李鴻博　黃耀華　康定旭等

關(guān)鍵詞：橫斷山脈高山櫟；叢枝菌根真菌（AMF）；系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)建；分類(lèi)地位

中圖分類(lèi)號(hào)：Q945.31 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-1498（2023）01-0079-12

菌根是建立于植物根系和土壤菌根真菌之間的古老共生體系，在自然界中存在已有4億年之久，有研究統(tǒng)計(jì)，地球上大約86%的陸生被子植物能夠與真菌互作形成菌根共生體。叢枝菌根真菌（AMF）作為植物根系所在土壤環(huán)境中微生物群落的重要組成者之一，在個(gè)體層面可以促進(jìn)植物對(duì)K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺離子的有效吸收，幫助植物抵御逆境中來(lái)自生物或非生物的脅迫，宏觀群落層面則能夠優(yōu)化植被分布，森林中地下的龐大菌根系統(tǒng)能夠?qū)⒘帜緜€(gè)體有機(jī)相連而形成一個(gè)物質(zhì)資源共享體，加速種群建成并形成植物優(yōu)勢(shì)種，從而改變生態(tài)格局，可以說(shuō)，菌根真菌和植物共生，是維護(hù)森林生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定及發(fā)展的基礎(chǔ)。

高山櫟（Quercus spp.）作為一類(lèi)廣泛分布在我國(guó)西部川、滇、藏地區(qū)的常綠硬葉櫟類(lèi)植物，是橫斷山脈地區(qū)重要的野生植被群落優(yōu)勢(shì)種，多以成規(guī)模的林地出現(xiàn)或以離散點(diǎn)狀方式與其他喬木混生生長(zhǎng)于海拔1800～4800 m的地區(qū)，其熱值高、生長(zhǎng)速度快及萌蘗更新能力強(qiáng)的特點(diǎn)對(duì)該地區(qū)生態(tài)環(huán)境保持具有重要意義。當(dāng)前，外界公認(rèn)松科植物共生菌根類(lèi)型為外生菌根已毋庸置疑，而櫟屬植物存在外生菌根共生現(xiàn)象的同時(shí)，是否能與內(nèi)生菌根真菌共生尚鮮有報(bào)道。楊淑嬌等對(duì)云南香格里拉高山櫟和高山松（Pinus densata Mast.）的林下菌塘微生物分布研究發(fā)現(xiàn)，高山櫟林下菌塘有大量AMF存在，且高山櫟林下菌塘中真菌和AMF生物量顯著高于高山松，但AMF種類(lèi)豐度只有1種，綜合高山櫟和高山松林型下菌塘的多種微生物比較認(rèn)為，菌塘中的微生物類(lèi)型是其菌落結(jié)構(gòu)組成的重要影響因素，林型則未影響林下微生物群落特征構(gòu)成。該研究說(shuō)明在錯(cuò)綜復(fù)雜的地下根系網(wǎng)絡(luò)中，不同類(lèi)型土壤微生物之間的相互聯(lián)系往往對(duì)宿主植物林下菌群結(jié)構(gòu)和分布具有重要影響。張中峰將摩西球囊霉（Glomus mosseae （Nicol.＆Gerd.）Gerd.&Trapp）和根內(nèi)球囊霉（Glomus intraradices Schenck&Smith）接種至青岡櫟（Quercus glauca （Thunberg） Oersted）幼苗發(fā)現(xiàn)，AMF能夠顯著促進(jìn)青岡櫟幼苗葉面積和生物量增長(zhǎng)，提升幼苗成活率，該結(jié)果表明，在人為干擾措施下，櫟屬植物能夠與AMF形成互惠共生關(guān)系?；谏鲜銮叭搜芯坎浑y推測(cè)，AMF與高山櫟組植物間應(yīng)當(dāng)存在相應(yīng)的聯(lián)系。這種聯(lián)系是否具有廣泛性和普遍性？同為被子植物門(mén)下的櫟屬植物高山櫟根系在非人為干擾的野生生境中，其根際及根系是否同AMF共生等問(wèn)題值得深入探究。基于此，本研究假設(shè)橫斷山脈亞高山地區(qū)高山櫟林下同樣具有AMF分布，并且在自然條件下高山櫟植物根系存在AMF。分三步驗(yàn)證上述假設(shè)：第一，利用濕篩沉淀法對(duì)采自橫斷山脈不同地區(qū)高山櫟林下土壤樣本進(jìn)行孢子濕篩，利用形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)結(jié)合的手段對(duì)其種類(lèi)進(jìn)行鑒定。第二，利用分子克隆方法選取針對(duì)AMF 18S rRNA gene的特異引物對(duì)高山櫟外根際潛在的AMF進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序檢驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果中是否存在AMF。第三，利用染色觀察的方法觀察高山櫟根系樣本內(nèi)是否存在典型的AMF叢枝、泡囊結(jié)構(gòu)，結(jié)合對(duì)比單孢提取與克隆擴(kuò)增結(jié)果，以期明確橫斷山脈亞高山帶自然環(huán)境中生長(zhǎng)的高山櫟林下根圍、根際AMF種類(lèi)，揭示橫斷山脈亞高山高山櫟林下AMF的演化方向。

