劉瑜 羅帥 張鵬 王雪艷 熊杰 熊雄 吳辰熙 姜傳奇 繆煒

摘要：原生動(dòng)物對(duì)環(huán)境變化反應(yīng)敏銳，是水生態(tài)系統(tǒng)微生物食物網(wǎng)、物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中的重要結(jié)構(gòu)和功能組成部分。青海湖作為我國(guó)最大的內(nèi)陸咸水湖，是維系青藏高原生態(tài)安全的重要水體，是世界高原內(nèi)陸湖泊濕地類(lèi)型的典型代表。為了探究青海湖流域原生動(dòng)物群落結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境因子之間的關(guān)系，于2020年8月對(duì)青海湖流域的入湖河流、湖濱帶、主湖區(qū)及子湖共32個(gè)樣點(diǎn)進(jìn)行水環(huán)境樣品采集，共獲得水體樣品95份，利用宏基因組測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)方法從分子水平開(kāi)展了該流域原生動(dòng)物多樣性和群落結(jié)構(gòu)及其影響因素研究。主要結(jié)果如下：（1）共注釋到176個(gè)原生動(dòng)物分類(lèi)單元（Operational Taxonomic Units，OTU），隸屬于12門(mén)19綱43目61科72屬；（2）青海湖流域原生動(dòng)物多樣性為入湖河流>湖濱帶>子湖>主湖區(qū)，且4類(lèi)水體環(huán)境原生動(dòng)物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異；（3）原生動(dòng)物群落受水體酸堿度、鹽度、水溫、溶解性總固體、濁度、總氮、總磷等環(huán)境因子的影響；（4）原生動(dòng)物與其他浮游生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)從入湖河流、湖濱帶、子湖到主湖區(qū)，模塊性逐漸變低，生物類(lèi)群間的互作網(wǎng)絡(luò)逐漸碎片化。青海湖流域原生動(dòng)物的調(diào)查結(jié)果可為將來(lái)該流域的水生態(tài)環(huán)境健康評(píng)估提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：原生動(dòng)物；宏基因組；多樣性；群落結(jié)構(gòu)；青海湖流域

中圖分類(lèi)號(hào)：X173 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：1674-3075（2023）04-0001-09

原生動(dòng)物是一類(lèi)單細(xì)胞真核生物（Pawlowski et al，2014），是水生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的重要結(jié)構(gòu)和功能組成部分（沈韞芬等，1994；許木啟和Kasprzar，2001）。原生動(dòng)物種類(lèi)繁多，目前已經(jīng)記錄的原生動(dòng)物有60 000多種，廣泛分布于海水、淡水以及土壤等環(huán)境中。同時(shí)，原生動(dòng)物對(duì)環(huán)境變化敏感，是一類(lèi)理想的環(huán)境監(jiān)測(cè)指示生物（王北蘇，2010；陸夏銘和楊青，2021）。

湖泊是陸地表層水體的重要組成部分，在社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生物多樣性維持等方面起著至關(guān)重要的作用（張奇等，2020）。青海湖是中國(guó)最大的內(nèi)陸咸水湖，位于青藏高原東北邊緣，處于黃土高原、西北干旱區(qū)和青藏高寒區(qū)的過(guò)渡地帶，是維系青藏高原東北部生態(tài)安全的重要屏障（張明，2016；張明和曹學(xué)章，2017）。在經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展特別是旅游業(yè)發(fā)展及全球氣候變化的大背景下，青海湖流域的水生態(tài)健康受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注。連喜紅等（2019）探討人類(lèi)活動(dòng)影響下的青海湖生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)空間格局，結(jié)果表明氮、磷負(fù)荷隨人類(lèi)活動(dòng)的增強(qiáng)呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。孟星亮等（2014）對(duì)青海湖流域大型底棲動(dòng)物的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了調(diào)查，共注釋到底棲動(dòng)物28個(gè)分類(lèi)單元（Operational Taxonomic Units， OTUs），隸屬于3門(mén)5綱15科。羅穎等（2020）根據(jù)2014年夏季青海湖水生生物調(diào)查，研究水體浮游動(dòng)物的群落結(jié)構(gòu)特征，共鑒定出浮游動(dòng)物19種，結(jié)果表明2014年夏季青海湖浮游動(dòng)物群落結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單但處于較為穩(wěn)定的狀態(tài)。Ren等（2017）對(duì)青海湖及其入湖河流微生物群落的分類(lèi)和功能進(jìn)行研究，結(jié)果表明河流與湖泊之間的微生物群落在分類(lèi)和功能上存在顯著差異。

