關(guān)萍　李嵐　呂秋鳳

摘 要：應(yīng)用低濃度美蘭染色液（2.0%）對原生動物進行梯度微麻醉，麻醉后的蟲體活動性減弱但伸縮泡活動狀態(tài)良好，能夠較清晰的觀察伸縮泡及收集管的交替活動，可計數(shù)活動頻率，且這種狀態(tài)的維持時間較長（約19min）。為將細(xì)胞壓制為既較薄又不破碎，實驗應(yīng)用低濃度（1%）甲基纖維素作為支撐物，結(jié)果表明，該方法操作簡單，效果較好，適用于高?；蛑袑W(xué)動物學(xué)實驗的課堂操作。

關(guān)鍵詞：原生動物；伸縮泡；收集管；美蘭染色；甲基纖維素

中圖分類號 Q95-33 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）19-0129-03

Improvement of the Observation Method of Contractile Vacuole of “Expansion of Protozoa” in Zoology Experimental Teaching

Guan Ping1 et al.

（1School of Biological Science and Technology， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China）

Abstract：Protozoa was carried out with low concentration of methylene blue staining solution （2.0%） to be gradient micro-anesthetized.The activity of the insects after anesthesia was weakened but the activity of the contractile vacuole was good.It was possible to observe the alternating activities of the contractile vacuole and the collecting tube more clearly.The activity frequency can be counted.This state is maintained for a longer period of time （about 19minutes）.To suppress the cells to be both thin and not broken， the experiment used low concentrations （1%） of methyl cellulose as a support.This method has a simple operation and is suitable for classroom operation in laboratory experiments in middle schools or colleges.

Key words：Protozoa；Contractile vacuole；Collecting canals；Methylene blue staining；Methyl cellulose

動物學(xué)實驗是高等院校普遍開設(shè)的必修課程之一，農(nóng)業(yè)院校中開設(shè)動物學(xué)實驗的專業(yè)更加廣泛，課時較多，每個實驗項目修習(xí)的內(nèi)容也更加深入。“原生動物的結(jié)構(gòu)觀察”是動物學(xué)實驗的必修科目，尾草履蟲[1]是這個實驗中最為常用的實驗材料。農(nóng)業(yè)院校畜牧獸醫(yī)、生物科學(xué)和生物技術(shù)等專業(yè)對于這個實驗項目的要求較高，除了常規(guī)的胞器（細(xì)胞核、食物泡和刺絲泡等）觀察外，伸縮泡也是必須觀察的胞器。針對該實驗，許多教學(xué)和科研人員對尾草履蟲細(xì)胞器的觀察方法進行了改進和優(yōu)化[2-3]，對細(xì)胞核、食物泡和刺絲泡等胞器均取得了較好的觀察效果[5-6]。較之上述器官，伸縮泡結(jié)構(gòu)復(fù)雜，動態(tài)活動性強，想在課堂較短時間內(nèi)得到良好的效果略有難度。因此，探尋適用于課堂教學(xué)，利于學(xué)生操作的方法進行伸縮泡的觀察，是實驗指導(dǎo)教師和理論課授課教師一直關(guān)注的問題。本文將報道一種較為有效的觀察草履蟲伸縮泡動態(tài)變化過程的簡易方法，供動物學(xué)實驗教學(xué)人員參考。

1 材料

1.1 動物材料 尾草履蟲（Paramecium caudatum）：采集于沈陽市馬官橋下，培養(yǎng)于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)實驗室，繁殖至150代左右且密度較大時用于本實驗。

1.2 試劑 石碳酸品紅溶液、美蘭染液、醋酸、戊巴比妥鈉、乙醇、生菜汁培養(yǎng)液、甲基纖維素等。

1.3 儀器和用具 恒溫培養(yǎng)箱、體式顯微鏡、顯微鏡及攝像系統(tǒng)、恒溫震蕩器、冰箱、電子天平、微量移液器、低速離心機等。培養(yǎng)皿、試管、膠頭滴管、微吸管、載玻片、蓋玻片等。

1.4 消耗性材料 槍頭、離心管、濾紙、脫脂棉等。

2 方法

2.1 尾草履蟲伸縮泡觀察時麻醉劑的添加及觀察

將梯度濃度的5種常用化學(xué)試劑分別配制為0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%等7個梯度濃度，分別加入預(yù)先放入100只尾草履蟲的厚凹片中滴加5mL，室溫放置20min后，進行存活率的檢測，每種試劑篩選出1個適宜的劑量，該適宜劑量應(yīng)為蟲體被較好的麻醉且存活率較高。在該適宜劑量的處理中吸取狀態(tài)良好的個體置于顯微鏡下進行觀察，確定伸縮泡和收集管的觀察效果。

2.2 伸縮泡簡易觀察法 吸取尾草履蟲培養(yǎng)液（蟲體密度大時效果較好）1滴于清潔的載玻片上，待液滴稍散開時，在液滴中部滴加少許用培養(yǎng)液配制成的2%美蘭染液。如較難控制滴加量時可用解剖針等蘸取少許染色液溶于培養(yǎng)液滴中部，待染色液滴稍散開但未擴散均勻時，制成草履蟲臨時裝片。

2.3 伸縮泡觀察裝片蓋片支撐物的選擇 選擇5種常用支撐物進行常規(guī)壓片，對其封片和觀察效果進行檢測，篩選出適用于觀察伸縮泡裝片制作的適宜支撐物。

3 結(jié)果與分析

3.1 5種化學(xué)試劑對尾草履蟲存活率的影響 根據(jù)方法2.1測定5種化學(xué)試劑（5個梯度）對尾草履蟲存活率的影響，其結(jié)果如表1所示。由表1可知，5種化學(xué)試劑均得到了存活率較高的濃度，分別為1.5%石碳酸品紅、2.0%的美蘭染色液、0.5%的醋酸溶液、0.25%的戊巴比妥鈉和0.5%的乙醇。