1采樣地與材料

1.1采樣地概況

橫斷山脈作為世界年輕的山脈群之一，縱跨川、滇二省西部及西藏東部，山嶺曲折蜿蜒，谷高差懸殊，植被分布以海拔梯度差異明顯，受高空西風(fēng)環(huán)流、印度洋及太平洋季風(fēng)環(huán)流影響，氣候主要分為干濕兩季，降水多集中于5—10月，但因地形地勢(shì)復(fù)雜，地域遼闊，年均氣溫13.6℃，年降水量942.6 mm，部分地區(qū)降雨差異較明顯。由于該地區(qū)地勢(shì)陡峭，降雨所致的水土流失成為潛在威脅。

1.2樣品采集

于2020年7月、10月和2021年8月分別前往位于28°45′3″～30°59′35″N，97°40′25″～102°50′18″E（四川、西藏等地）以及99°11′46″E、28°11′51″N（云南香格里拉）地段，橫斷山脈亞高山帶的不同海拔（2340～3630 m）地區(qū)（表1）陽(yáng)坡地段高山櫟天然林，各高山櫟林均為喬木或灌木純林，林下無(wú)其他植被。采集其根部10～30 cm處的土壤混合裝入9號(hào)自封袋，沿主根對(duì)高山櫟根系進(jìn)行挖掘，找到高山櫟根系側(cè)根、須根等與根際土裝入自封袋，放入含冰袋的保溫箱隔離貯存，標(biāo)記并編號(hào)，帶回實(shí)驗(yàn)室將根系于-80℃保存，土壤平鋪風(fēng)干置于塑封袋用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2試驗(yàn)方法

2.1高山櫟根系土壤AMF濕篩與鑒定

2.1.1高山櫟根部土壤AMF孢子篩取 將高山櫟根部土壤過(guò)40目篩后，精確稱(chēng)量20 g土壤，倒入玻璃燒杯，加500 mL超純水浸泡12 h后，利用濕篩沉淀法過(guò)4目（100目165μm、140目105μm、200目74μm、300目50μm）篩出并將每一目篩出的孢子及細(xì)土倒入容積為1L的燒杯靜置，靜置15min后倒300 mL入封液漏斗，后向燒杯內(nèi)加水至500 mL。靜置15 min后向漏斗中填200 mLddH₂O，此步驟重復(fù)3次。后靜置15min并棄漏斗廢液300 mL。將每一目篩孢子用的封液漏斗置于鐵架臺(tái)，使用抽濾機(jī)（Rocker 600）將孢子抽濾至實(shí)驗(yàn)前預(yù)備好的畫(huà)有方格的濾紙上，編號(hào)標(biāo)記并放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2孢子形態(tài)學(xué)鑒定與孢子密度統(tǒng)計(jì) 在體式鏡（LAICA SE6）下從培養(yǎng)皿中的濾紙上挑出形態(tài)、顏色等不同的孢子，單個(gè)置于滴加ddH₂O的載玻片上在光學(xué)顯微鏡（LEICA MC170）下觀察并拍照，記錄孢子顏色、大小，輕輕將其壓破，觀察孢壁顏色、類(lèi)型、厚度、層數(shù)及內(nèi)含物特征等，載玻片上還可加入Melzer's染液觀察是否存在顯色反應(yīng)，并拍照保存。同時(shí)，每拍攝一個(gè)孢子將與其形態(tài)相同的孢子挑至1.5mL的離心管內(nèi)-20℃冰凍保存，以便做分子鑒定時(shí)一一對(duì)應(yīng)。參照《VA菌根真菌鑒定手冊(cè)》（1988）和http：//invam.caf.wvu.edu網(wǎng)址上的圖片對(duì)照及近年來(lái)所發(fā)表的研究文獻(xiàn)成果，進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