目前，青海湖流域原生動(dòng)物研究主要為基于形態(tài)學(xué)方法的生物多樣性調(diào)查。1961-1962年第一次開(kāi)展青海湖原生動(dòng)物調(diào)查，發(fā)現(xiàn)原生動(dòng)物6屬（中國(guó)科學(xué)院蘭州地質(zhì)研究所等，1979）；1964年9月-1965年8月的調(diào)查發(fā)現(xiàn)原生動(dòng)物1屬1種（青海省生物研究所，1975）；2006-2007年，共發(fā)現(xiàn)原生動(dòng)物2屬2種（楊建新等，2008）；2006-2010年夏季，共發(fā)現(xiàn)原生動(dòng)物3屬3種（姚維志，2011）。已有的研究中，青海湖流域原生動(dòng)物物種記錄較少，一方面與高原湖泊的特殊生境有關(guān)，另一方面與原生動(dòng)物個(gè)體微小、生命周期短、受環(huán)境影響大、保存和鑒定困難等因素有關(guān)（沈韞芬，1999）。

高通量測(cè)序技術(shù)日漸成熟，具有數(shù)據(jù)量大、準(zhǔn)確度高，對(duì)物種識(shí)別靈敏等特點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于原生動(dòng)物物種組成、群落時(shí)空分布等相關(guān)研究（黃平平，2017；安瑞志，2021；葛暢，2021）。此外，高通量測(cè)序技術(shù)的研究周期遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)形態(tài)分類(lèi)學(xué)研究，一定程度上提高了研究效率。

本研究利用高通量測(cè)序方法，對(duì)青海湖流域入湖河流、湖濱帶、子湖、主湖區(qū)的原生動(dòng)物物種多樣性、群落結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境因子的關(guān)系進(jìn)行研究，旨在深入了解青藏高原地區(qū)咸水湖泊的原生動(dòng)物群落特征，為青海湖流域水環(huán)境生物監(jiān)測(cè)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為將來(lái)青海湖流域水生態(tài)環(huán)境健康評(píng)估提供參考依據(jù)。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 研究區(qū)域概況及采樣點(diǎn)設(shè)置

1.1.1 ? 研究區(qū)域概況 ? 青海湖地處青藏高原東北部，周長(zhǎng)約360 km，東西長(zhǎng)約104 km，南北寬約62 km，湖泊面積為4 625.6 km2，湖區(qū)氣候?qū)俑咴吆敫珊禋夂?，年均氣?.2℃，年均降水量336 mm（孟星亮等，2014）。青海湖水補(bǔ)給來(lái)源是河水，其次是湖底的泉水和降雨（楊建新等，2008），入湖河流包括布哈河、菜擠河、黑馬河、泉吉河、沙柳河等。其中，布哈河和沙柳河是最大的2條入湖河流，流域面積分別為14 337 km2和1 442 km2，多年平均徑流量為7.8 ×108 m3和3.1×108 m3，占青海湖入湖徑流量的48.7%和15.3%（孫永亮等，2008）。青海湖的3個(gè)子湖中，金沙灣部分與主體湖區(qū)季節(jié)性連通，尕海與主體湖完全隔離且無(wú)明顯河流補(bǔ)給，耳海與主體湖完全隔離且有倒淌河補(bǔ)給（孟星亮等，2014）。

