用一次尾靜脈注射阿霉素誘導(dǎo)建立慢性腎衰竭大鼠模型，研究溫腎醒脾化濁方對(duì)慢腎衰大鼠24 h 尿蛋白和腎功能的影響。H＆E 染色檢測(cè)腎臟的病理變化明確其防治慢性腎功的藥效。結(jié)果顯示，溫腎醒脾化濁干預(yù)顯著減少24 h 蛋白尿和腎體質(zhì)量的異常增加，降低腎功尿素氮和肌酐的水平，改善腎組織的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維化增生以及腎小球變形萎縮等病變，表現(xiàn)出對(duì)慢性腎臟功能較好的保護(hù)作用，值得臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

腎纖維化是所有慢性腎病發(fā)展至終末期的共同途徑[6]，因此如何保護(hù)腎功能并延緩腎臟纖維化的進(jìn)展速度是慢性腎病治療的關(guān)鍵。腎纖維化的形成涉及系膜細(xì)胞的增殖、單核細(xì)胞的浸潤(rùn)、成纖維細(xì)胞異常增殖、ECM 降解減少或積聚過(guò)多等病變[7]。MMP-9 是MMPs 超基因家族成員之一，主要降解IV、V、VII、XI型膠原、彈性蛋白和蛋白聚糖等，其主要生物學(xué)作用是在一定的條件作用下（如鋅離子和PH 值），參與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）降解與重建。而TIMP- 1 作為MMPs的主要抑制物之一，抑制絕大多數(shù)的MMPs，因此在細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）積聚與降解動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用[9-10]。最新研究表明，在腎臟基質(zhì)合成階段，MMP-9/TIMP-1 失衡與膠原降解受抑、ECM 聚集密切相關(guān)，最終會(huì)誘導(dǎo)腎臟纖維化快速進(jìn)入硬化階段，使腎臟失去功能[11]。熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，與病理模型組比較，溫腎醒脾化濁方組大鼠腎組織TIMP-1 mRNA 表達(dá)增加、MMP-9 mRNA 表達(dá)減少，MMP-9/TIMP-1 比值增加，提示溫腎醒脾化濁方可能通過(guò)提高M(jìn)MP-9/TIMP-1 比值，提高對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）降解作用，維持ECM 積聚和降解的生理平衡，從而達(dá)到抗腎纖維化的作用。我們進(jìn)一步檢測(cè)膠原酶Col4a2R mRNA 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)溫腎醒脾化濁方組模型大鼠腎組織Col4a2R 轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著下降，進(jìn)一步佐證我們的推測(cè)：溫腎醒脾化濁方可能通過(guò)提高M(jìn)MP-9/TIMP-1 比值，增加對(duì)膠原酶的降解，從而延緩了腎纖維化進(jìn)展。

細(xì)胞外基質(zhì)的增多和聚集是導(dǎo)致腎組織進(jìn)行性纖維化的主要病理基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）屬于生長(zhǎng)因子超家族的一部分，它通過(guò)與細(xì)胞表面TGF-β 受體結(jié)合，以Smads 和非Smads 信號(hào)通路，對(duì)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、分化、凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)的合成等起關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用，其不僅是目前發(fā)現(xiàn)的一種促纖維化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，還是腎纖維化進(jìn)程中重要的調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)水平與腎纖維化呈顯著正相關(guān)性[12]。而纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)n）則是重要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白非膠原糖蛋白，介導(dǎo)腎纖維化的病理過(guò)程。實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果表明，溫腎醒脾化濁方干預(yù)可顯著下調(diào)TGFβ1 及Fn1 mRNA 的表達(dá)，提示下調(diào)TGF-β1 表達(dá)和Fn1 mRNA 表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成可能是其延緩腎纖維化機(jī)制之一。本研究證實(shí)溫腎醒脾化濁方可能通過(guò)調(diào)控MMP-9/TIMP-1 失衡，下調(diào)TGF-β1 及Fn1 的表達(dá)，減少ECM 積聚，進(jìn)而延緩腎纖維化形成和保護(hù)腎功能，該研究初步解析溫腎醒脾化濁法治療慢性腎功能衰竭的現(xiàn)代生物學(xué)特征，并為臨床溫腎醒脾化濁方治療慢性腎功能衰竭提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。