在體式鏡下統(tǒng)計(jì)每個(gè)土樣下的孢子數(shù)目，并計(jì)算出孢子密度，每個(gè)土樣4次重復(fù)。

孢子密度（SD）：指每克土樣中叢枝菌根真菌的孢子個(gè)數(shù)。

SD=某土樣中AMF所有孢子數(shù)／土壤干質(zhì)量。

2.1.3孢子的分子生物學(xué)鑒定 利用Chelex-100提取單孢DNA，向裝有孢子的離心管中加入600μLddH₂O，置入超聲波震蕩洗滌儀器（30Hz）震蕩3min，挑出孢子轉(zhuǎn)移至新的離心管，重復(fù)上述步驟以清洗孢子表面存在的雜質(zhì)。將清洗后的單孢轉(zhuǎn)移至新的離心管中（1.5 mL），加入30μL TE buffer，置于盛有液氮的保溫瓶速凍，取已滅菌的研磨棒在體式顯微鏡下將孢子研碎。加入15μL 20% Chelex-100后置于金屬恒溫水浴鍋98℃裂解10 min，放入-20℃冰箱冰浴5 min后取出，置于離心機(jī)（Eppendorf Centrifuge 5417R）12000r·min^-1離心10 min，所得上清液即為用于擴(kuò)增的孢子的DNA模板。

參照《菌根學(xué)》中的擴(kuò)增辦法，對(duì)孢子DNA模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。第一輪擴(kuò)增上下游引物為GeoLl（5'-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3），GeoA2 （5-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3'）反應(yīng)體系為50μL（ddH₂O 20μL，Taq PCRMaster Mix 25μL，

GeoL1 1.5μL，

GeoA2 1.5μL，DNA 2μL）。94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30s，54℃退火1min，72℃延伸2 min，其中變性、退火、延伸進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，后72℃延伸10 min。將擴(kuò)增后的PCR原液稀釋10～20倍作為第二輪DNA擴(kuò)增模板，第二輪PCR上下游引物為AM1（5'-GTTTCCCGTAAGGCGCCGAA-3'）和NS31-GC（5'-TTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3'）94℃預(yù)變性2 min，94℃變性45s，55℃退火1min，72℃延伸45s，其中變陛、退火、延伸進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，后72℃延伸7 min，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳（110V，25min）經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)（Molecular Imager GEL Doc TM XR）檢測(cè)，觀察結(jié)果，拍照并記錄。將條帶清晰的產(chǎn)物送擎科生物公司（TSINGKE昆明）測(cè)序分析。

2.2高山櫟根際潛在的AMF鑒定

2.2.1高山櫟根際AMF分子克隆 為證明高山櫟根系內(nèi)外根際存在AMF，取-80℃冷凍保存的西藏、四川（GSL1-a，GSL4-a）以及香格里拉地區(qū)的高山櫟根系（G）樣本，置于流水下沖洗根系表面后，分別剪成1cm長(zhǎng)的小段放入1.5 mL的離心管中，加入75%的酒精后劇烈震蕩30 s，將根系取出至ddH₂O下沖洗，后放入已滅菌的研缽加液氮速凍并研磨至粉末狀。利用試劑盒（EZUP柱式植物基因組DNA抽提試劑盒，SANGONG），嚴(yán)格按照盒內(nèi)使用說(shuō)明書(shū)的操作步驟提取高山櫟根系總DNA，使用AMF的特異上下游引物AML1，AML2對(duì)高山櫟內(nèi)外根際潛在的AM真菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50μL（ddH₂O 24.8μL，TaqPCRMasterMix16.2μL， AML1、AML2各2.5μL，DNA 4μL）。步驟為94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30s，54℃復(fù)性1min，72℃退火2 min，其中變性、復(fù)性、退火進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，后72℃延伸10 min。之后經(jīng)凝膠電泳（同2.1.3）檢測(cè)后，利用PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒，純化回收產(chǎn)物，使用克隆試劑盒（零背景TOPO-TA克隆試劑盒）嚴(yán)格按照使用說(shuō)明將回收的DNA插入質(zhì)粒載體。于37℃在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1h（將液體培養(yǎng)基放入搖床180～200 rpm震蕩培養(yǎng)）。培養(yǎng)完成后在超凈工作臺(tái)下取200μL菌液涂布于提前加入氨芐青霉素（AMP）的LB固體培養(yǎng)基上，待培養(yǎng)基吸收后封存，37℃恒溫培養(yǎng)12～16h。