1.1.2 ? 采樣點(diǎn)設(shè)置 ? 青海湖流域入湖河流、湖濱帶、主湖區(qū)及子湖4類(lèi)水體共設(shè)置32個(gè)采樣點(diǎn)（S1～S32），其中入湖河流（RHHL）設(shè)置樣點(diǎn)5個(gè)，分別為布哈河（S1）、菜擠河（S2）、黑馬河（S3）、泉吉河（S4）和沙柳河（S5）；子湖（ZH）設(shè)置樣點(diǎn)3個(gè)，分別為耳海（S6）、尕海（S7）和金沙灣（S8）；湖濱帶（HBD）設(shè)置樣點(diǎn)8個(gè)，編號(hào)為S9～S16；主湖區(qū)（ZHH）設(shè)置樣點(diǎn)16個(gè)，編號(hào)為S17～S32（圖1）。本研究于2020年8月對(duì)青海湖流域的32個(gè)樣點(diǎn)進(jìn)行水環(huán)境樣品的采集，每個(gè)樣點(diǎn)取3個(gè)平行樣，共獲得水體樣品95份（其中入湖河流沙柳河的1份樣品測(cè)序失?。?。

1.2 ? 樣品采集與處理

采集表層水（約50 cm水深），用300 [μ]m的尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾去除大的雜質(zhì)和大型水生生物（組織）后置于采水袋中。然后取1 L水樣抽濾至0.22 [μ]m PC膜（Millipore，USA）上，放置于無(wú)菌離心管中，保存于-80℃低溫冰箱，用于后續(xù)DNA提?。╓ang et al，2019），同時(shí)采集1 L水樣低溫避光保存，用于水環(huán)境指標(biāo)測(cè)定。

水體酸堿度（pH）、水溫（T）、溶解性總固體（TDS）、鹽度（SAL）及溶解氧（DO）用美國(guó)哈希HQ40D便攜式多參數(shù)水質(zhì)分析儀現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定；濁度（TUR）用美國(guó)哈希2100Q便攜式濁度儀現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定；總氮（TN）、總磷（TP）測(cè)定參照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》（國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局編委會(huì)， 2002）于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。

1.3 ? 數(shù)據(jù)處理與分析

1.3.1 ? DNA的提取與宏基因組測(cè)序 ? 樣本的DNA提取采用CTAB方法，每100 mg樣品添加500 [μ]L CTAB緩沖液，混合并徹底渦旋，置于60°C水浴孵育30 min后，離心5 min，加入5 ?L RNase A溶液，37°C孵育20 min。然后加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇抽提除去蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，將樣品離心1 min并重復(fù)此步驟提取，直到上層澄清。最后加入乙醇沉淀分離出總DNA（王先鋒等， 2017）。DNA純度和濃度利用2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)。使用M220聚焦超聲儀（Covaris Inc.， Woburn， MA， USA）將質(zhì)量合格的DNA破碎成大約300 bp的片段，把已純化的DNA片段加入到末端補(bǔ)齊體系中，然后加入3末端“A”緩沖反應(yīng)體系，連接測(cè)序接頭，利用T4 DNA連接酶將Illumina測(cè)序接頭連接至文庫(kù)DNA兩端，應(yīng)用Agencourt SPRIselect核酸片段篩選試劑盒以純化文庫(kù)，同時(shí)進(jìn)行片段大小篩選，PCR擴(kuò)增完成DNA文庫(kù)的構(gòu)建。文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)合格后，利用Illumina Hiseq 4 000對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)序。

1.3.2 ? 數(shù)據(jù)處理 ? 對(duì)采集得到的95份樣品進(jìn)行測(cè)序，共獲得數(shù)據(jù)量1.5 Tb。然后用fastQC（v0.11.9）對(duì)測(cè)序所得的原始序列進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，對(duì)于低質(zhì)量堿基使用Fastx trimmer（v0.0.14）移除，通過(guò)BLASTN（BLAST Version 2.10.1+，http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 將經(jīng)過(guò)質(zhì)控的序列比對(duì)至SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置e值閾值為1e-5，將符合要求的rDNA序列篩選出來(lái)，然后使用MEGAHIT（v1.1.3）組裝得到全部樣本的rDNA contigs。使用nhmmer判定組裝得到的 rDNA contigs，篩選出屬于16S和18S rDNA的序列使用腳本進(jìn)行截取，經(jīng)97%相似度聚類(lèi)后，最終得到的rDNA contigs同時(shí)與Nucleotide Sequence Database（NT， https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、Protist Ribosomal Reference database（PR2， https：//figshare.com/articles/PR2_rRNA_gene_database/3803709）、SILVA NR99（https：//www.arb-silva.de/）3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，選取最優(yōu)注釋結(jié)果，用于物種鑒定。使用Bwa（0.7.17-r1188）將每個(gè)樣品的rDNA序列分別比對(duì)至rDNA contigs，每個(gè)樣本的比對(duì)結(jié)果使用feature Counts（v1.6.0）進(jìn)行比對(duì)，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并用RPKM（Reads Per Kilobase per Million mapped reads）的方式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化得到OTU（Operational Taxonomic Units）豐度表。