3.2 5種化學(xué)試劑適宜劑量處理尾草履蟲后觀察伸縮泡的效果 按照方法2.1篩選出適宜劑量，對適宜劑量處理的細(xì)胞進行觀察，其結(jié)果如表2所示。由表2可知，2.0%的美蘭染液、0.5%的醋酸溶液和0.5%的乙醇溶液處理后，可在鏡下觀察到伸縮泡，其中美蘭染液組的伸縮泡較為清晰，收集管可見度高，收集管活動頻率較易計數(shù)，本實驗計數(shù)為17次/min。這種狀態(tài)的維持時間為19min，對于課堂教學(xué)的觀察時間較為充裕。

3.3 觀察結(jié)果 根據(jù)方法2.2，應(yīng)用2.0%的美蘭溶液對草履蟲進行處理后，置于顯微鏡下進行觀察，觀察結(jié)果表明：在鏡下尋找處于不動狀態(tài)但并未死亡的蟲體，在細(xì)胞前后部找到伸縮泡（圖1的1～3），此時將物鏡轉(zhuǎn)為高倍進行仔細(xì)觀察，可清晰的看到伸縮泡和收集管的交替活動（圖1的4～6）。滴加染色液后待液滴未均勻時進行壓片可在小范圍內(nèi)形成1個劑量梯度，劑量大的位置蟲體被較深麻醉甚至殺死，劑量較小的位置蟲體麻醉程度小或仍可處于自由活動狀態(tài)，這2種狀態(tài)均不利于伸縮泡的觀察，但這2種狀態(tài)的中間位置可找到蟲體處于適度麻醉而胞器活動正常的個體。裝片制成片刻后，美蘭染色液即可適量滲入伸縮泡，在顯微鏡下呈現(xiàn)極淺的藍色，將視野略加調(diào)暗，觀察效果十分理想。此種方法觀察伸縮泡正?；顒訒r程較長，可達20min以上，適于實驗課堂操作。時間過久后染色液逐漸擴散均勻?qū)е律炜s泡過度膨脹，最終解體。

3.4 4種臨時裝片支撐物的使用結(jié)果 根據(jù)方法2.3選取5種蓋玻片支撐物，制作臨時裝片后，對支撐物的效果進行檢測，其結(jié)果如表1所示。由表3可知：支撐力較強的尾棉花和10%甲基纖維素；甲基纖維素的溶解速度較膠水和漿糊慢；蓋片距離的精確控制力方面僅有10%的甲基纖維素效果最好。

4 討論

原生動物為實驗教學(xué)和科學(xué)研究中常用的實驗動物，尾草履蟲作為常規(guī)實驗教學(xué)的材料具有較多優(yōu)勢：易于采集和培養(yǎng)，細(xì)胞核小核個體大，染色和觀察操作簡單等。伸縮泡是原生動物的重要胞器，行使水分調(diào)節(jié)和代謝廢物的排出等功能，為使理論課堂的知識得以鞏固，實驗教學(xué)中應(yīng)進行更詳細(xì)的觀察和講解，但伸縮泡的觀察效果一直不盡人意，尤其是實驗課堂時間短，學(xué)生操作不熟練等。伸縮泡未能得到較好觀察的主要原因如下：（1）該細(xì)胞器為膜泡狀組成，在活體中不易觀察；（2）活動的規(guī)律性較強，如用一般染料進行固定后觀察不到其動態(tài)過程；（3）位置深埋于細(xì)胞質(zhì)中。為使學(xué)生更好地掌握這個器官的特點，本實驗專門針對該問題進行了探討，尋找出一種較為適用于課堂的觀察方法，將細(xì)胞處理后處于既未死亡又不運動的麻醉狀態(tài)進行觀察，應(yīng)用美蘭染色液處理效果比較理想。該方法得以成功使用的前提是具備一定的臨時裝片制備技術(shù)，尤其是蓋玻片支撐物的選擇，10%的甲基纖維較為適用。

參考文獻

[1]李力，謝娟英.培養(yǎng)液對尾草履蟲種群增長和個體形態(tài)的影響[J].西北大學(xué)學(xué)報，2004，3：314-316.

[2]楊仙玉.教學(xué)中草履蟲活體觀察方法[J].中國科教創(chuàng)新導(dǎo)刊，2010，2：88-89.

[3]唐發(fā)輝，趙元莙，汪婷.食物泡在草履蟲體內(nèi)移行現(xiàn)象與伸縮泡頻率的相關(guān)研究分析[J].教育教學(xué)論壇，2015，8：67-68.

[4]J.Venkateswara Rao，S.K.Arepalli，V.G.Gunda，et al.Assessment of cytoskeletal damage in Paramecium caudatum：An early warning system for apoptotic studies[J].Protist，2018，6：205-219.

[5]高晶.尾草履蟲、尾柱蟲和魏氏擬尾柱蟲形態(tài)、細(xì)胞內(nèi)部及表膜下結(jié)構(gòu)的觀察[D].哈爾濱：哈爾濱師范大學(xué)，2012.

[6]楊仙玉.觀察草履蟲細(xì)胞核的兩種染色方法[J].科技創(chuàng)新導(dǎo)報，2010，3：240.

（責(zé)編：張宏民）