在超凈工作臺(tái)下將培養(yǎng)好的菌落用無(wú)菌的移液器吸頭（量程為20μL）挑人提前加裝10μL ddH₂O的PCR管并抽吸混勻，利用AML1和AML2引物對(duì)DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50μL（ddH₂O22.8μL， Taq PCR Master Mix 20.2μL， AML1、AML2各2.5μL，DNA2μL）。94℃預(yù)變性2min，94℃變性45s，65℃復(fù)性1 min，72℃退火45 min，其中變性、復(fù)性、退火進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，后72℃延伸10 min。經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后將擴(kuò)增結(jié)果良好的樣本送至測(cè)序公司（SanGong昆明）測(cè)序。

2.2.2高山櫟根系A(chǔ)MF染色觀察 分別將2次采集的根系須根樣本剪成0.5～1 cm的小段，置入盛有10% KOH溶液的試管于水浴鍋90℃脫色處理，直至根系顏色變淡，用蒸餾水反復(fù)沖洗后加入0.5%的苯胺藍(lán)染液繼續(xù)90℃染色1 h，重復(fù)沖洗步驟用3%乳酸、甘油脫色2～3 d至半透明后，置于顯微鏡下觀察根系內(nèi)的AMF泡囊叢枝結(jié)構(gòu)。

2.3數(shù)據(jù)處理

利用Chromas2.22、觀察序列峰圖、DNAman 8剪貼與拼接序列。將序列提交至NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)并下載同源序列。使用Mega X多序列比對(duì)并篩選建樹(shù)模型，選擇參數(shù)值最高的推薦模型，利用最大似然法1000次迭代循環(huán)檢驗(yàn)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

運(yùn)用EXCEL2016統(tǒng)計(jì)孢子密度數(shù)據(jù)及擴(kuò)增樣本序列比對(duì)數(shù)據(jù)。

3結(jié)果與分析

3.1幾種高山櫟土壤AMF孢子形態(tài)及土壤孢子密度特征

對(duì)高山櫟根部10～30cm土壤的篩取結(jié)果表明：各高山櫟樣地下均有大量AMF孢子存在，孢子直徑為50～220μm，形狀以球形、近球形為主。顏色多以黑色和深棕色出現(xiàn)，偶見(jiàn)棕黃或深棕紅，其中，部分孢子呈黑色，該類(lèi)孢子在顯微鏡下壓裂未見(jiàn)明顯孢壁層數(shù)，部分孢子有分泌物滲出（表2，圖1）。目前，經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察的孢子均未見(jiàn)Melzer's染液染色反應(yīng)。5種高山櫟根系土壤樣本中孢子密度分別為GSL2（205.49）>GSL4（178.90）>GSL1（88.39）>GSL3（43.84）>GSL5（16.16）個(gè)·g^-1，不同高山櫟土壤樣本具有明顯差異，且呈喬木高山櫟大于灌木的趨勢(shì)（圖2），其中，GSL3為灌木但表現(xiàn)出孢子密度相對(duì)較低的特征。各樣本孢子100目下（直徑>165μm）以黑色硬質(zhì)孢子為主，多數(shù)孢子密集分布于300目篩（50～74μm）內(nèi)，呈深棕色。

3.2結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段對(duì)高山櫟林下菌塘AMF孢子及根系A(chǔ)MF克隆的鑒定