1.3.3 ? 統(tǒng)計(jì)分析 ? 利用R4.0.3軟件（R Core， 2020）Vegan包計(jì)算均勻度指數(shù)（Pielou）、香農(nóng)指數(shù)（Shannon）、豐富度指數(shù)（Richness）、辛普森指數(shù)（Simpson）等多樣性指數(shù)并進(jìn)行非度量多維尺度分析（NMDS）。利用OTU豐度表計(jì)算優(yōu)勢(shì)OTUs。利用R軟件的vegan、psych、 pheatmap和indicspecies等軟件包進(jìn)行冗余分析、相關(guān)性分析和指示種類(lèi)分析。使用R和Gephi軟件進(jìn)行共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析。

2 ? 結(jié)果與分析

本研究對(duì)青海湖流域32個(gè)樣點(diǎn)的水環(huán)境樣品進(jìn)行了宏基因組測(cè)序，組裝后共提取到4 181條 rDNA contigs，經(jīng)過(guò)97%相似性聚類(lèi)后，共獲得336個(gè)真核生物的OTUs，其中原生動(dòng)物有176個(gè)OTUs。

2.1 ? 青海湖流域原生動(dòng)物多樣性

本研究所鑒定到的176個(gè)原生動(dòng)物OTUs隸屬12門(mén)19綱43目61科72屬，纖毛門(mén)（Ciliophora， 24%）占比最高，其次為眼蟲(chóng)門(mén)（Euglenozoa， 18%）和絲足蟲(chóng)門(mén)（Cercozoa， 13%），占比較低為透色門(mén)（Heterolobosea， 8%）、頂復(fù)門(mén)（Apicomplexa， 6%）、Discosea（5%）、管涌足蟲(chóng)門(mén)（Tubulinea， 3%）、Imbricatea（2%）、Endomyxa（2%）、Evosea（1%）、多鞭毛蟲(chóng)門(mén)（Fornicata， 1%）和有孔蟲(chóng)門(mén)（Foraminifera， 1%）（圖2）。

青海湖流域原生動(dòng)物多樣性指數(shù)如表1，均勻度指數(shù)為0.54～0.89，香農(nóng)指數(shù)為2.52～4.45，豐富度指數(shù)為88.00～157.00，辛普森指數(shù)為0.72～0.98。各指數(shù)均為入湖河流>湖濱帶>子湖>主湖區(qū)，表明青海湖流域原生動(dòng)物多樣性為入湖河流高于湖濱帶、子湖和主湖區(qū)。

2.2 ? 青海湖流域不同水體原生動(dòng)物的群落組成

青海湖流域入湖河流、湖濱帶、主湖區(qū)和子湖原生動(dòng)物物種組成相似，僅3個(gè)子湖無(wú)有孔蟲(chóng)門(mén)（Foraminifera）分布。但是，原生動(dòng)物非度量多維尺度（NMDS）分析（圖3A）顯示，4類(lèi)水體之間的原生動(dòng)物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異（P<0.05）。4種水體環(huán)境的原生動(dòng)物OTUs組成均為纖毛門(mén)和絲足蟲(chóng)門(mén)最多，但比例不同，入湖河流、湖濱帶、主湖區(qū)和子湖的2個(gè)類(lèi)群占比分別為48%和14%、30%和28%、38%和36%、29%和28%。高豐度類(lèi)群在不同水體的分布呈現(xiàn)差異，纖毛門(mén)和眼蟲(chóng)門(mén)在入湖河流占比最高，眼蟲(chóng)門(mén)在主湖區(qū)占比最低。絲足蟲(chóng)門(mén)在主湖區(qū)占比最高，在入湖河流占比最低。纖毛門(mén)、絲足蟲(chóng)門(mén)、眼蟲(chóng)門(mén)在湖濱帶和子湖的相對(duì)豐度無(wú)顯著差異，在入湖河流和主湖區(qū)的豐度差異顯著（圖3B）。

2.3 ? 青海湖流域原生動(dòng)物優(yōu)勢(shì)種類(lèi)和指示種類(lèi)

青海湖各個(gè)水體環(huán)境原生動(dòng)物優(yōu)勢(shì)種（相對(duì)豐度>0.02）如表2，共鑒定25個(gè)優(yōu)勢(shì)OTUs，其中入湖河流12個(gè)，湖濱帶12個(gè)，主湖區(qū)10個(gè)，子湖11個(gè)。入湖河流、湖濱帶、主湖區(qū)和子湖共有優(yōu)勢(shì)種為Mataza hastifera；湖濱帶、主湖區(qū)和子湖共有優(yōu)勢(shì)種為Pseudodifflugia sp.、Protaspa longipes；入湖河流和湖濱帶共有優(yōu)勢(shì)種為Vorticella sp.、Korotnevella stella、Sessilida sp.、Peritrichia sp.；湖濱帶和子湖共有優(yōu)勢(shì)種為Metanophrys sp.、Paraphelidium sp.；主湖區(qū)和子湖共有優(yōu)勢(shì)種為L(zhǎng)agenoeca sp.、Cercozoa sp.otu95、Mesodinium sp.、Cercozoa sp.otu102。結(jié)果表明Mataza hastifera、Pseudodifflugia sp.、Protaspa longipes、Vorticella sp.、Korotnevella stella、Sessilida sp.、Peritrichia sp.、Metanophrys sp.、Paraphelidium sp.等在青海湖流域原生動(dòng)物群落中占有重要地位。

利用R軟件indicspecies包計(jì)算各類(lèi)水體環(huán)境原生動(dòng)物指示種類(lèi)（圖4），以P≤0.01定為指示種類(lèi)，共16個(gè)指示OTUs。其中入湖河流12個(gè)，湖濱帶指示種7個(gè)，主湖區(qū)指示種3個(gè)，子湖指示種7個(gè)。相對(duì)豐度較高的指示種為Mesodinium sp.，是子湖和主湖區(qū)的共有指示種。

2.4 ? 青海湖流域原生動(dòng)物群落與環(huán)境因子的關(guān)系

青海湖流域不同水體環(huán)境因子測(cè)定值見(jiàn)表3所示。對(duì)青海湖流域原生動(dòng)物群落與環(huán)境因子的關(guān)系進(jìn)行冗余（RDA）分析（圖5A）。結(jié)果顯示，青海湖流域不同水體環(huán)境原生動(dòng)物群落結(jié)構(gòu)的影響因素不同。入湖河流原生動(dòng)物群落與溶解性總固體、總氮有較強(qiáng)的正相關(guān)，與鹽度和pH有較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)；湖濱帶原生動(dòng)物群落與溶解氧、溫度、濁度、總磷有較強(qiáng)的正相關(guān)；主湖區(qū)原生動(dòng)物群落與pH和鹽度有較強(qiáng)的正相關(guān)，與溶解氧、溫度、濁度、總磷有較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)；子湖原生動(dòng)物群落與湖濱帶原生動(dòng)物群落類(lèi)似，與溶解氧、溫度、濁度、總磷有較強(qiáng)的正相關(guān)。

原生動(dòng)物主要門(mén)類(lèi)與環(huán)境因子的相關(guān)性（Spearman）分析（圖5B）顯示，原生動(dòng)物主要門(mén)類(lèi)被劃分為2個(gè)類(lèi)群。類(lèi)群Ⅰ包括眼蟲(chóng)門(mén)、多鞭毛蟲(chóng)門(mén)和頂復(fù)門(mén)等，這些類(lèi)群與溶解性總固體、總氮、溫度、總磷、濁度呈正相關(guān)，與pH、鹽度呈負(fù)相關(guān)。類(lèi)群Ⅱ包括纖毛門(mén)、管涌足蟲(chóng)門(mén)、絲足蟲(chóng)門(mén)等，與總氮、溫度、總磷、濁度呈負(fù)相關(guān)，與鹽度、pH呈正相關(guān)。