對(duì)西藏、四川各高山櫟根圍土壤中的AMF分子鑒定結(jié)果表明：橫斷山脈不同海拔地區(qū)采集的高山櫟土壤AMF均與類(lèi)球囊霉科（Paraglomeraceae）類(lèi)球囊霉屬（Paraglomus）具有較近的親緣關(guān)系（表3）。經(jīng)西弗吉尼亞大學(xué)孢子比對(duì)網(wǎng)站（occultum｜Davis-INVAM｜West Virginia University （wvu.edu））比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Paraglomus屬下目前收錄的菌種僅有巴西類(lèi)球囊霉（Paraglomus brasilianum（Spain&J.Miranda）J.B.Morton＆D.Redecker）和隱類(lèi)球囊霉（Paraglomus occultum （C.Walker）J.B. Morton&D.Redecker），但這2種AM孢子在顏色、質(zhì)地、孢壁層數(shù)與Melzer's染液反應(yīng)效果與目標(biāo)菌種均明顯不同。利用Mycobank檢索AMF Paraglomus屬，選取Gosling等和Mello等發(fā)表的AMF Paraglomus屬的幾種序列以及MAARJAM （ut.ee）中與本研究孢子相似度高于90%（相似度為90.9%～99.2%）的序列對(duì)幾種高山櫟林下AMF孢子進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建。結(jié)果表明：明確到種的Paraglomus序列聚為一支，MAARJAM （ut.ee）中ParaglomeraceaeParaglomus sp.屬序列與樣本GSL2-014聚為一支（圖3），其余所有孢子與根系A(chǔ)MF克隆樣本能夠單獨(dú)聚為一支，其中，同源序列相似度高于97%的個(gè)體極有可能為類(lèi)球囊霉屬內(nèi)某種真菌。

3.3云南香格里拉高山櫟根際AMF孢子和根系A(chǔ)MF的分子克隆

利用AMF特異引物AML1、AML2對(duì)香格里拉地區(qū)的高山櫟根系潛在AMF的ITS片段DNA克隆，結(jié)果表明：經(jīng)75%濃度酒精對(duì)高山櫟根系表面消毒30s后，其根系表面仍存在AMF的DNA。通過(guò)MAARJAM （ut.ee）網(wǎng)站比對(duì)發(fā)現(xiàn)，存在真菌普遍與球囊霉屬Glomus在Genbank中的標(biāo)準(zhǔn)序列相似度較高，部分目標(biāo)菌種序列與Genbank中的序列對(duì)比有相似度較高的類(lèi)球囊霉屬Paraglomus序列存在（表4），但其在覆蓋度（Query coverage）或最大識(shí)別度（Max identity）2個(gè)指標(biāo)并非最高。利用Bio-edit軟件檢驗(yàn)克隆所得目標(biāo)AM菌種同源性，發(fā)現(xiàn)17個(gè)菌種均為同一菌株，故選擇G1為代表，與該樣本下AMF孢子序列（GA、GB）一同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生演化樹(shù)（圖4），分析表明：目標(biāo)菌種樣品G1、GA和GB與Glomus versiforme（Y17651.1）聚為一支，說(shuō)明其親緣關(guān)系與該屬較近，置信度可達(dá)98%，推測(cè)高山櫟能夠和與Glomus versiforme同源性較高的AMF形成共生關(guān)系，且其與林下菌塘孢子類(lèi)似，二者均未能鑒定到種。說(shuō)明能夠與香格里拉地區(qū)高山櫟根系共存的AMF極可能為球囊霉屬和類(lèi)球囊霉屬，或與其并列的某一新屬真菌。

3.4幾種高山櫟根系A(chǔ)MF泡囊叢枝結(jié)構(gòu)觀察

幾種高山櫟根系苯胺藍(lán)染色結(jié)果表明：100～200倍放大時(shí)可見(jiàn)明顯的類(lèi)泡囊和叢枝結(jié)構(gòu)，此類(lèi)結(jié)構(gòu)在高山櫟根系內(nèi)主要呈圓形或近圓形（圖5a、b），部分呈橢圓形，部分泡囊分布密集，并伴隨“向無(wú)規(guī)則方向伸展”的橫向菌絲結(jié)構(gòu)，推測(cè)其為高山櫟根系于AMF共生所形成的泡囊和叢枝。