2.5 ? 原生動(dòng)物與其他浮游生物群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析

為探究青海湖流域原生動(dòng)物與其他浮游生物類(lèi)群（藻類(lèi)、橈足類(lèi)、輪蟲(chóng)、枝角類(lèi)）的互作關(guān)系，分別對(duì)青海湖各個(gè)水體環(huán)境的原生動(dòng)物及其他浮游生物群落進(jìn)行共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析（圖6）。結(jié)果顯示，4類(lèi)水體環(huán)境共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)間的連接均以正相關(guān)為主，在網(wǎng)絡(luò)中正相關(guān)占多數(shù)表明群落的物種間更多的是互利關(guān)系。對(duì)比不同水體環(huán)境共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)屬性（表4），入湖河流共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)由284個(gè)節(jié)點(diǎn)和3 048條邊組成，湖濱帶共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)由307個(gè)節(jié)點(diǎn)和4 511條邊組成，子湖共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)由282個(gè)節(jié)點(diǎn)和4 476條邊組成，主湖區(qū)共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)由305個(gè)節(jié)點(diǎn)和3 515條邊組成。4類(lèi)水體環(huán)境模塊性均大于0.4，表明為模塊化結(jié)構(gòu)。當(dāng)把4類(lèi)水體環(huán)境網(wǎng)絡(luò)中的所有節(jié)點(diǎn)模塊化時(shí)，入湖河流所有節(jié)點(diǎn)分為5個(gè)模塊，主要表現(xiàn)為原生動(dòng)物與藻類(lèi)，原生動(dòng)物與藻類(lèi)、枝角類(lèi)、輪蟲(chóng)，原生動(dòng)物與藻類(lèi)、枝角類(lèi)、輪蟲(chóng)、橈足類(lèi)間的相互作用；湖濱帶所有節(jié)點(diǎn)分為4個(gè)模塊，主要表現(xiàn)為原生動(dòng)物與藻類(lèi)、橈足類(lèi)，原生動(dòng)物與藻類(lèi)、橈足類(lèi)、輪蟲(chóng)，原生動(dòng)物與藻類(lèi)、橈足類(lèi)、枝角類(lèi)、輪蟲(chóng)間的相互作用；子湖所有節(jié)點(diǎn)分為4個(gè)模塊，主要表現(xiàn)為原生動(dòng)物與藻類(lèi)、枝角類(lèi)，原生動(dòng)物與藻類(lèi)、橈足類(lèi)、輪蟲(chóng)，原生動(dòng)物與藻類(lèi)、橈足類(lèi)、枝角類(lèi)、輪蟲(chóng)間的相互作用；主湖區(qū)所有節(jié)點(diǎn)分為2個(gè)模塊，主要表現(xiàn)為原生動(dòng)物與藻類(lèi)、橈足類(lèi)、枝角類(lèi)、輪蟲(chóng)間的相互作用。模塊性為入湖河流>湖濱帶>子湖>主湖區(qū)，即從入湖河流、湖濱帶、子湖到主湖區(qū)，共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)的模塊性逐漸變低，生物群落逐漸碎片化。

3 ? 討論

3.1 ? 青海湖流域原生動(dòng)物多樣性和群落結(jié)構(gòu)

本研究通過(guò)宏基因組測(cè)序，共鑒定青海湖流域176個(gè)原生動(dòng)物OTUs，隸屬于12門(mén)19綱43目61科72屬，其中占比最高的類(lèi)群為纖毛門(mén)。原生動(dòng)物多樣性存在區(qū)域差異，入湖河流>湖濱帶>子湖>主湖區(qū)，這可能與水環(huán)境營(yíng)養(yǎng)水平有關(guān)，入湖河流總氮含量最高，主湖區(qū)總磷含量最低。同時(shí)這也符合高原水生態(tài)系統(tǒng)的特性，普遍在營(yíng)養(yǎng)水平較高的生境生物多樣性相對(duì)較高（王蕓，2017；支珞昀，2020）。入湖河流中黑馬河采樣點(diǎn)位于草場(chǎng)附近，其氮磷可能來(lái)源于地表徑流輸送或其它天然源；布哈河和沙柳河采樣點(diǎn)位于城鎮(zhèn)周?chē)擎?zhèn)草場(chǎng)下游，氮磷可能來(lái)源于城鎮(zhèn)人為排入和草地系統(tǒng)的淋溶。湖濱帶是人類(lèi)活動(dòng)最多的區(qū)域，人類(lèi)放牧、農(nóng)耕及旅游等活動(dòng)帶來(lái)的各種人為干擾，可能是導(dǎo)致湖濱帶總磷濃度較高的原因。子湖是相對(duì)比較封閉的環(huán)境，總磷較高可能與物質(zhì)長(zhǎng)時(shí)間累積有關(guān)。主湖區(qū)相對(duì)其他區(qū)域，人為活動(dòng)較少，因此減少了外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸入，從而導(dǎo)致其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較為缺乏，因而使得主湖區(qū)原生動(dòng)物多樣性較低（楊建新等，2008）。

Mataza hastifera、Pseudodifflugia sp.、Protaspa longipes、Vorticella sp.、Korotnevella stella等是青海湖流域水生態(tài)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，隸屬于纖毛門(mén)、絲足蟲(chóng)門(mén)和Discosea。同時(shí)，Mesodinium sp.、Agolohymena aspidocauda、Euglena agilis、Naegleria fultoni等是青海湖流域水生態(tài)系統(tǒng)的指示種類(lèi)，隸屬于纖毛門(mén)、眼蟲(chóng)門(mén)、透色門(mén)和Imbricatea。這些優(yōu)勢(shì)和指示生物種類(lèi)可以作為4類(lèi)水體環(huán)境變化的生物指標(biāo)，將來(lái)用于監(jiān)測(cè)青海湖流域不同水體環(huán)境的水質(zhì)變化情況。

3.2 ? 青海湖流域原生動(dòng)物群落的影響因素

原生動(dòng)物在水體環(huán)境中營(yíng)浮游生活，其種類(lèi)組成、豐度以及優(yōu)勢(shì)種等群落結(jié)構(gòu)與水體環(huán)境因子密切相關(guān)。已有研究表明，溫度、鹽度、pH、營(yíng)養(yǎng)水平等多種因素會(huì)對(duì)原生動(dòng)物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響（王鑫，2014；楊漸，2015；郭飛飛等，2016）。本研究中青海湖流域的原生動(dòng)物群落受pH、溫度、鹽度、總磷、總氮多種環(huán)境因子的影響。

4類(lèi)水體原生動(dòng)物群落結(jié)構(gòu)的環(huán)境因素存在差異，入湖河流原生動(dòng)物群落受鹽度、pH、溶解性總固體、總氮含量影響較大，與前人對(duì)高原河流原生動(dòng)物的研究結(jié)果一致（楊欣蘭等，2019；安瑞志，2021）。湖濱帶、子湖原生動(dòng)物群落受溶解氧、溫度、濁度、總磷含量影響較大，主湖區(qū)原生動(dòng)物群落受pH、鹽度、溶解氧、溫度、濁度、總磷含量影響較大，與前人對(duì)高原湖泊原生動(dòng)物研究的結(jié)論一致（董云仙和王忠澤，2013；馮鐘等，2018；支珞昀，2020；楊鴻雁等，2020；胡文淵，2021）。

3.3 ? 青海湖流域原生動(dòng)物與其他浮游生物群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的影響因素