4討論

4.1高山櫟根圍土AMF的驗(yàn)證

自然界中能夠獨(dú)立生存的生物少之又少，幾乎所有生物之間普遍存在共生關(guān)系。AM作為一種重要的功能型土壤微生物，其與宿主植物間形成的共生體系能夠使宿主植物在群落構(gòu)成及其對(duì)外界生境在生態(tài)適應(yīng)性層面產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。調(diào)查野生生境中的AMF不僅能夠擴(kuò)充AMF菌種資源庫(kù)，有利于發(fā)掘AMF在不同宿主植物根系下的群落構(gòu)成及多樣性，且在探究其對(duì)于生態(tài)系統(tǒng)平衡穩(wěn)定的可持續(xù)發(fā)展層面具重要意義。

橫斷山脈一直以來(lái)是生物多樣性研究的熱點(diǎn)地區(qū)，不少學(xué)者研究認(rèn)為，4000～5000萬(wàn)年前印度次大陸與歐亞板塊碰撞導(dǎo)致的青藏高原隆起，隨后該地區(qū)可能成為東亞北溫帶植物的避難所。楊欽周認(rèn)為，橫斷山脈縱向深切及垂直氣候帶的明顯分布促使硬葉櫟類(lèi)古老櫟群的殘遺保留和新生類(lèi)群的分化形成。因此，選擇古老的高山櫟組植物對(duì)其根系潛在的AMF進(jìn)行研究，從演化發(fā)育的角度能夠更有助于理解并揭示該地區(qū)AMF的起源、營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型、生活方式及分類(lèi)問(wèn)題。

本研究利用濕篩沉淀法從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)合的視角證實(shí)高山櫟林下菌塘中存在AMF真菌孢子，這與楊淑嬌等基于磷脂脂肪酸（RLFP）方法研究香格里拉高山櫟林下菌塘微生物的結(jié)果一致，驗(yàn)證了AMF在野生條件下能夠廣泛存在于橫斷山脈亞高山地區(qū)高山櫟林下的假設(shè)。西藏、四川等地各土壤樣本中的孢子18S rRNA gene分子證據(jù)表明，所有孢子均與類(lèi)球囊霉屬Paraglomus的親緣關(guān)系較接近，通過(guò)將各孢子的形態(tài)學(xué)特征與已證實(shí)或發(fā)表的孢子形態(tài)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，其在顏色、質(zhì)地、孢壁層數(shù)和Melzer's染液反應(yīng)效果等方面均與目前已知的巴西類(lèi)球囊霉、隱類(lèi)球囊霉及其他幾種該屬下發(fā)表的新種具有明顯差異，故認(rèn)為該地區(qū)高山櫟林下AMF很有可能為類(lèi)球囊霉屬下的未知種。由于其所處地理位置植被分布的古老與獨(dú)特性，結(jié)合18S rRNA gene序列相似度比對(duì)分析認(rèn)為，其或在漫長(zhǎng)演化進(jìn)程中在Glomeraceae和Paraglomeraceae科便已出現(xiàn)分化。基于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）對(duì)橫斷山北部西藏四川等地區(qū)孢子的演化進(jìn)行推測(cè)，GSL2-14的演化介于Paraglomus和Archeaspora之間，而GSL1-001、2-008、3-007、4-003等則獨(dú)立分為一支，與前者呈并列關(guān)系，這與前人基于真菌分類(lèi)學(xué)為“科”級(jí)別將Paraglomus和Archeaspora從Glomus中分離出去的分類(lèi)學(xué)定位相吻合。