微生物群落的復(fù)雜性及相互作用在維持生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定方面起著關(guān)鍵作用（Chaffron et al，2010）。群落中的各種生物之間存在著共生、合作、競(jìng)爭(zhēng)、掠奪等互作關(guān)系，這些互作關(guān)系也決定了生物群落共存的模式（Liu et al，2019）。微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)模型可用于揭示微生物之間潛在的相互作用（Morris et al，2019），并被廣泛用于研究自然環(huán)境中微生物之間的共存關(guān)系（Proulx et al，2005）。本研究中，青海湖流域4類(lèi)水體環(huán)境原生動(dòng)物與其他浮游生物的正相關(guān)關(guān)系占主要部分，它們之間可能存在互惠互利的關(guān)系或者生態(tài)位的重疊（Hou et al，2019；石晴等，2019；張海涵等，2021）。4類(lèi)水體環(huán)境網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)差異不大，但是入湖河流網(wǎng)絡(luò)連接數(shù)和平均連通度最低，表明與湖濱帶、子湖和主湖區(qū)相比，入湖河流浮游生物間的相互作用更復(fù)雜。入湖河流和湖濱帶受到草地淋溶、地表徑流以及人類(lèi)互動(dòng)等因素的影響，營(yíng)養(yǎng)水平相對(duì)較高，生物多樣性相對(duì)較高，生物互作網(wǎng)絡(luò)也相對(duì)復(fù)雜。主湖區(qū)與其他3類(lèi)水體相比溫度較低、營(yíng)養(yǎng)水平較低，生物多樣性也較低，導(dǎo)致生物之間的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單和碎片化。因此，溫度和營(yíng)養(yǎng)水平是影響青海湖流域浮游生物互作網(wǎng)絡(luò)的重要因素。

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（責(zé)任編輯 ? 張俊友 ? 熊美華）

Protozoan Community Structure and Influencing Factors in the Qinghai Lake Basin

LIU Yu1， LUO Shuai2，3，ZHANG Peng4， WANG Xue‐yan2， XIONG Jie2， XIONG Xiong2，

WU Chen‐xi2， JIANG Chuan‐qi2， MIAO Wei2

（1. Key Laboratory of Biodiversity of Aquatic Organisms， Heilongjiang Province， Harbin Normal University，

Harbin ? 150025， P. R. China；

2. Key Laboratory of Aquatic Biodiversity and Conservation， Institute of Hydrobiology，

Chinese Academy of Sciences， Wuhan ? 430072， P. R. China；

3. College of Fisheries and Life Science， Dalian Ocean University， Dalian ? 116023， P. R. China;

4. Laboratory of Wetland and Catchments Ecology in Tibetan Plateau， Faculty of Natural Sciences，

Tibet University， Lhasa ? 850000， P. R. China）

Abstract： Protozoa are a group of single-celled eukaryotes with a wide variety of species， broad distribution， short life cycle and a keen response to environmental changes. They are an important structural and functional component of the microbial food web， and the material circulation and energy flow in aquatic ecosystems. As the largest inland saltwater lake in China， Qinghai Lake is a representative of plateau inland lakes and an important water body that is crucial for maintaining the ecological stability of the Qinghai-Tibet Plateau. In this study， we explored the community structure， species diversity and the factors influencing protozoa in four waters of the Qinghai Lake basin （inflow river， near shore， open water and sub-lake） using metagenomic sequencing and bioinformatics. In August 2020， water samples were collected at 32 sampling sites in the four waters for the determination of water environmental parameters and for metagenomic sequencing. Results are as follows： （1） A total of 176 protozoan operational taxonomic units （OTUs） were identified， belonging to 72 genera， 61 families， 43 orders， 19 classes and 12 phyla. （2） Protozoan diversity in the Qinghai Lake basin presented significant spatial differences， and the diversity of the four waters was in the order of inflow river＞near shore＞sub-lake＞open water. （3） The protozoan community was affected by pH， salinity， water temperature， total dissolved solids， turbidity， total nitrogen， and total phosphorus. （4） The co-occurring protozoan networks and other plankton in the inflow river， near shore， sub-lake and open waters gradually became less modular， and the interaction networks among taxonomic groups gradually became fragmented. In summary， high-throughput sequencing was used to conduct a comprehensive investigation of the protozoa in the Qinghai Lake basin， and the results provide a basis for assessing and monitoring the aquatic ecosystems of Qinghai Lake basin.

Key words： protozoan; metagenomic; diversity; community structure; Qinghai Lake basin