4.2高山櫟根系A(chǔ)MF擴(kuò)增結(jié)果的提示

由于目前AMF分子研究技術(shù)仍舊有一定的局限性，即缺乏一套通用的既能擴(kuò)增所有AM家族，又能排除非AM真菌的引物。因此，為保證克隆質(zhì)量，選擇AML1和AML2作為引物擴(kuò)增高山櫟根系（樣本GSL1-a、GSL4-a、G）AMF的18srRNA基因，發(fā)現(xiàn)與四川、西藏等地高山櫟克隆菌株相似度較高的AMF均為類(lèi)球囊霉屬Paraglomus，與香格里拉地區(qū)高山櫟克隆菌株相似度較高的AMF則均為球囊霉屬Glomus。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建結(jié)果表明：Glomus versiforme與后者AMF同源性極高（圖4），西藏、四川與香格里拉等地高山櫟根系A(chǔ)MF結(jié)果存在一定差異。這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是AMF在長(zhǎng)期演化過(guò)程中隨地域環(huán)境變化（從西藏、四川到云南）和不同高山櫟種（表1）而逐漸發(fā)生分化。同時(shí)，本研究克隆結(jié)果與張中峰等將摩西球囊霉和根內(nèi)球囊霉接種至青岡櫟幼苗的結(jié)果類(lèi)似，說(shuō)明櫟屬植物在非人為干擾的野生環(huán)境下根系也存在AMF。第二，PCR擴(kuò)增過(guò)程中由于DNA模板中存在殘留的酚類(lèi)及腐殖酸等，此類(lèi)物質(zhì)難以去除并會(huì)對(duì)DNA擴(kuò)增造成一定影響。引物不同，擴(kuò)增過(guò)程中的靶向序列堿基對(duì)存在差異，并且擴(kuò)增時(shí)堿基錯(cuò)配的概率也可能呈倍放大，從而造成序列比對(duì)時(shí)發(fā)生單孢提取與分子克隆出現(xiàn)結(jié)果上的差異。此外，高山櫟根系、土壤樣本均分別僅有一種AMF出現(xiàn)，可能提示不同高山櫟同時(shí)僅與一種AMF在內(nèi)外根際范圍產(chǎn)生聯(lián)系。有研究表明，碳源和植物內(nèi)源激素能夠?qū)M產(chǎn)孢能力產(chǎn)生重要影響，二者條件豐富的情況下孢子萌發(fā)率較高。同理，高山櫟生長(zhǎng)在半陽(yáng)坡地區(qū)，當(dāng)?shù)貧夂颉⒑０渭八疅釛l件使得土壤生境中的碳源及高山櫟宿主植物內(nèi)源激素發(fā)生變化，進(jìn)而一定程度干擾AMF產(chǎn)孢，而Paraglomus和Glomus在高山櫟根際微生物的生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)過(guò)程中占據(jù)了相對(duì)優(yōu)勢(shì)地位，以此來(lái)確保自身所需碳源的充分供給。

綜合橫斷山脈亞高山帶幾種高山櫟林下菌塘AMF孢子調(diào)查及其根際AMF的克隆結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高山櫟組植物作為典型的被子植物，在與外生菌根真菌發(fā)生共生現(xiàn)象的同時(shí)，極有可能在自然環(huán)境中保留了與AMF存在共生的現(xiàn)象。在喜馬拉雅造山運(yùn)動(dòng)后，橫斷山區(qū)長(zhǎng)時(shí)間與外界環(huán)境隔離，土壤微生物在漫長(zhǎng)的演化進(jìn)程中由于地理環(huán)境的相對(duì)封閉而發(fā)生分化，最終形成了現(xiàn)有存在的AMF孢子，而該類(lèi)孢子隨區(qū)域（從西藏、川西到云南）變化顯示出一定的演化差異，具體體現(xiàn)在其形態(tài)及分子學(xué)方面的不同。因此，在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系的構(gòu)樹(shù)結(jié)果中，該類(lèi)孢子以單獨(dú)匯聚為一支呈現(xiàn)。

5結(jié)論

本研究利用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)的手段證明，自然條件下橫斷山脈亞高山地區(qū)高山櫟林下菌塘普遍存在AMF，利用分子克隆手段發(fā)現(xiàn)AMF可分布于高山櫟植物根系，且發(fā)現(xiàn)西藏、四川等地該類(lèi)孢子在形態(tài)上與已知AMF屬種存在較大差異，極有可能為Paraglomus屬下的新種。同時(shí)，云南香格里拉地區(qū)高山櫟根系A(chǔ)M與Glomus屬更接近，說(shuō)明AM在長(zhǎng)期演化過(guò)程中隨地域遷移出現(xiàn)分化。本研究結(jié)果為揭示AMF對(duì)橫斷山脈亞高山帶高山櫟生態(tài)適應(yīng)性機(jī)制的影響提供新的證據(jù)，為進(jìn)一步了解橫斷山脈亞高山帶高山櫟林下AMF的形成與演化提供理論參考。